パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

要約

固定、パラフィン包埋、および微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面技法について述べる。作製した試料では、顕微鏡によるバイオ フィルムの基礎部分やレポーターの発現パターンを視覚化できます。

要約

真核生物において広く確立された技術は、パラフィン包埋による区分します。ここでの埋め込み・灌流のパラフィン ワックスを使用してそのまま微生物コロニー バイオ フィルムの断面、固定法を実施します。コロニー バイオ フィルムで使用するためこのメソッドを適応し、我々 はその成長基板の各サンプルを維持すると、寒天オーバーレイヤーのラミネート技術を開発し、固定液にリジンを追加しました。これらの最適化は、微細形態機能のサンプルの保存/保護を向上させます。この方法で作製した試料は、薄膜の断面と光、蛍光、および透過電子顕微鏡によるイメージングに適しています。緑膿菌 synxantha 菌、枯草菌、コレラ菌のコロニー バイオ フィルムにこの手法を用いています。ディテールはこのメソッドによって生成されるサンプルでの高レベル レポーターひずみと組み合わせて工学または特定の染料の使用は生理学と微生物の開発にエキサイティングな洞察力を提供することができます。

概要

ほとんど微生物バイオ フィルム フォームする能力があります、セルのコミュニティは、セルフ プロデュースの行列で一緒に開催。バイオ フィルムは、栄養素と基板の提供の様々 な体制で物理的なセットアップの多くの種類で栽培できます。再現可能な多細胞構造を生成する傾向がある特定のアッセイのバイオ フィルム形成とコミュニティまたは巨視的レベルで系統発生的に多様な種のための一般的なアーキテクチャが観察されます。微生物は雰囲気下で固体媒体の植民地で栽培される、肉眼形態はマトリックス生産能力についての情報を伝えるし、他の特徴^1,2,3とよく相関します。微生物コロニーの内部アーキテクチャは、バイオ フィルムに固有の化学および生理学に関する手がかりを提供することもが特徴付けることは困難されています。細菌のコロニーに cryoembedding、セクショニングの技術の最近のアプリケーションは、画像と前例のない解像度^4,5,6で特定の機能の可視化に有効にしています。しかし、動物組織を用いた研究は、パラフィン包埋 cryoembedding ⁷と比較されたとき形態の優れた保存を提供し、組織^8,9の細菌を視覚化するために使用されていることを示しています。したがって、固定、パラフィン包埋、微生物コロニー バイオ フィルムの薄切片法にプロトコルを開発しました。ここでは、緑膿菌PA14 コロニー バイオ フィルム中薄いセクション^10,11, の作製について述べるが、の細菌によって形成されるバイオ フィルムにこの手法を行ったも正常にSynxantha 緑膿菌、枯草菌、とコレラ¹²。

パラフィン包埋、薄切片のバイオ フィルムの簡単な論理は次のとおりです。まず、バイオ フィルムは処理の間に形態を維持する寒天の層に包まれています。第二に、包まれてバイオ架橋高分子に定着剤に沈んでいるし、形態を維持します。アルコールで脱水しより非極性溶媒でクリアし、し、液体のパラフィン ワックスを浸透させた。潜入、一度サンプルは区分のためのワックスのブロックに埋め込まれています。セクションは、カット、スライド、マウントより本来の状態に戻すために復元します。この時点から、染色したり顕微鏡分析のためのメディアをマウントで覆われています。

このプロトコルには、組織学的解析に適した微生物バイオ フィルムの薄い部分が生成されます。コロニー バイオ フィルムの部分は、このメソッドを使用して薄い切片を光学顕微鏡検査によってイメージが表示されます。バイオ フィルムの個々 の機能のために特定のメディア含む蛍光汚れに成長してまたは退避手順の (ステップ 9.5 9.6) をマウントする前にすぐに染色もできます。最後に、その場でこれらのコミュニティ内での細胞分布や遺伝子発現の報告を許可する構成または規制的に蛍光蛋白質を生成する微生物を設計することができます。コロニー バイオ フィルム深度、セル分布、マトリックス分布、成長パターン、時空間の遺伝子発現を決定するこれらのメソッドを使いました。

プロトコル

1. 緑膿菌コロニー バイオ フィルムの成長

1. 中二層プレートの準備
   1. トリプトン 10 g/L、寒天 10 g/L を準備脱イオン水 (材料の表を参照) ソリューション。
   2. 水浴中で 20 分 50-60 ° C に涼しいオートクレーブ。
   3. トリプトン寒天培地溶液 45 mL を注ぎ 100 mm × 100 mm 角皿 (材料の表を参照してください) 50 mL コニカル チューブを使用します。寒天を固めるための許可 (20 ~ 30 分)。最初の層の上に 2 番目、15 mL の層を注ぐ。一晩固化させるは、糸くずのティッシュで拭くことによって必要に応じて蓋から結露を除去します。
2. バイオ フィルムのコロニー スポッティング
   1. LB 寒天培地プレート¹³に冷凍庫株から関心の系統を連勝し、37 ° C、80-100% の相対湿度で 12-16 時間暗闇の中で孵化させなさい。
   2. 各ひずみまたは複製、LB の 2 mL を接種して 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 12-16 h のため暗闇の中でインキュベートする単一コロニーを使用します。
   3. 新鮮な LB と 250 rpm で振とうしながら 37 ° C で 2.5-3 時間暗闇の中でインキュベートに 1: 100 希釈することによってサブカルチャーします。
   4. 分光光度計を使用して光の密度を測定し、OD に細胞懸濁液を達成するために無菌の LB で調整_{500 nm} ~ 0.5。
   5. 目的のコロニーによってサイズ、(1.1 の手順で準備) 中二層板に細胞懸濁液のピペットで移しなさい 2.5-10 μ L とペトリふたを半開き直火の近く残して 〜 20 分が乾燥を促進するために乾燥するスポットを許可します。
   6. 25 ° C と 80-100% の相対湿度、最大 4 日間の暗闇の中で植民地に斑点を孵化させなさい。

2. 固定液の作製

1. サンプルの収穫の日に固定液を準備します。37% ホルムアルデヒド (FA) を 4% の最終的な集中に 1x PBS で希釈 FA。
   注意: FA は揮発性、有毒です。保護具を着用し、換気発煙のフードで働きます。
2. 使用直前に溶解 4 %l-リジン塩酸塩 50 mM L リジン塩酸の最終的な集中に室温で FA (ステップ 2.1 の準備)。

3. [オプション] コロニー バイオ フィルムの中に定着剤のアプリケーションを直接します。

注: 我々 はバイオ フィルム形態最高固定前に寒天オーバーレイを追加するとき、保持されることを発見しました。ただし、この手順は、遺伝子発現に影響を及ぼす環境の変化も構成します。蛍光レポーターの発現パターンは、前述のように固定ステップは寒天で、オーバーレイの追加前に実施するため、別々 のプロトコルを使用してしたがって検証すべき。

1. 固定および換気のヒューム フードでの作業の日、植民地の端、それを沈めることがなくコロニーの周囲に到達することができます周りの寒天培地の表面に直接手順 2 で準備定着剤をピペットします。多くの定着剤は完全に必要に応じてサラウンド植民地として約 500 μ L。 許可植民地および周囲の寒天に拡散して定着剤だけに適用されます。
2. 定着剤は植民地と周辺メディア、約 20-30 分に完全に吸収されているし、残留 FA は、プレートに表示されなくなります、3.1 の手順を繰り返します。植民地および周囲の寒天に拡散してこの定着剤を許可します。
3. 定着剤は完全に植民地に吸収されているし、周囲メディア手順 3.1 では、この時間を直接植民地の表面に定着剤を適用します。植民地および周囲の寒天に拡散してこの定着剤を許可するに進むステップ 4 だけ結局定着性吸収されているし、は、プレートに表示されなくなります。

4. オーバーレイする植民地寒天培地

1. 固定の日、脱イオン水と溶解する 10 〜 20 分間のオートクレーブで寒天液 10 g/L を準備します。50 ° C の水浴でクールします。
2. 優しく成長培地や植民地を寒天溶液 15 mL を注ぐ。5 分 (図 1 b) 室温でゲルを形成する寒天を許可します。
3. 上の 2 つの層の間に積層コロニー広場では、3 層のチャックをカットするのに鋭いかみそりの刃を使用します。各チャックは、複数のサンプルを準備する場合は、同等のサイズにカットされます。
4. 優しくコロニー含むチャックから余分な寒天を削除します。
5. チャック (図 1) の下層から寒天培地 (植民地含む) の 2 つの上位層を持ち上げる、1 × PBS または水でヘラのフラット ヘッドを濡れている、優しく上部と下部層の間に挿入します。積層の植民地は下部層から分離する必要があります。根元から持ち上げるとき積層コロニーを歪める曲げたりしないように注意します。

5. 固定

1. すぐに埋め込みカセットに積層の植民地 (すなわち、2 層チャック) を転送換気ドラフトでの作業 (材料の表を参照) の付いた耐薬品性マーキングペン。ガラス スライド メーラーに埋め込みカセットを配置 (材料の表参照) 準備手順 2.1 2.2 定着剤が含まれています。埋め込みカセット内部に閉じ込められた気泡がないかどうかを確認します。
2. 室温で暗闇で一晩固定液にサンプルをインキュベートします。

6. サンプル処理: バッファー洗浄、脱水、清算・浸透

1. 一晩固定後サンプルを 1 h の 1x PBS で 2 回洗います。最高の結果を得るには、スピンを利用して試薬の均質化を自動化自動ティッシュ プロセッサの機能は、低設定に設定 (材料の表を参照)。プロセッサがない場合、処理は手動で実行できます。
2. 室温で 1 時間傾斜一連 1 × PBS (25%、50%、70%、95%) のエタノール (エタノール) 希釈液の脱水によるバッファー洗浄に従ってください。
3. 100% の 3 つの洗浄で脱水エタノール室温で 1 時間。
4. 100% オレンジ オイル ベース クリア エージェントの 3 つの洗浄で乾燥のサンプルをオフに (材料の表参照) 室温で 1 時間。
5. 潜入クリア サンプル 2 回溶融パラフィン ワックス (材料の表を参照)、加熱 2 時間、55˚C。

7. サンプルの埋め込み

1. 55 ° C に加熱溶融パラフィン ワックスとワックス金型を入力します。温水、フラット ヘラを使用すると、埋め込みカセットからワックスを金型、金型のベースに並列がチャックにかかっていることを確実に浸透したチャックをすばやく転送します。チャックに過度の圧力を適用することを避けるため。ワックス成形カスタム 3 D 印刷、または市販 (材料の表を参照)。
2. 4 ° C で一晩を固めるためのワックスを許可します。固形ワックスの成形品のサンプルは、4 ° C で不明確に保存される可能性があります。
3. ワックスが凝固した、金型からサンプルを消費税し、かみそりの刃でサンプルの周りから余分なワックスをトリミングします。ミクロトームにクランプするために使用できるサンプルの断面、平面に平行の一方の端から拡張する余分なワックスを残す (材料の表を参照してください)。またサンプルのまわり、ワックス、約 1 mm の厚さのシースを残して、その面を滑らかに。

8. 断面

1. 42 ° C の水浴を加熱します。ブレードの端に垂直指向植民地の表面とミクロトームにサンプルをクランプ (材料の表を参照してください)。
2. 植民地の目的の平面に到達するまで、セクションが収集されます 50 μ m 間隔で試料をトリミングします。
3. 75-80 rpm のセクショニング速度・ 6 10˚ の逃げ角設定ミクロトームを使用して 10 μ m 厚いセクションの目的の数のリボンをカットします。細い絵筆を使用して、ブレードからリボンをデタッチします。
4. 風呂の水にリボンを転送 (推奨) パスツール ピペットや鉗子の先端に水のドロップを使用して、優しく。セクションの下のトラップ空気泡を避けるために注意してください。
5. すぐに風呂の水にスライドを挿入し、45 の角度でリボンの下に配置。
6. つや消しラベルのすぐ下のスライドにリボンの狭い端に触れます。リボンが従う必要があります。
7. 風呂の水、水の表面に垂直になる角度を調整し、その長さに沿ってスライドに対して平らにリボンからスライドを引きます。リボンの下に余分な水分をトラップを避けてください。
8. 優しく、吸水糸くずの組織は、セクションから余分な水分を吸湿発散性にスライドを立ってください。
9. ペーパー タオルの上にスライドを置くし、暗闇の中で一晩室温で乾燥すること。スライドは、暗闇の中で 4 ° C で不明確に保存することができます。

9. 熱固定、水分補給、と取り付け

1. 45 ° C に平準化されたホット プレートを加熱します。30-60 分のスライドを加熱します。ワックスなり半溶融、スライドに張りつき。
2. ホット プレートからスライドを持ち上げてそれを置く優しく滑らかな、平準化、室内温度表面にフラットをワックス凝固 (~ 1 分) までに溶けたロウがスライドのいずれかの側にプルしないように注意を使用して。
3. 4 洗浄の洗浄の間ソリューションを削除するを Büchner 吸引を使用して 5 分ごとに、エージェントをオフにスライドをワックス脱ガラス スライド メーラーを使用して。
4. 100% で 3 回スライドを洗う 1 分の江藤。
5. 傾斜一連のエタノール (95%、70%、50%、25%) を 1 分ずつ 1x PBS で 2 つの 1 分洗浄処理の逆の順序でスライドを水分補給します。
6. トリス緩衝取付中の各セクションをすぐにマウント (材料の表を参照) し、気泡の発生を回避する、観察を適用。一晩常温で重合するメディアをマウントを許可します。
7. 重合、一度クリアのマニキュアを使用してスライドに coverslip をシールします。密封されたスライドは、4 ° C で暗闇の中不明確に保存されるかもしれない。

結果

このメソッドは、明瞭な形態学的特徴と遺伝子発現のゾーンを DIC、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡によって視覚化される前記バイオ フィルム薄いセクションを生成します。油浸対物レンズ × 40 を使用して DIC イメージングは、いくつかの形態学的特徴 (図 2 e) を表示するのに十分なことができますが、我々 はその蛍光を発見した恒常エクスプレス蛍?...

ディスカッション

パラフィン包埋、薄切片組織サンプルは微細形態構造のイメージングを有効にし、一般に真核生物の組織、使用、微生物サンプル^{8 にいくつかの成功と適用されている古典的な組織学的手法 ,9}。Cryoembedding 内因性および蛍光信号の強力な保持できますが、パラフィン包埋は一般に望ましい形態¹⁶のより良い保全を提供します。この?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010