Inclusione in paraffina e sezionamento sottile di biofilm di colonie microbiche per l'analisi al microscopio

Riepilogo

Descriviamo la fissazione, inclusione in paraffina e sottili tecniche di sezionamento per colonie microbiche biofilm. In campioni preparati, modelli di espressione di sottostruttura e reporter di biofilm possono essere visualizzati da microscopia.

Abstract

Sezionamento tramite inclusione in paraffina è una tecnica ampiamente consolidata in sistemi eucariotici. Qui forniamo un metodo per la fissazione, l'incorporamento e sezionamento dei biofilm intatto di colonie microbiche utilizzando irrorato di cera di paraffina. Per adattare questo metodo per l'utilizzo su biofilm di Colonia, abbiamo sviluppato le tecniche per mantenere ciascun campione il suo substrato di crescita e di esso di laminazione con un strato di agar e aggiunto alla soluzione fissante lisina. Queste ottimizzazioni migliorano la conservazione del campione e mantenimento delle caratteristiche di micromorphological. Campioni preparati in questo modo sono favorevoli a sottile di sezionamento e di imaging da microscopia elettronica di trasmissione, fluorescenza e della luce. Abbiamo applicato questa tecnica a Colonia biofilm di Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. L'elevato livello di dettaglio visibile in campioni generati da questo metodo, combinato con ceppo reporter ingegneria o l'uso di coloranti specifici, può fornire spunti interessanti sulla fisiologia e sullo sviluppo delle comunità microbiche.

Introduzione

Maggior parte dei microbi hanno la capacità di forma biofilm, comunità di cellule tenute insieme da matrici autoprodotti. I biofilm possono essere coltivati in molti tipi di configurazioni fisiche, con vari regimi di fornitura di nutrienti e substrato. Test specifici per la formazione di biofilm tendono a produrre strutture multicellulari riproducibile e architetture comuni sono osservate per specie filogeneticamente diversificata a livello macroscopico o comunità. Quando i microbi vengono coltivati come colonie su terreno solido sotto atmosfera, morfologia macroscopica trasmette informazioni sulla capacità per la produzione della matrice e spesso correla con altri tratti ^1,2,3. L'architettura interna di colonie microbiche possa anche fornire indizi riguardo specifici del biofilm chimica e fisiologia, ma è stato difficile da caratterizzare. Recenti applicazioni delle tecniche di crioinclusione e cryosectioning di colonie batteriche hanno permesso la formazione immagine e la visualizzazione di specifiche caratteristiche a risoluzione senza precedenti ^4,5,6. Tuttavia, studi con tessuto animale hanno dimostrato che inclusione in paraffina fornisce superiore conservazione della morfologia rispetto a crioinclusione ⁷ e viene utilizzato per visualizzare i batteri in tessuti ^8,9. Abbiamo pertanto sviluppato un protocollo per la fissazione, inclusione in paraffina e sezionamento sottile di colonie microbiche biofilm. Qui, descriviamo la preparazione di Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm sezioni sottili ^10,11, ma abbiamo applicato con successo anche questa tecnica a biofilm formato dai batteri Synxantha Pseudomonas, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae¹².

Il processo di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento biofilm segue una logica semplice. In primo luogo, il biofilm sono racchiusi in uno strato di agar per preservare la morfologia durante l'elaborazione. In secondo luogo, il biofilm racchiusi sono sommerse in un fissativo di crosslink macromolecole e preservare micromorfologia. Questi sono poi disidratati con alcool, ha eliminati con un solvente non polare più e quindi infiltrati con cera di paraffina liquida. Una volta infiltrato, i campioni sono incorporati in mattoncini di cera per il sezionamento. Sezioni sono tagliati, montate su slitte e poi reidratati al fine di riportarli a uno stato più nativo. Da questo punto, possono essere macchiati o coperto in mezzo di montaggio per l'analisi al microscopio.

Questo protocollo produce sezioni sottili di biofilm microbici adatto per l'analisi istologica. Sottostrutture di biofilm di Colonia sono visibili quando sezioni sottili preparati utilizzando questo metodo sono immaginate da microscopia chiara. Biofilm possono essere anche coltivati sulle macchie fluorescenti contenenti supporti specifici per le singole funzionalità o macchiati nella fase di reidratazione, immediatamente prima del montaggio (passaggi 9.5-9.6). Infine, i microbi possono essere progettati per produrre proteine fluorescenti in modo costitutivo o regolamentato, permettendo in caso di segnalazione in situ di espressione di gene o distribuzione delle cellule all'interno di queste comunità. Abbiamo usato questi metodi per determinare la profondità di biofilm di Colonia, distribuzione delle cellule, distribuzione della tabella, modelli di crescita ed espressione genica spatiotemporal.

Protocollo

1. crescita di Pseudomonas aeruginosa Colonia biofilm

1. Preparazione delle piastre Medium-Bilayer
   1. Preparare un tryptone di 10 g/L, agar 10 g/L (Vedi Tabella materiali) soluzione in acqua deionizzata.
   2. Autoclave per raffreddare a 50-60 ° C per 20 min. in un bagno d'acqua.
   3. Versare 45 mL della soluzione di agar-tryptone in un piatto quadrato 100 x 100 mm (Vedi Tabella materiali) utilizzando una provetta conica da 50 mL. Consentire l'agar solidificare (~ 20-30 min). Versare un secondo strato sopra strato prima 15 mL. Lasciare solidificare durante la notte, rimozione di condensazione da coperchi se necessario strofinando con un panno privo di lanugine.
2. Spotting Colonia biofilm
   1. Inoculare i ceppi di interesse dalle scorte di congelatore sul LB agar piastre¹³ ed incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C e 80-100% di umidità relativa.
   2. Per ogni ceppo o replicate, è possibile utilizzare una singola Colonia per inoculare 2 mL di LB e incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
   3. Sub-cultura diluendo 1: 100 in LB fresco e incubare al buio per 2.5-3 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
   4. Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro e regolare con LB sterile per ottenere una sospensione di cellule con un OD_{500 nm} ~ 0,5.
   5. A seconda della Colonia desiderata taglia, dispensare 2.5-10 µ l di sospensione cellulare su un piatto di mezzo-doppio strato (preparato al punto 1.1) e consentire il posto ad asciugare per ~ 20 minuti lasciando il coperchio petri socchiusa vicino a fiamme può facilitare asciugarsi.
   6. Incubare il campione colonie a 25 ° C e 80-100% di umidità relativa, al buio fino a 4 giorni.

2. preparazione della soluzione fissante

1. Preparare la soluzione fissante il giorno della raccolta del campione. Diluire il 37% di formaldeide (FA) in PBS 1X a una concentrazione finale del 4% FA.
   Attenzione: FA è volatile e tossico. Indossare indumenti protettivi e lavorare in una cappa ben ventilata.
2. Immediatamente prima dell'uso, sciogliere L-lisina cloridrato in 4% FA (preparata al punto 2.1) a temperatura ambiente per una concentrazione finale di 50 millimetri L-Lisina HCl.

3. diretta applicazione di fissativo per il Biofilm di Colonia [opzionale]

Nota: Abbiamo trovato che la morfologia di biofilm è meglio conservato quando agar molle viene aggiunto prima della fissazione. Tuttavia, questo passaggio costituisce anche un cambiamento delle condizioni ambientali che potrebbero influenzare l'espressione genica. Modelli di espressione di reporter fluorescente dovrebbero quindi essere verificati utilizzando un protocollo separato in cui il punto di fissazione è effettuato prima dell'aggiunta della sovrapposizione agar, come descritto qui.

1. Il giorno della fissazione e lavorando in una cappa ben ventilata, dispensare il fissativo preparato al punto 2 direttamente alla superficie dell'agar intorno a bordo della Colonia, permettendo così di raggiungere la periferia della Colonia senza sommergendola. Applicare solo come molto fissativo come è necessario completamente circondano la Colonia, circa 500 µ l. consentire il fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.
2. Una volta che il fissativo è stato completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante, circa 20-30 min, e FA residua non è più visibile sulla piastra, ripetere il punto 3.1. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.
3. Una volta che il fissativo è stata completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante ripetizione passaggio 3.1, questa volta l'applicazione fissativo alla superficie della Colonia direttamente. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante, procedere al passaggio 4 solo dopo tutto fissativo è stata assorbita e non è più visibile sulla piastra.

4. overlaying colonie con Agar

1. Il giorno della fissazione, preparare un 10 g/L soluzione agar in acqua deionizzata e autoclave per 10-20 minuti sciogliere. Raffreddare a bagnomaria a 50 ˚ c.
2. Delicatamente versare 15 mL della soluzione di agar sopra la coltura e la Colonia. Consentire l'agar formare un gel a temperatura ambiente per 5 min (Figura 1B).
3. Usare una lama di rasoio affilata per tagliare un mandrino quadrato, 3 strati con la Colonia laminata tra i due strati superiori. Se preparare campioni multipli, assicurarsi che ciascun mandrino è tagliato a dimensioni comparabili.
4. Rimuovere delicatamente l'eccesso agar dal mandrino Colonia-contenente.
5. Per estrarre i due strati superiori dell'agar (contenente la Colonia) dallo strato inferiore del mandrino (Figura 1), bagnare la testa piatta di una spatola in 1X PBS o acqua e inserire delicatamente tra gli strati superiore ed inferiore. La colonia di laminato deve separare dallo strato inferiore. Fare attenzione a non distorcere o piegare la Colonia laminata quando solleva dalla sua base.

5. fissazione

1. Lavorando in una cappa ben ventilata, trasferire immediatamente la Colonia laminata (cioè, chuck 2 strati) in una cassetta incasso (Vedi Tabella materiali), etichettati con un pennarello resistente alle sostanze chimiche. Inserire la cassetta di incorporamento in un mailer di diapositive di vetro (Vedi tabella materiali) contenente il fissativo preparato nei passaggi 2.1-2.2. Assicurarsi che non ci sono nessun bolle d'aria intrappolate all'interno della cassetta incasso.
2. Incubare il campione nel fissativo pernottamento in al buio a temperatura ambiente.

6. campione di elaborazione: Tampone di lavaggio, disidratazione, schiarimento e infiltrazione

1. Dopo la fissazione durante la notte, lavare il campione due volte in PBS 1X per 1h ciascuna. Per risultati ottimali, automatizzare omogeneizzazione di reagente utilizzando lo spin funzione di un processatore automatico (Vedi tabella materiali) impostata su un'impostazione bassa. Se nessun processore è disponibile, il trattamento può essere eseguito manualmente.
2. Seguire il tampone di lavaggio da disidratazione attraverso una serie graduata di diluizioni di etanolo (EtOH) in PBS 1X (25%, 50%, 70%, 95%) per 1 h a temperatura ambiente.
3. Disidratare in tre lavaggi del 100% EtOH per 1 h a temperatura ambiente.
4. Deselezionare il campione disidratato in tre lavaggi dell'agente arancione a base di olio schiarimento 100% (Vedi tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.
5. Si infiltra nell'esempio cancellato due volte con paraffina fusa cera (Vedi Tabella materiali), riscaldato a 55 ° c, per 2 h ogni.

7. campione incorporamento

1. Riempire uno stampo di cera con cera di paraffina fusa riscaldata a 55 ˚ c. Utilizzare una spatola riscaldata, piatta per trasferire rapidamente il mandrino infiltrato dalla cassetta incasso nello stampo di cera, garantendo che il mandrino si riposa parallela alla base dello stampo. Evitare di applicare una pressione eccessiva sul mandrino. Stampi di cera possono essere personalizzati 3D stampato, o sono disponibili in commercio (vedere Tabella materiali).
2. Consentire la cera di solidificare durante la notte a 4 ˚ c. Modellato in cera solida campioni possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ˚ c.
3. Una volta che la cera si è solidificato, asportare il campione dallo stampo e tagliare la cera in eccesso da intorno al campione con una lama di rasoio. Lasciare la cera in eccesso che si estende da un'estremità del campione, parallelo al piano di taglio, che può essere utilizzato per il bloccaggio nel microtomo (Vedi Tabella materiali). Anche lasciare una guaina di cera, di circa 1 mm di spessore, intorno al campione e lisciare le sue facce.

8. sezionamento

1. Riscaldare a bagnomaria a 42 ° c. Fissare il campione nel microtomo con la superficie della Colonia orientata perpendicolarmente al bordo della lama (Vedi Tabella materiali).
2. Sgrossare il campione a intervalli di 50 µm fino a quando è stato raggiunto il piano desiderato della Colonia, da cui sezioni saranno raccolti.
3. Tagliare un nastro del numero desiderato di sezioni spesse 10-µm utilizzando un microtomo impostato una velocità di taglio di 75-80 giri/min e un angolo di spoglia inferiore di 6-10 ˚. Utilizzare un pennello a punta fine per staccare il nastro dalla lama.
4. Utilizzando una goccia d'acqua sulla punta di una pipetta di Pasteur (preferito) o il forcipe, trasferire delicatamente il nastro nel bagnomaria. Fare attenzione a evitare bolle d'aria intrappolamento nella sezione.
5. Immediatamente inserire una diapositiva nel bagno di acqua e posizionarla sotto la barra multifunzione a un angolo di 45 ˚.
6. Toccare il bordo stretto del nastro per la diapositiva, appena sotto l'etichetta smerigliato. Il nastro deve aderire.
7. Tirare la diapositiva dal bagno di acqua, regolazione dell'angolo di diventare perpendicolare alla superficie dell'acqua e consentendo la barra multifunzione per laici piatto contro lo scivolo lungo la sua lunghezza. Evitare di intrappolare l'acqua in eccesso sotto la barra multifunzione.
8. Si levano in piedi delicatamente il vetrino su un panno privo di lanugine assorbente, traspirante acqua in eccesso dalla sezione.
9. Porre il vetrino su un tovagliolo di carta e lasciare asciugare a temperatura ambiente durante la notte nel buio. Diapositive possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° c al buio.

9. calore-fissaggio, reidratazione e montaggio

1. Scaldare una piastra calda livellata a 45 ˚ c. Scaldare il vetrino per 30-60 min. La cera diventerà semi-fusa e appiattire contro la diapositiva.
2. Delicatamente sollevare il vetrino dalla piastra scaldante e adagiarlo piatto su una superficie liscia, livellato, temperatura ambiente, facendo attenzione ad assicurare che la cera fusa non tirare su entrambi i lati della diapositiva, fino a quando la cera si solidifica (~ 1 min).
3. Utilizzando un mailer di diapositive di vetro, de-cera diapositive in quattro lavaggi di compensazione agente per 5 minuti ciascuno, utilizzando un aspiratore di Büchner per rimuovere la soluzione tra i lavaggi.
4. Lavare i vetrini tre volte in 100% EtOH per 1 min ciascuna.
5. Reidratare le diapositive in una serie graduata di etanolo in ordine inverso di elaborazione (95%, 70%, 50% e 25%) per 1 min che ciascuna seguita da due 1-min lavaggi in PBS 1X.
6. Montare immediatamente le sezioni in un mezzo di montaggio tamponata (Vedi Tabella materiali) e applicare un vetrino coprioggetti, evitando l'introduzione di bolle d'aria. Consentire il mezzo di montaggio a polimerizzare durante la notte a temperatura ambiente.
7. Una volta polimerizzato, sigillare il coprioggetto alla diapositiva utilizzando smalto trasparente. Sigillato vetrini possono essere conservati a tempo indeterminato al buio a 4 ° c.

Risultati

Questo metodo genera sottili sezioni di biofilm in cui le caratteristiche morfologiche distinte e zone di espressione genica possono essere ripreso da DIC, microscopia a fluorescenza e TEM. Mentre imaging DIC utilizzando un 40 X obiettivo a immersione in olio può essere sufficiente a mostrare alcune caratteristiche morfologiche (Figura 2E), abbiamo trovato quello fluorescenza microscopia di ceppi ingegnerizzati per proteina costitutivamente espresso fluoresc...

Discussione

Campioni di tessuto di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento è una tecnica istologica classica che permette l'imaging delle strutture micro-morfologica e viene comunemente utilizzata sui tessuti negli eucarioti è stata applicata con successo ai campioni microbici^{8 ,9}. Mentre crioinclusione consente una forte ritenzione del segnale endogeno ed immunofluorescente, inclusione in paraffina è generalmente preferibile in quanto fornisce migliore conservazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010