Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico

Resumen

Describimos a fijación, inclusión en parafina y finas técnicas seccionamiento de biofilms microbianos de la Colonia. En muestras preparadas, patrones de expresión de subestructura y reportero de biofilm pueden visualizarse por microscopía.

Resumen

Seccionamiento mediante inclusión en parafina es una técnica ampliamente establecida en sistemas eucarióticos. Aquí proporcionamos un método para la fijación, inclusión y secciones de biofilms intacto Colonia microbiana utilizando parafina perfundido. Para adaptar este método para el uso en Colonia biofilms, desarrollado técnicas para mantener cada muestra en su sustrato de crecimiento y laminar con un overlayer de agar y lisina ha añadido a la solución fijadora. Estas optimizaciones mejoran la retención de la muestra y la preservación de Características micromorfológicas. Muestras preparadas de esta manera son susceptibles de fino corte y proyección de imagen por microscopía de luz, fluorescencia y transmisión. Hemos aplicado esta técnica a biopelículas de la colonia de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisy Vibrio cholerae. El alto nivel de detalle visible en las muestras generadas por este método, combinado con cepa reportero ingeniería o el uso de colorantes específicos, puede proporcionar ideas interesantes sobre la fisiología y el desarrollo de las comunidades microbianas.

Introducción

La mayoría de microbios tienen la capacidad para forma biofilms, comunidades de células ligan por matrices de producción propia. Biofilms se puede cultivar en muchos tipos de configuraciones físicas, con diversos regímenes de suministro de nutrientes y sustrato. Ensayos específicos para la formación del biofilm tienden a producir estructuras multicelulares reproducibles, y arquitecturas comunes se observan especies filogenéticamente diversas a nivel macroscópico o comunidad. Cuando microbios crecen como colonias en medio sólido bajo una atmósfera, morfología macroscópica transmite información sobre la capacidad de producción de la matriz y a menudo se correlaciona con otros rasgos ^1,2,3. La arquitectura interna de las colonias microbianas también puede proporcionar pistas sobre biofilm específica química y fisiología, pero ha sido difícil de caracterizar. Recientes aplicaciones de las técnicas de crioinclusiones y cryosectioning a colonias bacterianas han permitido la proyección de imagen y visualización de características específicas en la resolución sin precedentes ^4,5,6. Sin embargo, estudios con tejidos animales han demostrado que inclusión en parafina proporciona superior conservación de la morfología comparada con crioinclusiones ⁷ y se ha utilizado para visualizar las bacterias en los tejidos ^8,9. Por lo tanto hemos desarrollado un protocolo para la fijación, inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos de la Colonia. Aquí, describimos la preparación de secciones delgadas ^10,11de Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm, pero también con éxito hemos aplicado esta técnica a biofilms formados por las bacterias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, y Vibrio cholerae¹².

El proceso de inclusión en parafina y secciones delgadas de biopelículas sigue una simple lógica. En primer lugar, los biofilms están contenidos en una capa de agar para preservar la morfología durante el proceso. En segundo lugar, los biofilms encajonadas son sumergidos en un fijador para macromoléculas de la reticulación y preservar micromorfología. Estos son luego deshidratados con alcohol, limpiados con un solvente más polar y luego infiltrados con cera de parafina líquida. Una vez infiltrado, las muestras están incrustadas en bloques de cera para seccionamiento. Las secciones son corte montadas en portaobjetos y luego rehidratadas para volver a un estado más nativo. Desde este punto, pueden ser manchadas o cubiertas de medio de montaje para el análisis microscópico.

Este protocolo produce finas secciones de biofilms microbianos adecuados para análisis histológico. Subestructuras de biofilm de Colonia son accesibles cuando secciones delgadas preparadas utilizando este método son imágenes por microscopia ligera. Biofilms también puede ser crecidos en las manchas fluorescentes que contienen los medios de comunicación específicos para características individuales o manchados en la etapa de rehidratación, inmediatamente antes del montaje (pasos 9.5 9.6). Por último, microbios pueden ser diseñados para producir proteínas fluorescentes de manera constitutiva o regulada, lo que en situ informes de expresión de la distribución o gen de la célula dentro de estas comunidades. Hemos utilizado estos métodos para determinar la profundidad de biofilm de Colonia, distribución celular, distribución de la matriz, patrones de crecimiento y expresión génica espaciotemporal.

Protocolo

1. crecimiento de aeruginosa de los Pseudomonas Biofilms de Colonia

1. Preparación de placas de medio-bicapa
   1. Preparar un 10 G/l triptona, agar 10 g/L solución (véase Tabla de materiales) en agua desionizada.
   2. Autoclave durante 20 min enfriar a 50-60 ° C en un baño de agua.
   3. 45 mL de la solución de agar triptona vierta un plato cuadrado de 100 x 100 mm (véase Tabla de materiales) utilizando un tubo cónico de 50 mL. Permitir que el agar se solidifique (~ 20-30 min). Verter una segunda capa de 15 mL encima la primera capa. Dejar solidificar durante la noche, eliminación de condensación de tapas si es necesario frotándola con un paño libre de pelusas.
2. Avistamiento de Colonia Biofilms
   1. Las cepas de interés de la raya de las existencias de congelador en LB agar placas¹³ e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C y 80-100% humedad relativa.
   2. Para cada cepa o repetición, utilice una sola Colonia para inocular 2 mL de LB e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
   3. El de la cultura mediante la dilución 1: 100 en fresco LB y de incubación en la oscuridad de 2.5-3 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
   4. Medir densidad óptica usando un espectrofotómetro y ajustar con LB estéril para lograr una suspensión con un OD_{500 nm} de ~ 0,5.
   5. Dependiendo de la Colonia deseada tamaño, pipeta 2.5-10 μl de la suspensión celular en un plato mediano-bicapa (preparado en el paso 1.1) y permitir que el terreno se seque por 20 minutos dejando la tapa de petri abierta cerca de una llama abierta puede facilitar el secado.
   6. Incubar el punto colonias a 25 ° C y 80-100% humedad relativa, en la oscuridad hasta por 4 días.

2. preparación de la solución fijadora

1. Preparar la solución fijadora en el día de la recolección de la muestra. Diluir el 37% de formaldehído (FA) en PBS 1 x a una concentración final de 4% FA.
   PRECAUCIÓN: FA es volátil y tóxico. Utilizar equipo de protección y trabajar en una campana bien ventilada.
2. Inmediatamente antes del uso, disolver clorhidrato de L-lisina en el 4% FA, (preparada en el paso 2.1) a temperatura ambiente a una concentración final de 50 mM L-Lisina HCl.

3. dirigir la aplicación de fijador a la biopelícula de Colonia [opcional]

Nota: Hemos encontrado que morfología de biofilm se conserva mejor cuando se añade el agar de recubrimiento antes de la fijación. Sin embargo, este paso constituye también un cambio en las condiciones ambientales que pueden afectar la expresión génica. Patrones de expresión de reportero fluorescente por lo tanto deben ser verificados mediante un protocolo separado en el que el paso de fijación se lleva a cabo antes de la adición de agar de recubrimiento, como se describe aquí.

1. En el día de la fijación y trabajar en una campana bien ventilada, pipetear el fijador preparado en el paso 2 directamente a la superficie del agar alrededor de la Colonia, lo que le permite llegar a la periferia de la Colonia sin sumergiéndola. Aplicar sólo como mucho fijador ya que para totalmente rodea la Colonia, aproximadamente 500 μl. permitir que el fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.
2. Una vez que el fijador ha sido completamente absorbido por la Colonia y los medios circundantes, aproximadamente 20-30 min, y FA residual ya no es visible en la placa, repita el paso 3.1. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.
3. Una vez que el fijador ha sido completamente absorbida por la Colonia y sus alrededores los medios repiten el paso 3.1, esta vez aplicando fijador a la superficie de la Colonia directamente. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante, proceder al paso 4 sólo después de todo fijador ha sido absorbida y ya no es visible en la placa.

4. superposición colonias con Agar

1. En el día de la fijación, preparar un 10 g/L solución de agar en agua desionizada y autoclave de 10-20 minutos disolver. Enfriar en un baño de agua a 50 ° c.
2. Suavemente verter 15 mL de la solución de agar al medio de cultivo y Colonia. Permitir que el agar para formar un gel a temperatura ambiente durante 5 minutos (figura 1B).
3. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar un plato cuadrado, 3 capas con la Colonia laminada entre las dos capas superiores. Si de preparación de muestras múltiples, asegúrese de que cada tirada es cortado a un tamaño comparable.
4. Retire suavemente el exceso agar de la tirada que contiene la Colonia.
5. Para levantar las dos capas superiores de agar (contiene la Colonia) de la capa inferior del mandril (figura 1), mojar la cabeza plana de 1 x PBS o agua una espátula e inserte suavemente entre las capas superior e inferior. La Colonia laminada debe separarse de la capa inferior. Tenga cuidado de no torcer o doblar la Colonia laminada cuando se levante de su base.

5. fijación

1. Trabajar en una campana bien ventilada, transferir inmediatamente la Colonia laminada (es decir, mandril de 2 capas) en un cassette de inclusión (véase Tabla de materiales), marcado con un marcador resistente a productos químicos. Coloque el cassette de inclusión en un envío de diapositivas de vidrio (véase tabla de materiales) que contiene el fijador preparado en pasos 2.1-2.2. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en el interior del cassette de inclusión.
2. Incubar la muestra en el fijador durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.

6. muestra proceso: Tampón de lavado, deshidratación, claro y la infiltración

1. Después de la fijación durante la noche, lave la muestra dos veces en PBS 1 x durante 1 hora. Para mejores resultados, automatizar la homogeneización de reactivo usando la función de un procesador de tejidos automático (véase tabla de materiales) establece en un ajuste bajo. Si no se dispone de ningún procesador, procesamiento se puede ejecutar manualmente.
2. Siga el lavado Tampón por deshidratación a través de una serie gradual de etanol (EtOH) diluciones en PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) durante 1 h a temperatura ambiente.
3. Deshidratar en tres lavados de 100% EtOH durante 1 h a temperatura ambiente.
4. Claro la muestra deshidratada en tres lavados de agente naranja claro a base de aceite de 100% (véase tabla de materiales) por 1 h a temperatura ambiente.
5. Infiltra la muestra limpia dos veces con parafina fundida la cera (véase Tabla de materiales), se calienta a 55˚C, por 2 h.

7. muestra incrustación

1. Llenar un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 ° c. Use una espátula caliente, plana para transferir rápidamente el mandril infiltrado del cassette de inclusión en el molde de cera, asegurando que el mandril apoya paralelo a la base del molde. Evite aplicar presión excesiva sobre el mandril. Moldes de cera pueden ser 3D personalizado impreso, o están disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales).
2. Permita que la cera solidifique durante la noche a 4 ° c. Muestras moldeadas en cera sólida pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° c.
3. Una vez que la cera se ha solidificado, suprimir la muestra del molde y recorte el exceso cera de alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar. Deja la cera sobrante que se extiende desde un extremo de la muestra, paralelo al plano de corte, que puede utilizarse para fijar en el micrótomo (véase Tabla de materiales). También deja una envoltura de cera y aproximadamente 1 mm de espesor, alrededor de la muestra y lisa de sus caras.

8. seccionamiento

1. Un baño de agua a 42 ° c de calor. La muestra de la abrazadera en el micrótomo con la superficie de la Colonia orientada perpendicular al borde de la hoja (véase Tabla de materiales).
2. Cortar la muestra en intervalos de 50 μm hasta alcanzar el plano deseado de la Colonia, de la que se recogerán las secciones.
3. Corte una cinta del número de secciones de 10 μm espesor utilizando un micrótomo a un velocidad de seccionamiento de 75-80 rpm y un ángulo de separación de 6-10 °. Utilizar un pincel de punta fina para separar la cinta de la hoja.
4. Utilizando una gota de agua en la punta de una pipeta de Pasteur (preferido) o fórceps, transferir suavemente la cinta para el baño de agua. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire captura bajo la sección.
5. Inmediatamente insertar una diapositiva en el baño de agua y colocarlo debajo de la cinta en un ángulo de 45 °.
6. Toque el borde estrecho de la cinta a la corredera, justo debajo de la etiqueta del helado. La cinta debe adherirse.
7. Tire de la corredera en el baño de agua, ajustar el ángulo a ser perpendicular a la superficie del agua y permitir que la cinta en posición plana contra la corredera a lo largo de su longitud. Evite atrapar el exceso de agua debajo de la cinta.
8. Soporte suavemente el portaobjetos sobre un absorbente pelusa, absorbe exceso de agua de la sección.
9. Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel y deje que se seque a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Diapositivas pueden almacenarse indefinidamente a 4 ° c en la oscuridad.

9. fijación de calor, rehidratación y montaje

1. Una placa caliente nivelada a 45 ° c de calor. Caliente la diapositiva durante 30-60 minutos. La cera será convertido en semi fundida y aplanar contra la corredera.
2. Suavemente Levante la diapositiva de la placa y colóquela plana en una superficie lisa, nivelada, temperatura ambiente, usando cuidado para asegurar que la cera fundida no tira a ambos lados de la corredera, hasta que la cera solidifica (~ 1 min).
3. Mediante un envío de diapositivas de vidrio, cera de diapositivas en cuatro lavados de claro agente de 5 minutos cada uno, utilizando un aspirador de Büchner para eliminar la solución entre lavados.
4. Lavar los portaobjetos tres veces en el 100% EtOH durante 1 minuto.
5. Rehidratar las diapositivas de una serie gradual de etanol en el orden inverso de la transformación (95%, 70%, 50% y 25%) durante 1 minuto que cada uno seguido por dos lavados de 1 min en PBS 1 x.
6. Inmediatamente montar las secciones en un medio de montaje con tampón Tris (véase Tabla de materiales) y aplica un cubreobjetos, evitando la introducción de burbujas de aire. Permitir que el medio de montaje polimerizar durante la noche a temperatura ambiente.
7. Una vez polimerizado, sellar el cubreobjetos a la diapositiva usando esmalte de uñas claro. Diapositivas de sellado pueden conservarse indefinidamente en la oscuridad a 4 ° c.

Resultados

Este método genera biofilm delgada-secciones en donde distintas características morfológicas y las zonas de la expresión génica pueden ser reflejadas por DIC, microscopía de fluorescencia y TEM. Mientras que la proyección de imagen DIC utilizando un 40 X objetivo de inmersión de aceite puede ser suficiente para mostrar algunos rasgos morfológicos (Figura 2E), hemos encontrado que la fluorescencia microscopía de variedades dirigido a proteína consti...

Discusión

Muestras de inclusión en parafina y secciones delgadas del tejido es una técnica histológica clásica que permite proyección de imagen de estructuras morfológicas micro se usa comúnmente en los tejidos eucarióticos y se ha aplicado con cierto éxito a muestras microbianas^{8 ,9}. Mientras que crioinclusiones permite la fuerte retención de señal endógena e inmunofluorescente, inclusión en parafina es generalmente preferible ya que proporciona mejor preser...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010