Incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos colônia para análise microscópica

Resumo

Descrevemos a fixação, incorporação de parafina e técnicas de corte finas para biofilmes microbianos de colônia. Em amostras preparadas, padrões de expressão de subestrutura e repórter de biofilme podem ser visualizados por microscopia.

Resumo

Corte através de incorporação de parafina é uma técnica amplamente estabelecida em sistemas eukaryotic. Aqui nós fornecemos um método para a fixação, incorporação e corte de biofilmes intactos colônia microbiana usando cera de parafina perfundida. Para adaptar esse método para uso em biofilmes de colônia, desenvolveu técnicas para a manutenção de cada amostra no seu substrato de crescimento e estratificação-lo com uma sobrecamada de agar e adicionado lisina para a solução de fixador. Essas otimizações melhoram a retenção de amostra e preservação de recursos recorrendo. Amostras preparadas desta maneira são passíveis de fino seccionamento e por microscopia de luz, fluorescência e transmissão de imagem. Nós aplicamos esta técnica a colônia de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. O elevado nível de detalhe visível nas amostras geradas por esse método, combinado com a estirpe de repórter engenharia ou a utilização de corantes específicos, pode fornecer insights emocionantes sobre a fisiologia e o desenvolvimento de comunidades microbianas.

Introdução

A maioria dos micróbios têm a capacidade de forma de biofilmes, comunidades de células realizaram em conjunto pelas matrizes de produção própria. Biofilmes podem ser cultivadas em muitos tipos de configurações físicas, com diferentes regimes de fornecimento de nutrientes e substrato. Ensaios específicos para a formação de biofilme tendem a produzir estruturas multicelulares reprodutíveis e arquiteturas comuns são observadas para espécies filogeneticamente diversos no nível macroscópico ou comunidade. Quando os micróbios são crescidos como colônias em meio sólido sob uma atmosfera, morfologia macroscópica transmite informações sobre a capacidade de produção de matriz e muitas vezes se correlaciona com outros traços ^1,2,3. A arquitetura interna das colónias microbianas também pode fornecer pistas sobre biofilme específico química e fisiologia, mas tem sido difícil de caracterizar. Recentes aplicações de técnicas de cryoembedding e cryosectioning de colônias bacterianas permitiram imaging e visualização de características específicas na resolução sem precedentes ^4,5,6. No entanto, estudos com tecido animal mostraram que parafina incorporação fornece superior preservação da morfologia quando comparado com o cryoembedding ⁷ e tem sido usado para visualizar as bactérias em tecidos ^8,9. Portanto, nós desenvolvemos um protocolo para fixação, incorporação de parafina e corte fino de biofilmes microbianos de colônia. Aqui, iremos descrever a preparação de Pseudomonas aeruginosa PA14 colônia-biofilme seções finas ^10,11, mas temos aplicado também com sucesso esta técnica de biofilmes formados pelas bactérias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae¹².

O processo de incorporação de parafina e fino-corte biofilmes segue uma lógica simples. Primeiro, os biofilmes são encerradas em uma camada de ágar para preservar a morfologia durante o processamento. Em segundo lugar, os biofilmes envolto estão submersas no fixador a macromoléculas crosslink e preservar a micromorfologia. Estes são então desidratados com álcool, limpo com um solvente apolar mais e em seguida infiltradas com cera de parafina líquida. Uma vez que se infiltrou, as amostras são incorporadas em blocos de cera para corte. Seções são cortadas, montadas em lâminas e depois reidratadas para devolvê-los para um estado mais nativo. A partir deste ponto, podem ser manchadas ou cobertos de meio de montagem para análise microscópica.

Este protocolo produz seções finas de biofilmes microbianos apropriados para análise histológica. Subestruturas de biofilme colônia são visíveis quando seções finas preparadas usando este método são imaginadas por microscopia de luz. Biofilmes também podem ser cultivadas em manchas de fluorescente contendo mídia específica para recursos individuais ou manchados na etapa de reidratação, imediatamente antes da montagem (etapas 9.5-9,6). Finalmente, os micróbios podem ser projetados para produzir proteínas fluorescentes de maneira constitutiva ou regulamentado permitindo em situ relatórios de célula distribuição ou gene expressão dentro dessas comunidades. Usamos esses métodos para determinar a profundidade de biofilme de colônia, distribuição de célula, distribuição da matriz, os padrões de crescimento e expressão gênica spatiotemporal.

Protocolo

1. crescimento de Pseudomonas aeruginosa biofilmes de colônia

1. Preparação de placas de médio-BICAMADA
   1. Preparar um triptona 10 g/L, o ágar de 10 g/L (veja a Tabela de materiais) solução em água desionizada.
   2. Autoclave de 20 min. esfriar até 50-60 ° C em banho-maria.
   3. Despeje a 45 mL da solução de ágar triptona em um prato quadrado 100 mm x 100 mm (ver Tabela de materiais) usando um tubo cónico de 50 mL. Permitir que o ágar solidificar (~ 20-30 min). Despeje uma camada em segundo lugar, 15 mL em cima da primeira camada. Deixe solidificar durante a noite, removendo a condensação de tampas se necessário esfregando com um pano livre de fiapos.
2. Mancha de biofilmes de colônia
   1. Marcam as cepas de interesse dos estoques do congelador para LB ágar placas¹³ e incubar no escuro para 12-16 h a 37 ° C e 80-100% de umidade relativa.
   2. Para cada estirpe ou replicar, use uma única colônia para inocular 2 mL de LB e incubar no escuro para 12-16 h a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
   3. Subcultura por diluição 1: 100 em fresco LB e incubação no escuro para 2,5-3 h a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
   4. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro e ajustar com LB estéril para conseguir uma suspensão de células com uma OD_{500 nm} de ~ 0,5.
   5. Dependendo da colônia desejada tamanho, Pipetar 2,5-10 µ l de suspensão de células em uma placa de médio-BICAMADA (preparada na etapa 1.1) e permitir que o local para secar por ~ 20 min. deixar a tampa petri aberta perto de chamas pode facilitar a secagem.
   6. Incube a ponto colônias em 25 ° C e 80-100% umidade relativa, no escuro por até 4 dias.

2. preparação da solução de fixador

1. Prepare a solução de fixador no dia da colheita da amostra. Diluir o formol 37% (FA) em PBS 1x para uma concentração final de 4% FA.
   Cuidado: FA é volátil e tóxico. Utilize equipamento de protecção e trabalhar em uma coifa bem ventilada.
2. Imediatamente antes do uso, dissolver cloridrato de L-lisina em 4% FA (preparado no passo 2.1) à temperatura ambiente a uma concentração final de 50 mM L-lisina HCl.

3. direcionar a aplicação do fixador para o biofilme de Colônia [opcional]

Nota: Achamos que morfologia de biofilme é melhor preservada durante a gelose é adicionada antes da fixação. No entanto, esta etapa constitui também uma mudança nas condições ambientais que podem afetar a expressão do gene. Padrões de expressão repórter fluorescente, portanto, devem ser verificados usando um protocolo separado no qual é realizada a etapa de fixação antes da adição da gelose, conforme descrito aqui.

1. No dia da fixação e trabalhando em uma coifa ventilada, pipete o fixador preparado no passo 2, diretamente para a superfície de ágar em torno da borda da colônia, permitindo-lhe alcançar a periferia da colônia sem submergindo-lo. Aplicam-se somente como muito fixador como é necessário para totalmente cercam a colônia, aproximadamente 500 µ l. permitem que o fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham.
2. Uma vez que o fixador foi completamente absorvido pela colônia e mídia circundante, cerca de 20-30 min, e FA residual não é mais visível na placa, repita o passo 3.1. Permitir que este fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham.
3. Uma vez que o fixador foi completamente absorvido pela colônia e mídia circundante repita o passo 3.1, desta vez aplicando o fixador à superfície da colônia diretamente. Permitir que este fixador para a colônia e o ágar circundante se espalham, avançar para o passo 4 só afinal fixador tenha sido absorvido e não é mais visível na placa.

4. sobreposição colônias com ágar

1. No dia da fixação, prepare um 10 g/L solução de ágar em água desionizada e autoclave para 10-20 minutos para dissolver. Resfriar em um banho de 50 ˚ c.
2. Delicadamente, despeje 15 mL da solução de ágar sobre o meio de crescimento e colônia. Permitir que o agar para formar um gel à temperatura ambiente por 5 min (figura 1B).
3. Use uma lâmina afiada para cortar um quadrado, 3 camadas de chuck com a colônia laminada entre as duas camadas superiores. Se preparar amostras múltiplas, certifique-se de que cada chuck corta-se um tamanho comparável.
4. Suavemente retire o chuck colônia contendo agar em excesso.
5. Para levantar as duas camadas superiores de ágar-ágar (contendo a colônia) longe da camada inferior do mandril (Figura 1), molhar a cabeça plana de uma espátula em 1X PBS ou água e introduza delicadamente entre as camadas superior e inferior. A colônia laminada deve separar a camada inferior. Tenha cuidado para não distorcer ou dobrar a colônia laminada quando levantá-lo de sua base.

5. fixação

1. Trabalhando em uma boa ventilação exaustora, imediatamente transferir a colônia laminada (ou seja, 2-camada chuck) dentro de um estojo de encastre (ver Tabela de materiais), rotulado com uma caneta resistente a produtos químicos. Coloque a fita de incorporação em um mailer de slide de vidro (veja a tabela de materiais) contendo o fixador preparado em passos 2.1-2.2. Certifique-se que há nenhuma bolha de ar presa dentro da gaveta de encastre.
2. Incube a amostra no fixador durante a noite, no escuro à temperatura ambiente.

6. amostra processamento: Wash Buffer, desidratação, clareira e infiltração

1. Após a fixação durante a noite, lave a amostra duas vezes em PBS 1x por 1h cada. Para melhores resultados, automatizar a homogeneização de reagente usando o spin função de um processador automático de tecidos (ver tabela de materiais) definido para uma configuração baixa. Se o processador não está disponível, processamento pode ser executado manualmente.
2. Siga a tampão de lavagem pela desidratação através de uma série graduada de diluições de etanol (EtOH) em PBS 1x (25%, 50%, 70%, 95%) por 1 hora em temperatura ambiente.
3. Desidrata-se em três lavagens de 100% EtOH para 1 h à temperatura ambiente.
4. Limpar a amostra desidratada em três lavagens de agente laranja clareira à base de óleo de 100% (ver tabela de materiais) para 1 h à temperatura ambiente.
5. Infiltrar a amostra limpa duas vezes com parafina derretida de cera (ver Tabela de materiais), aquecido a 55˚C, de 2h cada.

7. amostra incorporação

1. Encha um molde de cera com cera de parafina derretida, aquecida a 55 ˚ c. Use uma espátula aquecida, plana para transferir o chuck infiltrado da gaveta a incorporação em molde de cera, garantindo que o chuck repousa paralelo à base do molde. Evite aplicar pressão excessiva sobre o chuck. Moldes de cera podem ser 3D personalizado imprimido, ou estão comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais).
2. Permitir que a cera solidificar durante a noite a 4 ˚ c. Amostras moldadas em cera sólida podem ser armazenadas indefinidamente no 4 ˚ c.
3. Uma vez que a cera tem solidificado, excisar a amostra do molde e aparar a cera em excesso ao redor da amostra com uma lâmina de barbear. Deixe a cera em excesso, estendendo-se desde uma extremidade da amostra, paralela ao plano de corte, que pode ser usada para fixá-lo no micrótomo (ver Tabela de materiais). Também deixar uma bainha de cera, de aproximadamente 1 mm de espessura, em torno da amostra e suavizar seus rostos.

8. corte

1. Aqueça a banho-maria a 42 ˚ c. Fixar a amostra no micrótomo com a superfície da colônia orientada perpendicularmente à borda da lâmina (ver Tabela de materiais).
2. Corte a amostra em intervalos de 50 µm até o avião desejado da colônia foi alcançado, do qual serão recolhidas as seções.
3. Corte uma fita do número desejado de 10 µm espessura seções usando um micrótomo definido como uma velocidade de corte de 75-80 rpm e um ângulo de 6-10. Use um pincel de ponta fina para retirar a fita da lâmina.
4. Usando uma gota de água na ponta de uma pipeta Pasteur (preferida) ou fórceps, gentilmente transferi a faixa de opções para o banho de água. Tenha cuidado para evitar bolhas de ar captura sob a seção.
5. Imediatamente inserir um slide para o banho de água e posicioná-lo abaixo da faixa de opções em um ângulo de 45º.
6. Toca a borda estreita da faixa de opções para o slide, logo abaixo do rótulo fosco. A faixa de opções deve aderir.
7. Puxe o slide sair do banho de água, ajustar o ângulo a ser perpendicular à superfície da água e permitindo que a faixa de opções deitado contra o deslizamento ao longo de seu comprimento. Evite prendendo o excesso de água abaixo da faixa de opções.
8. Delicadamente se o slide em um tecido absorvente de fiapos, absorção de água em excesso da seção.
9. Colocar o slide em uma toalha de papel e deixe-o secar à temperatura ambiente durante a noite, no escuro. Slides podem ser armazenados indefinidamente no 4 ˚ c no escuro.

9. calor-fixação, reidratação e montagem

1. Aqueça uma chapa quente nivelada a 45 ˚ c. Calor do slide para 30-60 min. A cera se tornará semi-fundido e achatar contra o slide.
2. Delicadamente Levante o slide da placa quente e colocá-lo horizontalmente sobre uma superfície lisa, nivelada, temperatura, usando cuidado para assegurar que a cera derretida não puxa para o outro lado do slide, até que a cera se solidifica (~ 1 min).
3. Usando um mailer de slide de vidro, de cera slides em quatro lavagens de agente por 5 min cada, usando um aspirador de Büchner para remover a solução entre lavagens de limpeza.
4. Lavar as lâminas três vezes em 100% EtOH por 1 min cada.
5. Hidratar os slides em uma série graduada de etanol na ordem inversa de processamento (95%, 70%, 50% e 25%) por 1 min, que cada um seguido de duas lavagens 1-min em 1X PBS.
6. Imediatamente, montar as seções em um meio de montagem de tampão Tris (ver Tabela de materiais) e uma lamela, evitando a introdução de bolhas de ar. Permitir que o meio de montagem polimerizar durante a noite em temperatura ambiente.
7. Uma vez polimerizada, sele a lamela para o slide usando esmaltes claros. Selado de slides podem ser armazenados indefinidamente no escuro no 4 ˚ c.

Resultados

Este método gera o biofilme-cortes finos onde características morfológicas distintas e zonas de expressão gênica podem ser fotografadas por DIC, microscopia de fluorescência e TEM. Enquanto DIC imagem usando um 40 X objetivo de imersão de óleo pode ser suficiente para mostrar algumas características morfológicas (Figura 2E), encontramos essa fluorescência microscopia de cepas é projectado para proteína constitutivamente expressa fluorescente forn...

Discussão

Amostras de tecido parafina-incorporação e fino-corte é uma técnica histológica clássica que permite imagens de estruturas morfológicas-micro e é comumente usada em tecidos de eucariotas e aplicou-se com algum sucesso para amostras microbianas^{8 ,9}. Enquanto cryoembedding permite forte retenção de sinal endógeno e imunofluorescência, incorporação de parafina é geralmente é preferível, pois proporciona melhor preservação da morfologia

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010