Enrobage de paraffine et de profilés minces des colonies microbiennes Biofilms pour analyse microscopique

Résumé

Nous décrivons la fixation, enrobage de paraffine et des techniques de sectionnement minces pour les biofilms de colonies microbiennes. Dans les échantillons préparés, patrons de biofilm sous-structure et reporter d’expression peuvent être visualisées par microscopie.

Résumé

Sectionnement par enrobage de paraffine est une technique largement établie aux systèmes eucaryotes. Ici, nous fournissons une méthode pour la fixation, enrobage et sectionnant des biofilms de colonies microbiennes intact à l’aide de cire de paraffine perfusée. Pour adapter cette méthode pour une utilisation sur les biofilms de colonie, nous ont développé des techniques pour maintenir chaque échantillon sur son substrat de croissance et il laminage avec une surcouche d’agar et lysine a ajouté à la solution de fixation. Ces optimisations améliorent la conservation d’échantillons et de la préservation des caractéristiques micromorphologiques. Les échantillons préparés de cette manière sont prêtent pour fluidifier le sectionnement et imagerie par microscopie photonique, fluorescence et. Nous avons appliqué cette technique à la colonie des biofilms de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtiliset Vibrio cholerae. Le haut niveau de détail visible dans les échantillons générés par cette méthode, combinée avec la souche journaliste génie ou l’utilisation des colorants spécifiques, peuvent fournir un aperçu passionnant de la physiologie et le développement des communautés microbiennes.

Introduction

La plupart des microbes ont la capacité de forme biofilms, communautés de cellules attachées par des matrices auto-produit. Biofilms peut être cultivés dans de nombreux types de configurations physiques, avec différents régimes de disposition des éléments nutritifs et le substrat. Des tests spécifiques pour la formation de biofilm ont tendance à produire des structures multicellulaires reproductibles et architectures courantes sont observées pour des espèces phylogénétiquement diversifiés au niveau macroscopique ou communauté. Lorsque les microbes sont cultivés comme colonies sur milieu solide sous une atmosphère, morphologie macroscopique fournit des informations sur la capacité de production de la matrice et souvent en corrélation avec les autres traits ^1,2,3. L’architecture interne des colonies microbiennes peut également fournir des indices sur le biofilm spécifique chimie et physiologie, mais il a été difficile à caractériser. Les applications récentes de techniques Cryoinclusion et cryosectioning aux colonies bactériennes ont permis d’imagerie et de visualisation des caractéristiques spécifiques à une résolution sans précédent de^{5, 4,6}. Cependant, avec les tissus d’origine animale ont démontré que paraffine incorporation prévoit la conservation supérieure de morphologie comparée à Cryoinclusion ⁷ et a été utilisée pour visualiser des bactéries dans les tissus ^8,9. Nous avons donc mis au point un protocole pour la fixation, enrobage de paraffine et découpe fine des colonies microbiennes biofilms. Ici, nous allons décrire la préparation de Pseudomonas aeruginosa PA14 colonie-biofilm minces ^10,11, mais nous avons également avec succès appliqué cette technique aux biofilms formés par les bactéries Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, et Vibrio cholerae¹².

Le processus d’enrobage de paraffine et de coupes minces biofilms suit une logique simple. Tout d’abord, les biofilms sont entourées d’une couche de gélose pour préserver la morphologie au cours du traitement. Deuxièmement, les biofilms enfermé sont submergées dans un fixateur aux macromolécules crosslink et préserver la micromorphologie. Ceux-ci sont ensuite déshydratés avec de l’alcool, effacés avec un solvant non polaire plus et puis infiltrés avec de la cire de paraffine liquide. Une fois infiltré, les échantillons sont intégrés dans des blocs de cire pour le sectionnement. Sections sont coupées, montées sur des glissières et puis réhydratées afin de retourner à un État plus naturel. De ce point, peut être teintés ou traitées dans le milieu de montage pour analyse microscopique.

Ce protocole produit des coupes minces des biofilms microbiens d’analyse histologique. Sous-structures de biofilm de colonie sont visibles lors de coupes minces préparées à l’aide de cette méthode sont imagés au microscope photonique. Biofilms également peuvent être cultivées sur des taches fluorescentes contenant de médias spécifiques pour les fonctions individuelles ou teintés à la phase de réhydratation, immédiatement avant le montage (étapes 9,5-9,6). Enfin, les microbes peuvent être conçues pour produire des protéines fluorescentes de manière constitutive ou réglementé permettant in situ rapports d’expression de distribution ou un gène cellulaire au sein de ces communautés. Nous avons utilisé ces méthodes pour déterminer la profondeur de biofilm de colonie, distribution cellulaire, distribution de matrice, profils de croissance et expression génique spatio-temporelle.

Protocole

1. la croissance de Pseudomonas aeruginosa colonie Biofilms

1. Préparation des plaques de Medium-bicouche
   1. Préparer un tryptone 10 g/L, la gélose de 10 g/L (voir Table des matières) de solution dans l’eau désionisée.
   2. Autoclave pendant 20 min. laisser refroidir à 50-60 ° C dans un bain d’eau.
   3. Versez 45 mL de la solution de Gélose tryptone dans un plat carré de 100 x 100 mm (voir Table des matières) à l’aide d’un tube conique de 50 mL. Permettre l’agar pour solidifier (~ 20-30 min). Verser une deuxième couche 15 mL au sommet de la première couche. Laisser solidifier du jour au lendemain, enlever la condensation de couvercles si nécessaire en l’essuyant avec un chiffon non pelucheux.
2. Repérer les Biofilms de colonie
   1. Ensemencer les souches d’intérêt provenant des stocks du congélateur sur LB agar plaques¹³ et incuber dans l’obscurité pendant 12 à 16 h à 37 ° C et 80-100 % d’humidité relative.
   2. Pour chaque souche ou reproduire, utiliser une seule colonie pour ensemencer 2 mL de LB et incuber dans l’obscurité pendant 12-16 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
   3. Sub culture par dilution au 1/100 en frais LB et en laissant incuber dans l’obscurité pendant 2,5 à 3 h à 37 ° C sous agitation à 250 tr/min.
   4. Mesurer la densité optique à l’aide d’un spectrophotomètre et ajuster avec LB stérile pour obtenir une suspension de cellules avec une OD_{500 nm} de ~ 0,5.
   5. Selon la colonie désirée taille, ajouter 2,5-10 µL de la suspension de cellules sur une plaque de médium-bicouche (préparée à l’étape 1.1) et permettent la tache sécher pour environ 20 min. laisser le couvercle petri ajar près d’une flamme peut faciliter le séchage.
   6. Incuber le spots colonies à 25 ° C et 80-100 % d’humidité relative, dans l’obscurité pendant 4 jours.

2. préparation de la Solution de fixation

1. Préparer la solution de fixation sur le jour de la récolte d’échantillon. Diluer les 37 % de formaldéhyde (FA) dans du PBS 1 x à une concentration finale de 4 % FA.
   ATTENTION : FA est volatile et toxique. Porter un équipement protecteur et travailler sous une hotte ventilée.
2. Immédiatement avant l’utilisation, dissoudre le chlorhydrate de L-lysine dans 4 % FA (préparé à l’étape 2.1) à température ambiante pour une concentration finale de 50 mM de L-lysine HCl.

3. Application du fixateur à la colonie de Biofilm [facultatif] directe

NOTE : Nous avons trouvé que le biofilm morphologie est mieux conservée lors de la superposition d’agar est ajoutée avant la fixation. Toutefois, cette étape constitue également un changement dans les conditions environnementales qui pourraient influer sur l’expression des gènes. Modèles d’expression de journaliste fluorescent devraient donc être vérifiées en utilisant un protocole distinct dans lequel l’étape de la fixation est effectuée avant l’ajout de la superposition d’agar, comme décrit ici.

1. Le jour de la fixation et de travailler sous une hotte ventilée, pipette le fixatif préparé à l’étape 2 directement sur la surface de la gélose autour de la colonie, lui permettant d’atteindre la périphérie de la colonie sans submergeant. Ne s’appliquent que comme beaucoup le fixateur qu’est nécessaire pour pleinement entourent la colonie, environ 500 µL. permettre le fixateur de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.
2. Une fois que le fixateur a été complètement absorbé dans la colonie et les médias environnants, environ 20-30 min, et FA résiduelle n’est plus visible sur la plaque, répétez l’étape 3.1. Laissez ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante.
3. Une fois que le fixateur est entièrement absorbé par la colonie et les environs media Répétez l’étape 3.1, ce moment appliquer fixateur sur la surface de la colonie directement. Permettre ce fixatif de diffuser dans la colonie et l’agar environnante, procéder à l’étape 4 seulement après tout fixateur a été absorbée et n’est plus visible sur la plaque.

4. recouvrement des Colonies avec Agar

1. Le jour de la fixation, préparer un 10 g/L de solution d’agar dans l’eau désionisée et stériliser pendant 10-20 minutes pour dissoudre. Laisser refroidir dans un bain d’eau à 50 ° c.
2. Verser doucement 15 mL de la solution d’agar sur le milieu de croissance et de la colonie. Permettre l’agar pour former un gel à température ambiante pendant 5 min (Figure 1 b).
3. Utiliser une lame de rasoir tranchante pour couper un mandrin carré, 3 couches avec la colonie laminée entre les couches supérieures de deux. Si vous préparez plusieurs échantillons, veiller à ce que chaque découpe est de taille comparable.
4. Délicatement enlever excès agar du mandrin contenant de colonie.
5. Pour soulever les deux couches supérieures de la gélose (contenant la colonie) loin de la couche de fond du mandrin (Figure 1), mouiller la tête plate d’une spatule en 1 x PBS ou eau et insérez délicatement entre les couches supérieures et inférieures. La colonie feuilletée devrait séparer de la couche inférieure. Veillez à ne pas déformer ou plier la colonie feuilletée en soulevant de sa base.

5. fixation

1. Travailler sous une hotte ventilée, transférer immédiatement la colonie feuilletée (c.-à-d., 2 couches chuck) dans une cassette d’encastrement (voir Table des matières), marquées avec un stylo de marquage résistant aux produits chimiques. Placez la cassette d’encastrement dans une enveloppe de lame de verre (voir table des matières) contenant le fixatif préparé en étapes 2.1-2.2. Assurez-vous qu’il n’y a aucune bulle d’air emprisonné à l’intérieur de la cassette d’encastrement.
2. Incuber l’échantillon dans le fixateur pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante.

6. traitement : Tampon de lavage, la déshydratation, compensation et Infiltration

1. Après fixation au jour le jour, laver l’échantillon deux fois dans du PBS 1 x 1 h chaque. Pour de meilleurs résultats, automatiser l’homogénéisation de réactif à l’aide de la vrille fonction d’un processeur de tissu automatique (voir table des matières) réglée sur un réglage bas. Si aucun processeur n’est disponible, le traitement peut être exécuté manuellement.
2. Suivez le tampon de lavage par déshydratation à travers une série graduée de solutions dans l’éthanol (EtOH) dans du PBS 1 x (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) pendant 1 h à température ambiante chaque.
3. Déshydrater en trois lavages de 100 % EtOH pour chacune 1 h à température ambiante.
4. Désactivez l’échantillon déshydraté en trois lavages d’agent de compensation de base d’huile orange 100 % (voir tableau des matériaux) pour 1 h à température ambiante.
5. Infiltrez l’échantillon dégagé deux fois avec de la paraffine fondue de cire (voir Table des matières), chauffé à 55 ° c, pendant 2 heures chacun.

7. échantillon incorporation

1. Remplissez un moule en cire de paraffine liquide chauffé à 55 ° c. Utilisez une spatule plate, chauffée permet de transférer rapidement le mandrin infiltré de la cassette d’encastrement dans le moule de cire, en veillant à ce que le mandrin est parallèle à la base du moule. Ne pas appliquer une pression excessive sur le mandrin. Moules de cire peuvent être personnalisé 3D imprimée, ou sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
2. Laisser la cire se solidifier durant la nuit à 4 ° c. Moulé dans la cire solide des échantillons peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c.
3. Une fois la cire a solidifié, l’échantillon du moule de l’accise et couper l’excès de cire d’autour de l’échantillon avec une lame de rasoir. Laissez les excès de cire qui s’étend d’un bout de l’échantillon, parallèle au plan de coupe, qui peut servir à fixer dans le microtome (voir Table des matières). Également laisser une gaine de cire, d’environ 1 mm d’épaisseur, autour de l’échantillon et lisser ses faces.

8. découpe

1. Faire chauffer un bain d’eau à 42 ° c. Serrer l’échantillon dans le microtome à la surface de la colonie orientée perpendiculairement au bord de la lame (voir Table des matières).
2. Couper l’échantillon à des intervalles de 50 µm jusqu'à ce que le plan désiré de la colonie a été atteint, d'où sections seront recueillies.
3. Couper un ruban le nombre désiré de coupes 10 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome, affectez une sectionnement vitesse de 75 à 80 tr/min et un angle de dégagement de 6-10 °. Utilisez un pinceau à pointe fine pour détacher le ruban de la lame.
4. À l’aide d’une goutte d’eau à l’extrémité d’une pipette Pasteur (de préférence) ou une pince, transférer doucement le ruban à l’eau du bain. Veillez à éviter les bulles d’air de piégeage en vertu de la section.
5. Immédiatement, insérer une diapositive dans le bain-marie et positionnez-le sous le ruban à un angle de 45˚.
6. Appuyer sur le côté étroit du ruban pour la diapositive, juste en dessous de l’étiquette givré. Le ruban doit respecter.
7. Tirer la lame sortant du bain d’eau, réglage de l’angle de devenir perpendiculaire à la surface de l’eau et en permettant le ruban à plat contre la lame sur toute sa longueur. Ne pas emprisonner l’eau en excès sous le ruban.
8. Doucement, se tiennent le glisser sur un tissu absorbant pelucheux, évacuant l’excès d’eau dans la section.
9. Poser la culasse sur du papier absorbant et laissez-les sécher à température ambiante pendant la nuit dans l’obscurité. Diapositives peuvent être conservés indéfiniment à 4 ° c dans l’obscurité.

9. fixation des chaleur, réhydratation et montage

1. Faire chauffer une plaque chauffante nivelée à 45 ° c. Faire chauffer la lame pendant 30-60 min. La cire deviendra semi fondue et aplatir contre la lame porte-objets.
2. Doucement soulever le glissement de la plaque chauffante et posez-le à plat sur une surface lisse, nivelé, température ambiante, à l’aide de soin de veiller à ce que la cire fondue ne tire pas de part et d’autre de la glissière, jusqu'à ce que la cire solidifie (~ 1 min).
3. À l’aide d’une enveloppe de lame de verre, cire hors de diapositives dans quatre lavages de clearing agent de 5 min chacun, à l’aide d’un aspirateur de Büchner pour enlever la solution entre les lavages.
4. Laver les lames trois fois en 100 % EtOH pendant 1 min chaque.
5. Réhydrater les lames dans une série graduée de l’éthanol dans l’ordre inverse du traitement (95 %, 70 %, 50 % et 25 %) pendant 1 min, que chacune suivie de deux lavages 1 min dans du PBS 1 x.
6. Montez immédiatement les sections dans un milieu de montage tampon Tris (voir Table des matières) et appliquer un lamelle couvre-objet, en évitant l’introduction de bulles d’air. Permettre aux milieu de montage polymériser pendant une nuit à température ambiante.
7. Une fois polymérisé, scellez la lamelle couvre-objet sur la diapositive à l’aide de vernis à ongles transparent. Scellé de diapositives peuvent être conservés indéfiniment dans l’obscurité à 4 ° c.

Résultats

Cette méthode génère minces biofilm dans lequel des caractéristiques morphologiques distinctes et les zones d’expression de gène peuvent être photographiées par DIC, microscopie à fluorescence et TEM. Alors que l’imagerie DIC utilisant un 40 X objectif à immersion d’huile peut être suffisant pour montrer certaines caractéristiques morphologiques (Figure 2E), nous avons trouvé cette fluorescence microscopie des souches machinés pour protéin...

Discussion

Des échantillons de tissus enrobage de paraffine et de coupes minces est une technique histologique classique qui permet l’imagerie des structures micro-morphologiques et est couramment utilisée sur les tissus eucaryotes et a été appliquée avec succès aux échantillons microbiens^{8 ,},⁹. Cryoinclusion permet à forte rétention de signal endogène et par immunofluorescence, enrobage de paraffine est généralement préférable car il fournit la meilleure p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 3/4" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A	Purchased from univeristy biostores
Agar	Teknova	A7777
Buchner Aspirator (Vacuum) Flask	Pyrex	5340	Purchased from univeristy biostores
Chemically-resistant Marking Pen	VWR	103051-182	Manufacturer: Leica
Clear Fingernail Polish	********	********	Store bought
Congo Red Indicator Grade	VWR	AAAB24310-14	Manufacturer: Alfa Aesar
Coomassie Blue	VWR	EM-3340	Manufacturer: EMD Millipore
TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)	Fisher Scientific	50 247 04	Manufacturer: Electron Microscopy Sciences
Embedding Mold	********	********	3D printed in-house
Embedding Mold (commercial)	Electron Microscopy Sciences	70182
Ethanol 200P	Decon Labs, Inc.	2701	Purchased from univeristy biostores
Fine-tipped Brush	********	********	Store bought, paint brush
Glass Coverslips 60x22mm	Fisher Scientific	12-519-21C
Glass Rehydration Mailer	Ted Pella	21043	20 slide mailer
Histoclear-II, orange oil-based clearing agent	Fisher Scientific	50 899 90150	Manufacturer: National Diagnostics
Histosette, Embedding Casette	Fisher Scientific	15 182 701A
L-lysine hydrochloride	Fisher Scientific	BP386 100
Low Profile Microtome Blades	Fisher Scientific	22 210 048	Manufacturer: Sturkey
Micropipette	VWR	89080-004	Promo-pack
Micropipette Tips	See comments section	See comments section	p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)
Microtome	Fisher Scientific	905200U/00016050	Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050
Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)	Ricca Chemical	RSOF0010-500A
Paraplast Xtra (paraffin wax)	VWR	15159-486	Manufacturer: McCormick Scientific
Petri Dishes Square 100x100x15mm	Laboratory Disposable Products	D210-16
Potassium chloride	EMD Chemicals	PX1405-1	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Potassium phosphate	Fisher Scientific	P380-500	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Razor Blades	VWR	55411-050	Purchased from univeristy biostores
Slide Warmer	Fisher Scientific	NC0865259	NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D
Sodium chloride	VWR	0241-1KG	Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Sodium phosphate	VWR	BDH9296.500	,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house
Suprafrost Histology Slides	Fisher Scientific	12-544-2
Tissue Flotation Water Bath	Fisher Scientific	NC0815797	Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B
Automatic Tissue Processor	Fisher Scientific	813160U/Q#00009061	Model: STP120 Tissue Processor
Tryptone	Teknova	T9012
Yeast extract	Teknova	Y9010