JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لبعض المرضى، الخيار الوحيد للحفاظ على خصوبة تجميد أنسجة المبيض. ولسوء الحظ، تأخر عودة التوعي يقوض سلامة الحبيبي. نقدم هنا، بروتوكولا للمشترك وزراعة أنسجة المبيض البشرية مع خلايا بطانية لنضح استخدامها كاستراتيجية تستند إلى خلية الجمع بين تسارع بتسليم paracrine مباشرة من الجزيئات النشطة بيولوجيا.

Abstract

العقم أحد آثار الجانبية شيوعاً للعلاج الكيميائي و/أو العلاج الإشعاعي، وبعض المرضى، ونعد من بويضات أو أجنة ليس خياراً. وكبديل لذلك، يتم اختيار عدد متزايد من هؤلاء المرضى أنسجة المبيض أوتوجرافت كريوبريسيرفي عقب التعافي والمغفرة. وعلى الرغم من التحسينات في النتائج بين المرضى الذين يخضعون لصناعة السيارات في زرع أنسجة المبيض cryopreserved، عودة التوعي كفاءة الأنسجة المطعمة لا يزال عقبة رئيسية. للتخفيف من الاسكيمية، وبالتالي تحسين النتائج في المرضى الذين يخضعون لصناعة السيارات في زرع، علينا وضع استراتيجية يستند إلى الخلية الأوعية الدموية للتعجيل نضح أنسجة المبيض. يصف لنا طريقة لزرع خلايا بطانية خارجية (المدراء) المشارك مع أنسجة المبيض cryopreserved في نموذج إكسينوجرافت ماوس. نتقدم بهذا النهج لتوظيف المدراء التي تم إجراء هندسة عكسية لﻹعراب مؤثرا Mullerian مكافحة هرمون (عمه)، مما مكن المطرد paracrine إشارة الإدخال ترقيع المبيض. زرع التعاون مع المدراء وزيادة الحجم الحبيبي وجريب antral تحسين التنمية، وتشجيع المدراء معربا عن عمه الاحتفاظ بالمسام البدائية هادئة. قد تكون هذه الاستراتيجية الموحدة أداة مفيدة للتخفيف من الاسكيمية، وتحوير جرابي التنشيط في السياق الحفاظ على الخصوبة أو العقم بوجه عام.

Introduction

السرطان لا يزال من بين الأسباب الرئيسية للوفاة في العالم المتقدم النمو، بعد عقود من البحث قد أسفرت عن تقدم كبير لمعظم أنواع السرطان، وفي بعض الحالات تضاعف تقريبا بقاء معدلات1. ولسوء الحظ، وكلاء العلاج الكيميائي غالباً جونادوتوكسيك، استنفاد احتياطي المسام البدائية في المبايض وتقليل الخصوبة2. هذا النمو السكاني يمكن أن تستفيد من أساليب مختلفة للحفاظ على الخصوبة، بما في ذلك تجميد البويضات و/أو الجنين، غير أن المرضى الذين يحتاجون إلى البدء فورا بعلاج السرطان والمرضى قبل البلوغ غير مؤهلة لهذه الخيارات. وكبديل لذلك، اختارت بعض المرضى كريوبريسيرفي أنسجة المبيض قبل القيام نظام علاجي، وبعد شفائهم والمغفرة، السيارات زرع الأنسجة لاستعادة الخصوبة3. حتى الآن، وحتى الآن، بقاء الفساد وإخراج الحبيبي بعد صناعة السيارات في زرع تظل منخفضة نسبيا4، أساسا بسبب الأنسجة الاسكيمية، ونقص5،،من67. على الرغم من العديد من الجهود لتحسين جدوى ترقيع القشرية المبيض باستخدام مضادات الأكسدة8،9، برو-الأوعية السيتوكينات10،،من1112،1 3، أو التلاعب الميكانيكية14، الاسكيمية الاختلاس في يوم 5 إلى 7 نافذة بعد انتهاء عملية زرع يقوض سلامة وبقاء الفساد7. لمعالجة هذه المشكلة، قمنا بتطوير استراتيجية تستند إلى خلية تيسير ملامسة الأوعية المضيفة والاختلاس وهكذا يعجل ضخه أنسجة المبيض.

بالإضافة إلى إهانة الدماغية لانسجة المبيض المطعمة في إطار ما بعد زرع الأعضاء، قد تعطل إشارات بين جرابي تسهم في استنفاد تجمع15،16. لخلايا بطانية خارجية (المدراء) تسهم في سفن مستقرة وتعمل في محيط الاختلاس، أنها تتيح فرصة فريدة ينقل من مدخلات جزيئية محددة لزرع الأنسجة. كدليل على المبدأ، كانت المهندسة المدراء لمستويات هرمون موليريان المضادة (عمه)، عضو تحويل فوق عائلة بيتا (TGFβ) عامل النمو التي أظهرت إلى تقييد النمو الحبيبي17إكسبريس فائقة الفسيولوجية. يتحقق مقارنة التوزيع الحبيبي في الطعوم زرع يشترك مع خلايا معربا عن عمه ومراقبة النشاط البيولوجي وقوتها من المدراء هندسيا.

في ملخص، بتحسين تعبئة الاختلاس سابق لأوانه البقاء وقمع تجمع جرابي، هذا النهج يمكن زيادة إنتاجية السيارات زرع أنسجة المبيض في المرضى الذين يخضعون للحفاظ على الخصوبة. وعلاوة على ذلك، يتيح منصة المستندة إلى ExEC الاستجواب التجريبية من المنظمين الجزيئية التي تورطت في التنمية جرابي.

Protocol

جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان أقرها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في كلية طب ويل كورنيل. أجريت جميع التجارب السلالة استخدام أنسجة المبيض وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. وجمعت أنسجة المبيض البشرية من المرضى المقرر للعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي لعلاج السرطان أو زرع النخاع العظمى السابقة. وأقر المجلس الاستعراض المؤسسي (IRB) "اللجنة من كلية ويل كورنيل الطبية" جمع الأنسجة للاستخدام الذاتي المحتملة، وبناء على الموافقة المستنيرة للمريض تبرع لتصل إلى 10% على أنسجة المبيض لاستخدام البحوث أجريت.

1-جمع أنسجة المبيض البشرية

ملاحظة: عندما يتم نقل أنسجة المبيض من عبور مرفق بعيد، إلا يتجاوز الوقت18،5 ح19.

  1. جمع أنسجة المبيض وشطف مع محلول الملحي معقم.
  2. مكان المبيض في حاوية معقمة.
  3. صب المتوسطة L-15 ليبوفيتش في حتى المبيض هي مغمورة تماما في الأجل المتوسط.
  4. إغلاق وختم الحاوية.
  5. نقل الحاوية على الجليد.

2-تجهيز أنسجة المبيض المشتراة، مقتبس من شميت et al. 18

  1. الأعمال التحضيرية لتجهيز وتجميد المبيض
    1. إعداد 100 مل متوسطة لتجهيز: L-15 المتوسط مل 99 + 1 مل الحل في ليبوفيتش مضاد حيوي فطري. تصفية وسائل الإعلام استخدام 0.2 ميكرون فلتر. الاحتفاظ متوسط المبردة.
    2. تحضير 100 مل من تجميد الحل باستخدام [دمس] cryo-protectant. إضافة مل 69.64 ليبوفيتش L-15 المتوسطة، مل 17.66 الجنيني البقري مصل (FBS)، ز 3.42 السكروز (لإنشاء نهائي تركيز 0.1 مول/لتر)، مل 10.65 [دمس] (لخلق تركيز نهائي 1.5 مول/لتر)، وحل مضاد حيوي فطري 1 مل. تصفية المتوسطة استخدام وحدة تصفية 150 مل، 0.2 ميكرون. مخزن المتوسطة عند 4 درجة مئوية.
    3. تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام اﻷوتوكﻻف المبرمجة لدورة تعقيم المواد صلبة الملتفة.
  2. ولدى وصوله من الأنسجة
    1. مجموعة الأدوات الجراحية المعقمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء: المقص مشرط مع شفرة رقم 21، غرامة منحنى حاد والملقط في أحجام متنوعة: منذ فترة طويلة (حوالي 150 مم طول) و 2 متوسطة الحجم (حوالي 110 مم طول).
    2. ارتداء القفازات المعقمة، فتح الحاوية داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. تأخذ المبيض ووضعه في 150 مم طبق بيتري وصب الباردة المتوسطة أعد الخطوة 2.1.1 أعلى المبيض لمنع جفاف أنسجة المبيض.
    3. عزل المبيض من أي الأنسجة المتبقية وشطفه مع المتوسطة الباردة حتى أنها تخلو من الدم والأنسجة.
    4. مكان المبيض في تنظيف 150 مم طبق بيتري، إضافة الباردة متوسطة، أعد الخطوة 2.1.1 حتى المبيض نصف المغمورة في ذلك.
  3. تشريح أنسجة المبيض
    1. تقسم المبيض وإزالة لب أولاً بتشريح حاد، استخدام مقص غرامة منحنية. ثم تتخلص من لب بعيداً، باستخدام مشرط معقم مع شفرة رقم 21. تسبق حتى الأنسجة القشرية 1-1.5 مم في السمك.
    2. قطع الأنسجة القشرية إلى شظايا من 2-3 مم في العرض، سيكون طول الشريط على طول قطعة المبيض التي تمت معالجتها.

3. تجميد المبيض أنسجة بطيئة، ومواءمة من نيوتن وآخرون. واوكتاي et al. 6 , 20

  1. إعداد لتجميد
    1. قم بتسمية كريوفيالس (1.8 مل).
    2. إضافة 1.5 مل من تجميد الحل أعد الخطوة 2.1.2 لكل قنينة.
    3. نقل قطاع القشرية واحد كل قنينة المبردة التي تتضمن تجميد الحل.
    4. حجته في قطاع القشرية لمدة 20 دقيقة على لوحة الدورية، وتطبيق الانفعالات لطيف في 4 درجات مئوية.
  2. تجميد بطيء من أنسجة المبيض
    1. تحميل كريوفيالس في ثلاجة القابلة لبرمجة استواء بدءاً من 0 درجة مئوية.
    2. كول في الدقيقة 2 درجة مئوية إلى-7 درجة مئوية.
    3. الحفاظ على الأنسجة في هذا درجة حرارة ثابتة لمدة 10 دقائق.
    4. أداء البذر اليدوي للجليد كريستال التنو التعريفي، وقبل لمس كل كريوفيال مع تلميح القطن مغمورة في سائل النيتروجين (LN2).
    5. لا تزال باردة في 0.3 درجة مئوية/دقيقة حتى تصل درجة حرارة العينة إلى-40 درجة مئوية.
    6. بارد بمعدل أسرع من 10 درجة مئوية/دقيقة إلى-140 درجة مئوية.
    7. نقل كريوفيالس إلى ديوار للتخزين في LN2 (-196 درجة مئوية).

4-التحضير للعمليات الجراحية (Oophorectomy الثنائية وزرع المشارك)

  1. إعداد لوحات
    1. يوم واحد قبل ذوبان الجليد في أنسجة المبيض لزرع الأعضاء
      1. ضع قطعة من فيلم البارافين البلاستيك في الجزء السفلي من 50 ملم طبق بيتري، رش عليه مع 70% إيثانول حتى أنها سوف تكون مغطاة بالكامل.
      2. اترك أطباق بيتري بين عشية وضحاها في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. إعداد أطباق بيتري 2 للماوس.
    2. في اليوم من العمليات الجراحية
      1. نضح الإيثانول من طبق بتري يحتوي على الفيلم البارافين البلاستيك داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
      2. ترك الرصاص طبق بيتري نصف مفتوحة حتى يتبخر الإيثانول تماما.
      3. أغلق غطاء صحن بيتري عندما يكون الفيلم البارافين بلاستيكية جافة تماما. يبقيه في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
      4. كذلك لوحة تسمية الآبار 6 تبعاً لذلك، 0.1 mol/L السكروز + 1 مول/لتر [دمس], 0.1 mol/L السكروز + 0.5 mol/L [دمس], 0.1 mol/L السكروز، الأساسية ذوبان الحل (البنك التونسي للتضامن)، متوسطة.
  2. إعداد الحلول
    1. تحضير 100 مل من البنك التونسي للتضامن: L-15 ليبوفيتش في المتوسط 79 مل + مل FBS 20 حل مضاد حيوي فطري 1 مل. التصفية باستخدام نظام تصفية 0.22 ميكرومتر.
    2. إعداد 10 مل من البنك التونسي للتضامن مع 0.1 mol/L السكروز. مقياس 0.342 ز السكروز وإضافة 10 مل من البنك التونسي للتضامن إعدادها في الخطوة 4.2.1، أجيتاتي برفق حتى يذوب في السكروز تماما. تصفية تصفية الحل باستخدام المحاقن 0.22 ميكرومتر.
    3. إعداد الحلول وفقا الجدول 1. تغطية أنابيب تحتوي على [دمس] مع رقائق الألومنيوم. تبقى مبردة حتى الاستخدام.

5. ذوبان الجليد السريع أنسجة المبيض

  1. إخراج LN2 ديوار القنينة التي تحتوي على تجميد أنسجة المبيض ويبقيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.
  2. يمسح القنينة النظيفة باستخدام ورقة الأنسجة.
  3. تزج القنينة في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة حتى عن ' هو إذابة محتوى.
  4. فتح القنينة وقطاع القشرية في البئر الأولى التي تحتوي على 3 مل الحل الأول (0.1 mol/L السكروز + 1 mol/L [دمس]، أعد الخطوة 4.2.3).
    ملاحظة: جميع الخطوات التي تنطوي على فتح غطاء اللوحة سوف يتم تحت الاندفاق الصفحي.
  5. احتضان 6 لوحة جيدا على لوحة الدورية عند 4 درجة مئوية لأدنى 5 تبقى اللوحة تغطي برقائق الألومنيوم لهذه الخطوة.
  6. نقل قطاع القشرية في الثانية التي تحتوي على 3 مل الحل الثاني (0.1 mol/L السكروز + 0.5 mol/L [دمس]، أعد الخطوة 4.2.3).
  7. احتضان 6 لوحة جيدا على لوحة الدورية للانفعالات لطيف في 4 درجات مئوية عن 5 دقيقة تبقى اللوحة تغطي برقائق الألومنيوم لهذه الخطوة.
  8. نقل قطاع القشرية في البئر الثالثة، التي تتضمن 4 مل من محلول (البنك التونسي للتضامن مع 0.1 mol/L السكروز، أعد الخطوة 4-2-2).
  9. تبني على لوحة الدورية للطيف الانفعالات عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. نقل قطاع القشرية في مل 4 الذي يتضمن أيضا الرابعة من الحل (البنك التونسي للتضامن، أعد الخطوة 4.2.1).
  11. تبني على لوحة الدورية للطيف الانفعالات عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. نقل قطاع القشرية في مل 4 تحتوي أيضا على الماضي من البرد المتوسطة (أعد الخطوة 2.1.1). الحفاظ على أنسجة المبيض المذابة على الجليد حتى القيام بزرع الأعضاء.

6-تغليف أنسجة المبيض

  1. إعداد الحلول التالية
    1. إعداد 25 مل من mmol/لتر 20 حبيس العازلة في المالحة 0.9 في المائة. تصفية ومخزن في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد 1 مل كاكل2 في تركيز 1 mol/l. التصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد حل أسهم 50 ملغم/مل الفيبرينوجين
    1. أضف 1 غ الفيبرينوجين إلى 20 مل من mmol/لتر 20 حبيس العازلة في المالحة 0.9 في المائة عن طريق خلط الفيبرينوجين ببطء إلى حبيس مخزنة المالحة على مدى عدة ساعات على 37 درجة مئوية.
    2. قم بتسمية 1.7 مل أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي.
    3. تصفية الحل من خلال عامل تصفية حقنه 0.45 ميكرومتر، ومن ثم من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون.
    4. قاسمة الحل إلى 200 ميليلتر في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي ومخزن في-20 درجة مئوية.
  3. إعداد حل أسهم 100 ثرومبين U/mL
    ملاحظة: الحلول ثرومبين الجسميات للزجاج، الكوة الحل في أنابيب/قارورة من البلاستيك.
    1. إضافة 2.5 مل من 0.9% عقيمة المالحة إلى 250 يو من ثرومبين.
    2. لطيف يهز حتى الحل تذوب تماما.
    3. قم بتسمية 1.7 مل أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي.
    4. التصفية من خلال عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرومتر، الكوة ميليلتر 50 في أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي ومخزن في-80 درجة مئوية.
  4. جعل جلطة فيبرينوجين من 70 ميليلتر، الحصول على تركيز الفيبرينوجين 10 ملغ/مل و 5 U/mL ثرومبين النهائي
    ملاحظة: تأكد من أن تعمل بسرعة، جلطات الحل في بضع ثوان. أيضا، تجنب إضافة فقاعات إلى الخليط.
    1. تعد حلاً الفيبرينوجين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 1.7 مل.
      1. إضافة 360 ميليلتر من 20 ملمول/لتر حبيس المخزن المؤقت في المحلول الملحي 0.9 في المائة إلى ميليلتر 200 الكوتيد المخزون الفيبرينوجين، أعد الخطوة 6.2.4.
      2. مزيج من بيبيتينج لطيف.
      3. يبقيه على الجليد.
    2. تعد حلاً ثرومبين في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي ثاني.
      1. إضافة 148.7 ميليلتر من دميم إلى ميليلتر 50 اليكووتيد المخزون ثرومبين، أعد الخطوة 6.3.4.
      2. مزيج من بيبيتينج لطيف.
      3. إضافة 1.3 ميليلتر من 1 mol/L كاكل2.
      4. مزيج من بيبيتينج لطيف.
      5. يبقيه على الجليد.
    3. إعداد تعليق خلية مفردة، في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي ثالث.
      1. فصل خلايا بطانية هندسيا من لوحة استخدام وسيلة مفرزة إنزيم خلية.
      2. تدور إلى أسفل وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير مع زجاج الغطاء.
      3. استخدام خلايا 20,000 الواحدة كل 1 مم2 من أنسجة المبيض. حساب المجال س 20,000 أنسجة المبيض في مم2.
      4. تدور أسفل خلايا بطانية هندسيا وإعادة تعليق في المتوسطة الأساسية (دميم) للوصول إلى إجمالي حجم 16.8 ميليلتر.
      5. يبقيه على الجليد.
    4. ضع قطعة من أنسجة المبيض في الأسفنج شاش معقم الجافة لبضع ثوان.
    5. ضع قطعة أنسجة المبيض على رأس الفيلم البارافين البلاستيك داخل 50 مم طبق بيتري.
    6. إضافة ميليلتر 39.2 الحل الفيبرينوجين، أعد الخطوة 6.4.1.2، في تعليق خلية إعدادها في الخطوة 6.4.3.4، مزيج من بيبيتينج لطيف. يبقيه على الجليد.
    7. إضافة ميليلتر 14 الحل ثرومبين إعدادها في الخطوة 6.4.2.4. المزيج بلطف بيبيتينج مرة واحدة. العمل بسرعة.
    8. ضع الخليط على رأس أنسجة المبيض، بيبيت في شكل الحبرية ممدود.
    9. ضع طبق بيتري مع الجلطة في الحضانة عند 37 درجة مئوية.

7-ثنائية Oophorectomy والمشارك زرع أنسجة المبيض البشرية مع خلايا بطانية هندسيا للفئران مجموعة موردي المواد النووية

ملاحظة: عشرة إلى أربعة عشر عاماً الأسبوع الإناث مجموعة موردي المواد النووية الفئران21 استخدمت (مختبرات جاكسون).

  1. إعداد الأدوات الجراحية كافة، كما هو موصوف في خطوة 2.1.3، تأكد من أن لديك كافة خيوط ومنصات والأشرطة الجراحية مفيد.
  2. تخدير الماوس باستخدام نظام تخدير مع إيسوفلوراني.
    1. ضع الماوس في قاعة التوجيهي وإغلاق غطاء وفتح محبس الحنفية المناسبة.
    2. مقياس التدفق مفتوحة إلى 1,000 مل/دقيقة تشغيل المبخر وتعيين من تقديم 2-3.5 في المائة.
    3. مراقبة آثار التخدير؛ فقدان الوعي، وبطيئة، ونفسا العادية.
    4. نقل إلى مخروط الآنف للمحافظة على التخدير. قم بتشغيل المرذاذ لتسليم 1-3 ٪، اعتماداً على العلامات الحيوية.
    5. التحقق من غياب منعكس دواسة أو الذيل. في حالة وجود المعاكسة، زيادة isoflurane حتى أنها غائبة.
  3. تقليم الشعر الخلفي الماوس، من الذيل حتى الخط ترقوة، استخدام المتقلب شعر كهربائية.
  4. ضع الماوس في موقف معرضة بشأن منهاج العمل الجراحي.
  5. إصلاح مخروط الآنف لمنهاج العمل الجراحي باستخدام شريط جراحية.
  6. الشريط أطرافه الماوس برفق لمنهاج العمل الجراحي باستخدام شريط 1.25 سم المنظومة جراحية ورقة.
  7. استخدام هلام زيوت تشحيم عقيمة وإدراج مقياس حرارة العلاقات العامة فيكس الترمومتر بتسجيل ذلك على منهاج العمل الجراحي باستخدام شريط جراحية بلاستيكية 1.25 سم مثقب.
  8. الشريط الذيل لمنهاج العمل الجراحي باستخدام شريط ورق واسعة جراحية 2.5 سم.
  9. الحرارة، استخدام الأشعة تحت حمراء أو لوح، تسخين مياه الساخنة، ورصد درجة حرارة الجسم للماوس طوال فترة الإجراءات. الحفاظ على درجة حرارة الجسم ضمن المجموعة من 35-37 درجة مئوية.
  10. تنظيف المنطقة المشذبة بعصا مسحه "حل" بوفيدون معقم والقضاء على استخدام الكحول العقيمة الإعدادية.
  11. كرر الخطوة 6.9 أكثر مرتين.
  12. وضع قطره مرهم العقيمة بيطري تشحيم العين أكثر من كل من العينين الماوس حمايتها من الجفاف وإلحاق الضرر بالقرنية.
  13. وتغطي ثني جراحية معقمة باستخدام الماوس.
  14. حقن البوبرينورفين (1 مغ/كغ) الجلدي الفرعي (S/C).
  15. تنفيذ شق الظهرية الآنسي طولي استخدام مشرط (بليد #21).
  16. أداء oophorectomy ثنائية، واستخدام نهج الظهرية.
    1. تحرير النسيج الضام تحت الجلد بالتشريح صراحة استخدام المقص.
    2. قرصه اللفافة أفقياً لجعل خط الوسط شق وتصل إلى التجويف البريتوني باستخدام مقص حاد.
    3. الاستيلاء على لوحة الدهون المبيض والمبيض بلطف مع ملاقط والخروج به من تجويف البطن.
    4. فهم المبيض ولوحة الدهون مع المشبك الأوعية الدموية.
    5. اضطر المبيض ولوحة الدهون باستخدام امتصاص شعيرات 4-0 في خياطة الجروح في قاعدة المبيض، البعيدة إلى أنبوب فالوب.
    6. مقطع المبيض القاصي بالتعادل. تأكد من أن هناك لا نزيف من قاعدة من عقب السيجارة.
    7. ضع الأنسجة مرة أخرى في تجويف البطن وخياطة اللفافة استخدام خياطة الجروح قابلة لامتصاص مزين 6-0.
    8. كرر 7.15.1-7.15.7 المراحل إلى جانب كونترالاتيرال.
  17. شارك زرع أنسجة المبيض.
    1. إجراء شق أفقي في اللفافة أعلاه مكسيموس عضلة، على طول الفترة التي تناسب أبعاد جلطات. إنشاء جيب داخل هذا الفضاء الافتراضي عن طريق فتح المقص تحت اللفافة.
    2. التقاط قطعة واحدة من الأنسجة القشرية المغلفة، كما أعدت في الخطوة 6.4.8 ووضعه في هذا الجيب.
    3. خياطة اللفافة استخدام 6/0 مزين خياطة قابلة للامتصاص.
  18. كرر 7.16.1-7.16.3 المراحل في الجانب كونترالاتيرال كذلك.
  19. إغلاق الجدار الظهرية استخدام غرز توقف بسيطة مع امتصاص شعيرات 4-0 في خياطة الجروح.
  20. حقن ليدوكائين 0.5% (1.2 مل/كغ) S/C في موقع شق.
  21. استخدام الإعدادية الكحول معقمة لتنظيف الجلد.
  22. إيقاف إيسوفلوراني في حين رصد درجة الحرارة للماوس.
  23. توفير دقيقة 1-2 س2، دون إيسوفلوراني. الحفاظ على الاحترار الماوس حتى يبدأ بالتحرك والعودة إلى وعيه.
  24. ضع الماوس في قفص انتعاش نظيفة وفي وقت لاحق منزل الماوس في قفص منفصل حتى اكتمال التئام الجرح الجراحي.
  25. حقن البوبرينورفين (1 مغ/كغ) S/C حسب الحاجة كل ح 8-12، 24 ساعة بعد.
  26. تبقى الفئران في أقفاص منفصلة عندما تكون جميع الأغذية والمياه، والأسرة، واقفاص يعقم، حتى نقطة النهاية في التجربة. تبقى في الأقفاص في غرفة مهواة مضغوط. استخدام معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع الفئران.

النتائج

لتحديد ما إذا كان زرع المشارك من المدراء يوفر فائدة للأنسجة المرضى، مقسمة إلى أجزاء متساوية الحجم شرائط القشرية المبيض المذابة وانجرافتيد على المستوى الثنائي في اختراق المناعية، مشمولان إيماءة غاما (مجموعة موردي المواد النووية)، الفئران. مع جانب واحد جزءا لا يتجزأ من ج?...

Discussion

هنا نثبت أن زرع المشارك من المدراء ويقدم فائدة كبيرة لبقاء أنسجة المبيض والدالة التالية إكسينوجرافت في الفئران. لم تكن معايير التطبيق السريري للسيارات-زرع أنسجة المبيض للمحافظة على الخصوبة مجموعة والمعلمات الأمثل (حجم وموقع الزرع ومدة الاختلاس، إلخ.) 32 , ...

Disclosures

مايكل غينسبرغ هو موظف أنجيوكريني العلوم, Inc.، سان دييغو، كاليفورنيا، 92130، الولايات المتحدة، عزل، transfected مع الفئة هاء-4-ORF-1 والمسماة خلايا بطانية استخدمنا.

Acknowledgements

عمر الرجل ألكسندر للرسوم التوضيحية.
ل. م. وأيده على "جائزة الطيار" من "السريرية كورنيل" ويشغل مركز العلوم وتصريح البحوث منحة.
المؤلف يود أن يشكر أعضاء المختبر جيمس لقراءة نقدية من المخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 mediumGibco11415064
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062Anti-Anti X100
SucroseSigmaS 1888
FibrinogenSigmaF 8630from bovine plasma
ThrombinSigmaT 1063from human plasma
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastic paraffin filmBemis NAParafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm3M1530-1Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm3M1530-0Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Absorbable SutureCovidienUM-203Biosyn
Braided Absorbable SutureCovidienGL-889Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine Solution Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
sterile ocular lubricantDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Anasthesia systemVetEquipV-1 table top system with scavenging
Endothelial cellsAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stainSigmaHT15-1ktTrichrome Stain (Masson) Kit
IsolectinInvitrogenI32450isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology?. Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved