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Resumo

Para alguns pacientes, a única opção para preservação de fertilidade é a criopreservação de tecido ovariano. Infelizmente, revascularização atrasada prejudica a viabilidade folicular. Aqui, apresentamos um protocolo para co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais para utilização como uma estratégia baseada em célula combinando acelerada perfusão com uma entrega parácrina direto de moléculas bioativas.

Resumo

Infertilidade é um efeito colateral frequente da quimioterapia e/ou radioterapia e para alguns pacientes, criopreservação de oócitos ou embriões não é uma opção. Como alternativa, um número crescente destes pacientes está optando por cryopreserve tecido ovariano para autoenxerto após recuperação e remissão. Apesar das melhorias em termos de resultados entre os pacientes submetidos a autotransplante de tecido ovariano criopreservado, revascularização eficiente do tecido enxertado continua a ser um grande obstáculo. Para atenuar a isquemia e, assim, melhorar os resultados em pacientes submetidos a autotransplante, desenvolvemos uma estratégia baseada em célula vascular para acelerar a perfusão do tecido ovariano. Nós descrevemos um método para co transplante de células endoteliais exógenas (executivos) com tecido ovariano criopreservado em um modelo de enxerto heterólogo do rato. Estendemos essa abordagem para empregar os executivos que têm sido projetados para expressar constitutivamente hormônio Anti-Mulleriano (AMH), permitindo assim sustentada parácrina sinalizando a entrada para enxertos ovarianos. Transplante co com executivos aumentou volume folicular e desenvolvimento folicular antral melhorada e AMH-expressando executivos promovido retenção dos folículos primordiais quiescentes. Essa estratégia combinada pode ser uma ferramenta útil para atenuar a isquemia e modulando a ativação folicular no contexto da preservação da fertilidade e/ou infertilidade em geral.

Introdução

Câncer permanece entre as principais causas de morte no mundo desenvolvido, no entanto, décadas de pesquisa produziram um progresso significativo para a maioria dos tipos de câncer e em alguns casos quase duplicou de sobrevivência taxas1. Infelizmente, agentes quimioterapêuticos são frequentemente gonadotoxic, esgotando a reserva de folículos primordiais nos ovários e redução da fertilidade2. Este crescimento da população pode se beneficiar de vários métodos de preservação da fertilidade, incluindo criopreservação de ovócitos e/ou embrião, no entanto, pacientes que necessitam de iniciação rápida da terapia do câncer e pacientes pré-púberes são inelegíveis para essas opções. Como alternativa, alguns pacientes têm escolhido para cryopreserve tecido ovariano, antes de empreender o seu regime terapêutico e sobre recuperação e remissão, autotransplante de tecido para restaurar a fertilidade3. Ainda, até à data, sobrevivência do enxerto e folicular saída seguindo autotransplante permanecem relativamente baixos4, principalmente devido ao tecido isquemia e hipóxia5,6,7. Apesar de inúmeros esforços para melhorar a viabilidade do enxerto cortical ovariana usando anti-oxidantes8,9, pro-angiogênico citocinas10,11,12,1 3, ou manipulações mecânicas14, isquemia de enxerto em pós-transplante uma janela de 5 a 7 dia põe em causa a viabilidade e sobrevivência do enxerto7. Para resolver isso, nós desenvolvemos uma estratégia baseada em célula para facilitar a anastomose dos vasos host e enxerto e, portanto, apressar a reperfusão do tecido ovariano.

Além o insulto isquêmico ao tecido ovariano transplantado na janela pós-transplante, o rompimento de sinalização inter folicular pode contribuir ao esgotamento do pool15,16. Porque as células endoteliais exógenas (executivos) contribuem para navios estáveis e funcionando na periferia do enxerto, eles apresentam uma oportunidade única para transmitir uma entrada molecular definida para tecido transplantado. Como prova de princípio, os executivos foram projetados para níveis expressam super fisiológicos do hormônio Anti-Mulleriano (AMH), um membro da superfamília transformadora para a beta (TGFβ) fator de crescimento que tem sido mostrado para restringir o crescimento folicular17. Comparação da distribuição folicular em enxertos co transplantado com células AMH-expressando e controle verifica a atividade biológica e a potência de executivos de engenharia.

Em resumo, melhorando o enxerto viabilidade e suprimindo a mobilização precoce do pool folicular, esta abordagem pode aumentar a produtividade de autotransplante de tecido ovariano em pacientes submetidos à preservação da fertilidade. Além disso, a plataforma baseada em ExEC permite interrogatório experimental de reguladores moleculares que têm sido implicados no desenvolvimento folicular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) no Weill Cornell Medical College. Todos os experimentos xenotransplante usando tecido ovariano foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes. Tecido ovariano humano foi coletado de pacientes agendados para quimioterapia ou radioterapia para tratamento de câncer ou transplante de medula de óssea prévia. O Conselho de revisão institucional (IRB) Comitê de Weill Cornell Medical College aprovou a coleção de tecidos para potencial uso autólogo e mediante o consentimento informado do paciente, que realizou-se uma doação de até 10% de seu tecido ovariano para uso de pesquisa.

1. coleção de tecido ovariano humano

Nota: Quando um tecido ovariano é transportado de um trânsito de instalação remota, tempo não deve exceder 5 h18,19.

  1. Coletar o tecido e lave com uma solução salina estéril.
  2. Lugar do ovário em um recipiente estéril.
  3. Despeje meio de Leibovitz L-15 até o ovário está completamente imerso no meio.
  4. Fechar e selar o recipiente.
  5. Transporte do contêiner em gelo.

2. processamento do tecido ovariano suprido, adaptado de Schmidt et al . 18

  1. Preparações para processamento e congelamento de ovário
    1. Preparar 100 mL de meio para processamento: L-15 médio 99 mL + 1 mL-antibiótico antimicótico solução do Leibovitz. Filtro de mídia usando o filtro de 0,2 µm. Manter o meio refrigerado.
    2. Prepare 100 mL de solução de congelação utilizando DMSO como um cryo-protetor. Adicionar L-15 médio, mL 17,66 fetal soro bovino do 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de sacarose (para criar uma concentração final de 0,1 mol/L), mL 10,65 DMSO (para criar uma concentração final de 1,5 mol/L) e 1 mL de solução de antibiótico antimicótico. Filtrar o meio usando uma unidade de filtro de 150 mL, 0,2 µm. loja a médio a 4 ° C.
    3. Esterilize os instrumentos cirúrgicos usando uma autoclave programada para um ciclo de esterilização de sólidos envolvidos.
  2. Após a chegada do tecido
    1. Definir os instrumentos cirúrgicos estéreis na biossegurança do armário: bisturi com número 21, de lâmina afiada bem curvado tesoura e pinça em variados tamanhos: longo (cerca de 150 mm de comprimento) e 2 médias (cerca de 110 mm de comprimento).
    2. Usar luvas estéreis, abra o recipiente dentro do armário de biossegurança. Leve o ovário e colocá-lo em uma placa de Petri de 150mm e despeje meio frio, preparado na etapa 2.1.1 no topo do ovário para prevenir a desidratação do tecido ovariano.
    3. Isolar o ovário de qualquer tecido residual e enxágue-o com meio frio até que é desprovida de tecido e sangue.
    4. Coloque o ovário em um limpo e 150 mm placa de Petri, acrescente frio médio, preparado na etapa 2.1.1 até o ovário é metade submersa nele.
  3. Dissecação do tecido ovariano
    1. Bissetriz do ovário e remover a medula primeiro por dissecação afiada, usando tesouras bem curvadas. Em seguida raspe a medula, usando um bisturi estéril com um número de lâmina 21. Preceda o tecido cortical até 1-1,5 mm de espessura.
    2. Corte o tecido cortical em rodelas de 2-3 mm de largura, o comprimento da tira será de todo o comprimento da peça no ovário que foi processada.

3. ovário tecido lenta, congelamento, adaptado de Newton et al. e. Oktay et al 6 , 20

  1. Preparação para o congelamento
    1. Etiqueta cryovials (1,8 mL).
    2. Adicione 1,5 mL da solução de congelação, preparada na etapa 2.1.2 a cada frasco.
    3. Transferi uma tira cortical por criogênico frasco contendo a solução de congelação.
    4. Equilibrar a tira cortical por 20 min em um prato giratório, aplicar agitação suave a 4 ° C.
  2. Devagar, congelamento de tecido ovariano
    1. Carregar o cryovials em um congelador programável plaina começando em 0 ° C.
    2. Cool na 2 ° C/min-7 ° c.
    3. Manter os tecidos a esta temperatura constante por 10 min.
    4. Realize a semeadura manual para indução de nucleação do gelo cristal, tocando cada cryovial com uma ponta de algodão imergida em nitrogênio líquido (LN2).
    5. Continuar esfriar a 0,3 ° C/min até a temperatura da amostra atinge a-40 ° C.
    6. Legal a um ritmo de 10 ° C/min de-140 º C.
    7. Transferência de cryovials para o dewar para armazenamento em LN2 (196 ° C).

4. preparações para as cirurgias (ooforectomia Bilateral e transplante co)

  1. Preparação das placas
    1. Um dia antes de descongelar o tecido para transplante
      1. Coloque um pedaço de um filme de plástico de parafina no fundo de um prato de Petri de 50 mm, pulverizá-la com 70% etanol até será completamente coberto.
      2. Deixe os pratos de Petri durante a noite a biossegurança do armário. Prepare 2 pratos de Petri por rato.
    2. No dia da cirurgia
      1. Aspire o etanol a partir da placa de Petri contendo o filme de plástico de parafina dentro do armário de biossegurança.
      2. Deixe o prato de Petri chumbo metade aberta até etanol evapora-se completamente.
      3. Quando o filme plástico da parafina é completamente seco, feche a tampa da caixa de Petri. Mantê-lo dentro da Biossegurança do armário.
      4. Poços de rótulo de um 6 bem placa conformemente, 0,1 mol/L de sacarose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L de sacarose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacarose, básico Thawing solução (BTS), médio.
  2. Preparação das soluções
    1. Preparar 100 mL de BTS: L-15 do Leibovitz médio 79 mL + FBS 20 mL + antibiótico antimicótico solução 1 mL. Filtrar com um sistema de filtro de 0,22 µm.
    2. Prepare-se 10 mL de BTS com 0,1 mol/L de sacarose. Escala 0,342 g de sacarose e adicionar 10 mL de BTS preparado no passo 4.2.1, agitar suavemente até a sacarose é completamente dissolvida. Filtre a solução usando uma seringa filtro de 0,22 µm.
    3. Prepare as soluções de acordo com a tabela 1. Cobrir os tubos contendo DMSO com folha de alumínio. Manter refrigerado até o uso.

5. tecido descongelamento rápido

  1. Tirar o LN2 dewar um frasco contendo congelado o tecido ovariano e mantê-lo em temperatura ambiente por 30 s.
  2. Limpe o frasco usando um papel de tecido.
  3. Mergulhe o frasco em um banho de água de 30 ° C para 1-2 min até seu ' conteúdo é descongelado.
  4. Abra o frasco e coloque a fita cortical no primeiro poço que contém 3ml da solução de primeira (0,1 mol/L de sacarose + 1 mol/L DMSO, preparado na etapa 4.2.3).
    Nota: Todas as etapas que envolvem abrir a tampa da placa serão feitas sob fluxo laminar.
  5. Incube a placa bem 6 sobre um prato giratório a 4 ° C por 5 min. Mantenha a placa coberta com papel alumínio para esta etapa.
  6. Transferi a faixa cortical para o segundo bem contendo 3 mL da solução de segunda (0,1 mol/L de sacarose + 0,5 mol/L DMSO, preparado na etapa 4.2.3).
  7. Incube a placa bem 6 sobre um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min. Mantenha a placa coberta com papel alumínio para esta etapa.
  8. Transferi a tira cortical para o terceiro poço, contendo 4 mL de solução (BTS com 0.1 mol/L de sacarose, preparada na etapa 4.2.2).
  9. Incube em um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min.
  10. Transferi a faixa cortical para o quarto bem com 4 mL de solução (BTS, preparado na etapa 4.2.1).
  11. Incube em um prato giratório para agitação suave a 4 ° C por 5 min.
  12. Transferi a faixa cortical para o último bem com 4 mL de meio frio (preparado na etapa 2.1.1). Mantenha o tecido ovariano descongelado no gelo até realizar o transplante.

6. encapsulamento do tecido ovariano

  1. Preparar as seguintes soluções
    1. Prepare-se 25 mL de tampão HEPES 20 mmol/L em soro fisiológico a 0,9%. Filtrar e armazenar a 4 ° C.
    2. Prepare-se 1 mL de CaCl2 na concentração de 1 mol/L. filtro e armazenar a 4 ° C.
  2. Prepare uma solução stock de 50 mg/mL de fibrinogênio
    1. Adicionar 1 g de fibrinogênio em 20 mL de tampão HEPES 20 mmol/L em solução salina 0,9%, lentamente, misturando fibrinogênio no HEPES tampão salino durante várias horas a 37 ° C.
    2. Rotule a 1,7 mL tubos de centrífuga de micro.
    3. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,45 µm e, em seguida, através de um filtro de seringa 0,2 µm.
    4. Alíquota da solução em 200 µ l no tubo de centrífuga de micro e loja a-20 ° C.
  3. Prepare uma solução stock de trombina 100 U/mL
    Nota: Soluções de trombina adsorver ao vidro, alíquota da solução em tubos/frascos plásticos.
    1. Adicione 2,5 mL de solução salina estéril 0,9% de 250 U de trombina.
    2. Agitar suave até a solução para dissolver completamente.
    3. Rotule a 1,7 mL tubos de centrífuga de micro.
    4. Filtrar com um filtro de seringa 0,2 µm, alíquota de 50 μL em tubos de centrífuga de micro e loja a-80 ° C.
  4. Fazer um coágulo de fibrina de 70 µ l, obtendo uma concentração final de 10mg/mL fibrinogênio e 5 U/mL trombina
    Nota: Certifique-se que trabalhar rápido, os solução de coágulos em poucos segundos. Além disso, evite a adição de bolhas para a mistura.
    1. Prepare uma solução de fibrinogênio em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      1. Adicionar 360 µ l de 20 mmol/L de HEPES Buffer em solução salina 0,9% para o aliquotadas 200 µ l do estoque de fibrinogênio, preparado na etapa 6.2.4.
      2. Misture pipetando suave.
      3. Mantê-lo no gelo.
    2. Prepare uma solução de trombina em um segundo tubo de centrífuga de micro.
      1. Adicionar 148.7 µ l de DMEM para o aliquotadas 50 µ l do estoque de trombina, preparado na etapa 6.3.4.
      2. Misture pipetando suave.
      3. Adicione 1,3 µ l de 1 mol/L de CaCl2.
      4. Misture pipetando suave.
      5. Mantê-lo no gelo.
    3. Prepare uma suspensão de célula única, em um tubo de centrífuga de micro terceiro.
      1. Separe as células endoteliais engenharia da placa usando um meio de desprendimento do celular de enzima.
      2. Spin para baixo o e contar as células usando um hemocytometer com um tampa de vidro.
      3. Use 20.000 células por cada 1 mm2 de tecido ovariano. Calcule 20.000 x área de tecido ovariano em mm2.
      4. Gire para baixo as células endoteliais engenharia e re-suspendê-lo em meio básico (DMEM) para alcançar um volume total de 16,8 µ l.
      5. Mantê-lo no gelo.
    4. Coloque um pedaço de tecido ovariano em uma compressa de gaze estéril para secá-la por alguns segundos.
    5. Coloque o pedaço de tecido ovariano em cima de filme plástico parafina dentro a 50 mm, placa de Petri.
    6. Adicione 39,2 µ l da solução de fibrinogênio, preparada na etapa 6.4.1.2, para a suspensão de células preparada na etapa 6.4.3.4, mistura pipetando suave. Mantê-lo no gelo.
    7. Adicione 14 µ l da solução de trombina, preparada na etapa 6.4.2.4. Misture suavemente pipetando uma vez. Trabalho rápido.
    8. Coloque a mistura em cima do tecido ovariano, pipeta sob a forma de uma gota alongada.
    9. Coloque a placa de Petri com o coágulo na incubadora a 37 ° C.

7. bilateral Oophorectomy e co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais projetados para ratos NSG

Nota: Dez a catorze semanas feminino NSG ratos21 foram usados (Jackson Labs).

  1. Preparar ferramentas tudo cirúrgicas, como elaborado na etapa 2.1.3, certifique-se de que você tem todas as suturas, almofadas e fitas cirúrgicas à mão.
  2. Anestesia o mouse usando um sistema de anestesia com isoflurano.
    1. Posicione o mouse na câmara de indução, feche a tampa e abra a torneira adequada.
    2. Medidor de fluxo aberto de 1.000 mL/min. Ligue o vaporizador e configurá-lo para entregar 2-3,5%.
    3. Observar os efeitos da anestesia; perda de consciência, lenta e respirações regulares.
    4. Transferir para o cone de nariz para manter a anestesia. Vire o vaporizador para entregar 1-3%, dependendo de sinais vitais.
    5. Verificar a ausência de reflexo de pedal ou cauda. Se o reflexo está presente, aumente o isoflurano até está ausente.
  3. Apare pelos de trás do rato, da cauda até a linha das clavículas, usando um aparador de pelos elétrico.
  4. Coloque o mouse em posição na plataforma cirúrgica.
  5. Fixe o cone de nariz à plataforma cirúrgica, usando um esparadrapo.
  6. Fita os membros do rato suavemente para a plataforma cirúrgica usando uma fita de papel cirúrgico de 1,25 cm de largura.
  7. Use uma geleia lubrificante estéril e inserir um termômetro PR. Fix o termômetro por filmá-lo para a plataforma cirúrgica usando uma fita cirúrgica plástica de 1,25 cm de largura perfurado.
  8. A cauda à plataforma cirúrgica por meio de uma fita de papel cirúrgico largura de 2,5 cm de fita.
  9. Calor, usando um infravermelho ou uma água quente, Aquecimento pad e monitorar a temperatura do corpo do rato ao longo do processo. Manter a temperatura corporal dentro da faixa de 35-37 ° C.
  10. Limpe a área aparada com um bastão de cotonete estéril solução de iodo-povidona e limpe usando prep álcool estéril.
  11. Repita a etapa 6,9 mais duas vezes.
  12. Coloque uma gota de pomada estéril vet lubrificante ocular sobre cada um dos olhos do rato, para proteger da desidratação e danificar a córnea.
  13. Cobrir o mouse usando um pano cirúrgico estéril.
  14. Injete buprenorfina (1 mg/Kg) sub-cutâneo (S/C).
  15. Realize uma incisão dorsal medial longitudinal utilizando um bisturi (lâmina #21).
  16. Executar uma ooforectomia bilateral, use uma abordagem dorsal.
    1. Livre do tecido conjuntivo subcutâneo por dissecção romba, usando a tesoura.
    2. Beliscar a fáscia lateralmente para fazer a linha mediana uma incisão e atingir a cavidade peritoneal, usando a tesoura afiada.
    3. Pegue do tecido ovariano e ovário delicadamente com uma pinça e retire-a na cavidade abdominal.
    4. Segure o ovário e a almofada de gordura com uma pinça vascular.
    5. Ligam o ovário e a almofada de gordura usando uma sutura de monofilamento de 4/0 na base do ovário, distal ao tubo de Falopio.
    6. Clip do ovário distal para o empate. Certifique-se que não há nenhum sangramento da base do coto.
    7. Coloque o tecido de volta na cavidade abdominal e sutura da fáscia usando uma sutura absorvível trançada de 6/0.
    8. Repita etapas 7.15.1-7.15.7 no lado contralateral.
  17. Co transplante de tecido ovariano.
    1. Realize uma incisão horizontal na fáscia acima nos glúteos, no comprimento que se encaixa as dimensões de coágulos. Crie um bolso dentro deste espaço virtual, abrindo a tesoura por baixo da fáscia.
    2. Pegue um pedaço de tecido cortical encapsulado, como preparado na etapa 6.4.8 e coloque-o no bolso.
    3. Sutura da fáscia usando um 6/0 trançado sutura absorvível.
  18. Repita etapas 7.16.1-7.16.3 no lado contralateral também.
  19. Feche a parede dorsal usando pontos interrompidos simples com uma sutura de monofilamento de 4/0.
  20. Injetar lidocaína 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C no local da incisão.
  21. Use um prep estéril de álcool para limpar a pele.
  22. Desligue o isoflurano enquanto monitora a temperatura do rato.
  23. Fornece 1-2 min do2, sem isoflurano. Manter por aquecimento o mouse até que ele começa a mover-se e retornar à consciência.
  24. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação limpo e mais tarde de casa o mouse em uma gaiola separada até a completa cicatrização da ferida cirúrgica.
  25. Injete buprenorfina (1 mg/Kg) S/C conforme necessário a cada 8-12 h, por 24 h no pós-operatório.
  26. Manter os ratos em gaiolas separadas, quando todos os alimentos, água, roupa de cama e gaiolas são autoclavadas, até o ponto final do experimento. Manter as gaiolas em recintos pressurizado. Use equipamentos de proteção individual sempre que lidar com os ratos.

Resultados

Para determinar se o transplante co de executivos fornece um benefício ao tecido dos pacientes, descongeladas tiras corticais ovarianos foram divididas em pedaços de tamanhos iguais e incorporadas bilateralmente em imuno-comprometido, NOD scid gama (NSG), ratos. Com um lado incorporado em um coágulo de fibrina sozinho (sem ECs) e os outros executivos contendo (Figura 1a), cada rato serviu como seu próprio controle. Os executivos foram obtidos através do ...

Discussão

Aqui podemos demonstrar esse transplante co de executivos fornece um benefício significativo a viabilidade do tecido ovariano e função após enxerto heterólogo em camundongos. Normas para a aplicação clínica da autotransplante de tecido ovariano para preservação da fertilidade não foram conjunto e os parâmetros ideais (tamanho, local de transplante, duração do enxerto, etc.) 32 , 33 , 34 para recuperação ...

Divulgações

Michael Ginsberg é um empregado da Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Estados Unidos, que isoladas, transfected com E4-ORF-1 e rotulado as células endoteliais que usamos.

Agradecimentos

Omar Alexander Man para as ilustrações.
L.M. foi apoiado por um prêmio de piloto da clínica Cornell e concessão de pesquisa Translational Science Center e um ASRM.
Os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório James para uma leitura crítica do manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 mediumGibco11415064
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062Anti-Anti X100
SucroseSigmaS 1888
FibrinogenSigmaF 8630from bovine plasma
ThrombinSigmaT 1063from human plasma
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastic paraffin filmBemis NAParafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm3M1530-1Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm3M1530-0Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Absorbable SutureCovidienUM-203Biosyn
Braided Absorbable SutureCovidienGL-889Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine Solution Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
sterile ocular lubricantDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Anasthesia systemVetEquipV-1 table top system with scavenging
Endothelial cellsAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stainSigmaHT15-1ktTrichrome Stain (Masson) Kit
IsolectinInvitrogenI32450isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

Referências

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