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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Para algunos pacientes, la única opción para la preservación de la fertilidad es la criopreservación de tejido ovárico. Desafortunadamente, la revascularización tardía socava la viabilidad folicular. Aquí, presentamos un protocolo de co trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales para utilización como una estrategia basada en celda combinando acelerada la perfusión con una entrega de paracrina directa de moléculas bioactivas.

Resumen

La infertilidad es un efecto secundario frecuente de la quimioterapia o la radioterapia y para algunos pacientes, criopreservación de ovocitos o embriones no es una opción. Como alternativa, un número creciente de estos pacientes se decide criopreservar tejido ovárico para autoinjerto después de la recuperación y remisión. A pesar de mejoras en los resultados entre los pacientes sometidos a auto-trasplante de tejido ovárico criopreservado, revascularización eficaz del tejido injertado sigue siendo un obstáculo importante. Para reducir la isquemia y mejorar así los resultados en pacientes sometidos a trasplante de auto, desarrollamos una estrategia basadas en células vascular para acelerar la perfusión del tejido ovárico. Se describe un método para el trasplante de co de las células endoteliales exógenos (ejecutivos) con tejido ovárico criopreservado en un modelo de xenoinjerto murino. Extendemos este enfoque para emplear a ejecutivos que han sido diseñados para expresar constitutivamente hormona Anti-Mullerian (AMH), permitiendo así sostenido paracrina señalización de entrada a los injertos de ovarianos. Trasplante junto con ejecutivos de mayor volumen folicular y desarrollo del mayor folículo antral, y ejecutivos de AMH-expresión promovieron retención de folículos primordiales quietos. Esta estrategia combinada puede ser una herramienta útil para mitigar la isquemia y la modulación de la activación folicular en el contexto de preservación de fertilidad o infertilidad en general.

Introducción

Cáncer sigue siendo entre las principales causas de muerte en el mundo desarrollado, sin embargo, décadas de investigación han producido avances significativos para la mayoría de los tipos de cáncer y en algunos casos casi se duplicó la supervivencia tasas1. Lamentablemente, los agentes quimioterapéuticos son a menudo gonadotóxica, agotamiento de la reserva de folículos primordiales en los ovarios y reducción de la fertilidad2. Este crecimiento de la población puede beneficiarse de varios métodos de preservación de la fertilidad incluyendo criopreservación de ovocitos o embriones, sin embargo, los pacientes que requieren la pronta iniciación de la terapia del cáncer y los pacientes prepuberales son elegibles para estas opciones. Como alternativa, algunos pacientes han decidido criopreservar tejido ovárico antes de emprender su régimen terapéutico y a la recuperación y la remisión, auto-transplante de tejido para restaurar la fertilidad3. Sin embargo, hasta la fecha, la supervivencia del trasplante y folicular salida auto-trasplante de siguiente siguen siendo relativamente bajos4, principalmente debido a tejido isquemia e hipoxia5,6,7. A pesar de numerosos esfuerzos para mejorar la viabilidad de los injertos corticales ováricas utilizando antioxidantes8,9, pro-angiogénicos citoquinas10,11,12,1 3o manipulaciones mecánicas14, isquemia del injerto en un trasplante después de 5 a 7 días ventana socava la viabilidad y supervivencia del injerto7. Para hacer frente a esto, hemos desarrollado una estrategia basada en la célula para facilitar la anastomosis de vasos de anfitrión y del injerto y así acelerar la reperfusión del tejido ovárico.

Además del insulto isquémico a tejido ovárico injertado en la ventana posterior al trasplante, la alteración de la señalización inter folicular puede contribuir al agotamiento de la piscina15,16. Porque las células endoteliales exógenas (ejecutivos) contribuyen al estables y en funcionamiento los vasos en la periferia del injerto, presentan una oportunidad única para transmitir una entrada molecular definida al tejido trasplantado. Como una prueba del principio, ejecutivos fueron manipulados a niveles express súper fisiológicos de hormona Anti-Mullerian (AMH), un miembro de la superfamilia de beta (TGFβ) factor de crecimiento transformante que se ha demostrado que restringir el crecimiento folicular17. Comparación de la distribución folicular en los injertos trasplantados conjuntamente con control y células de AMH-expresión comprueba si la actividad biológica y potencia de ejecutivos de ingeniería.

En Resumen, mediante la mejora de injerto viabilidad y supresión de la movilización precoz del grupo folicular, este enfoque puede aumentar la productividad de auto trasplanta tejido ovárico en pacientes sometidos a la preservación de la fertilidad. Por otra parte, la plataforma basada en ExEC permite interrogatorio experimental de reguladores moleculares que han sido implicados en el desarrollo folicular.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales sujetos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Weill Cornell Medical College. Todos los experimentos de xenotrasplante con tejido ovárico se realizaron conforme a las normas y directrices pertinentes. Tejido ovárico humano se obtuvo de pacientes programados para quimioterapia o radioterapia para el tratamiento del cáncer o trasplante de médula ósea previo. La Junta de revisión institucional (IRB) Comité de Weill Cornell Medical College aprobó la colección de tejidos para uso autólogo y con el consentimiento informado del paciente que se realizó una donación de hasta un 10% de su tejido ovárico para uso de la investigación.

1. colección de tejido ovárico humano

Nota: Cuando un tejido ovárico es transportada de un tránsito de instalación remota, tiempo no debe exceder 5 h18,19.

  1. Recoger el tejido ovárico y enjuague con una solución salina estéril.
  2. Lugar el ovario en un recipiente estéril.
  3. Vierta el medio de Leibovitz L-15 hasta que el ovario está completamente inmerso en el medio.
  4. Cerrar y sellar el contenedor.
  5. Transporte el recipiente sobre hielo.

2. procesar el tejido ovárico adquirido, adaptado de Schmidt et al. 18

  1. Preparados para el procesamiento y congelación ovárica
    1. Preparar 100 mL de medio para el proceso: solución antibiótico-antimicótico de Leibovitz L-15 medio 99 mL + 1 mL. Filtro de los medios de comunicación con filtro de 0.2 μm. Mantener el medio refrigerado.
    2. Preparar 100 mL de solución de congelación utilizando DMSO como un crio-protector. Añadir L-15 medio, 17,66 mL suero bovino fetal de 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de sacarosa (para crear una concentración final de 0.1 mol/L), 10,65 mL DMSO (para crear una concentración final de 1,5 mol/L) y 1 mL de solución de antibiótico-antimicótico. Filtrar el medio utilizando una unidad de filtro de 150 mL, 0,2 μm. Almacene el medio a 4 ° C.
    3. Esterilizar las herramientas quirúrgicas utilizando un autoclave programado para un ciclo de esterilización de sólidos envueltos.
  2. A la llegada del tejido
    1. Establecer las herramientas quirúrgicas estériles en la bioseguridad gabinete: bisturí con número 21, de la hoja agudo bien curvada tijeras y fórceps en variaban tamaños: largo (150 mm de longitud) y 2 tamaño mediano (alrededor de 110 mm de longitud).
    2. Guantes estériles, abra el contenedor dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología. Tomar el ovario y colocar en una placa de Petri de 150 mm y medio frío preparado en el paso 2.1.1 sobre el ovario para evitar la deshidratación del tejido ovárico.
    3. Aislar el ovario de cualquier tejido residual y enjuague con medio frío hasta que esté desprovisto de tejido y sangre.
    4. El ovario en un limpio 150 mm plato de Petri, añadir frío medio, preparado en el paso 2.1.1 hasta que el ovario es la mitad sumergido en él.
  3. Disección del tejido ovárico
    1. Biseca el ovario y sacar la médula primera disección cortante, con unas tijeras finas curvas. Luego raspar la médula, con un bisturí estéril con un número de la lámina 21. Preceden hasta que el tejido cortical es 1-1.5 mm de espesor.
    2. Cortar el tejido cortical en astillas de 2-3 mm de ancho, la longitud de la tira será toda la longitud de la pieza ovárica que fue procesada.

3. ovario tejido de congelación lenta, adaptado de Newton et al. y Oktay et al. 6 , 20

  1. Preparación para la congelación
    1. Crioviales de etiqueta (1,8 mL).
    2. Añadir 1,5 mL de la solución congelada preparada en el paso 2.1.2 a cada frasco.
    3. Transferencia de una tira cortical por vial criogénico que contiene la solución congelada.
    4. Equilibre la franja cortical por 20 min en una placa giratoria, aplique suave agitación a 4 ° C.
  2. Lento de congelación de tejido ovárico
    1. Cargar los crioviales en un congelador programable cepillo a partir de 0 ° C.
    2. Enfriar en 2 ° C/min hasta-7 ° C.
    3. Mantener los tejidos en esta temperatura constante durante 10 minutos.
    4. Realizar siembra manual para la inducción de nucleación de hielo cristal, tocando cada cryovial con una punta de algodón sumergida en nitrógeno líquido (LN2).
    5. Seguir a enfriar a 0.3 ° C/min hasta que la temperatura de la muestra alcanza los-40 ° C.
    6. Enfriar a una velocidad mayor de 10 ° C/min hasta-140 º C.
    7. Crioviales de transferencia a dewar para almacenamiento en LN2 (-196 ° C).

4. preparación para la cirugía (ooforectomía Bilateral y el trasplante Co)

  1. Preparación de placas
    1. Un día antes de descongelar el tejido ovárico para el trasplante
      1. Coloque un trozo de una película de plástico de la parafina en el fondo de un plato de Petri de 50 mm, aerosol con 70% etanol hasta que será totalmente cubierto.
      2. Deje los platos de Petri durante la noche en la bioseguridad gabinete. Preparar 2 platos Petri por ratón.
    2. En la jornada de cirugías
      1. Aspire el etanol a partir de la placa de Petri que contiene la película de parafina plástica dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología.
      2. Deje el plomo de la placa de Petri medio abierta hasta que el etanol se evapora completamente.
      3. Cierre la tapa de la caja Petri cuando la película de plástico de la parafina esté completamente seca. Mantenerlo dentro de la bioseguridad gabinete.
      4. Pozos de la etiqueta de un 6 placa bien por consiguiente, 0,1 mol/L de sacarosa + 1 mol/L de DMSO, 0.1 mol/L de sacarosa + 0,5 mol/L de DMSO, 0.1 mol/L de sacarosa, básica descongelación solución (BTS), medio.
  2. Preparación de las soluciones
    1. Preparar 100 mL de BTS: L-15 de Leibovitz medio mL 79 + FBS 20 mL de solución de antibiótico-antimicótico 1 mL. Filtro con un sistema de filtro de 0,22 μm.
    2. Preparar 10 mL de BTS con 0.1 mol/L de sacarosa. Escala 0,342 g de sacarosa y añadir 10 mL de BTS preparado en el paso 4.2.1, agite suavemente hasta que se disuelva completamente la sacarosa. Filtro de la solución usando una jeringa filtro de 0,22 μm.
    3. Preparar las soluciones según la tabla 1. Cubierta de tubos que contiene DMSO con papel de aluminio. Mantener refrigerado hasta su uso.

5. ovario tejido rápido deshielo

  1. Sacar el LN2 dewar un frasco que contiene congelado el tejido ovárico y mantenerlo a temperatura ambiente durante 30 s.
  2. Limpiar el frasco con un papel de tejido.
  3. Sumergir el frasco en un baño de agua de 30 ° C durante 1-2 minutos hasta su ' contenido es descongelado.
  4. Abra el frasco y coloque la franja cortical en el primer pozo que contiene 3ml de la primera solución (0.1 mol/L de sacarosa + 1 mol/L de DMSO, preparado en el paso 4.2.3).
    Nota: Todos los pasos que implica abrir la tapa de la placa se hará bajo flujo laminar.
  5. Incube la placa bien 6 en una placa giratoria a 4 ° C por 5 min mantenga la placa cubierta con papel de aluminio para este paso.
  6. Transferir la franja cortical en el segundo pozo que contiene 3 mL de la segunda solución (0.1 mol/L de sacarosa + 0,5 mol/L de DMSO, preparado en el paso 4.2.3).
  7. Incube la placa bien 6 en un plato giratorio para agitación suave a 4 ° C por 5 min mantenga la placa cubierta con papel de aluminio para este paso.
  8. Transferir la franja cortical en el tercer pozo, que contiene 4 mL de solución (BTS con 0.1 mol/L de sacarosa, preparado en el paso 4.2.2).
  9. Incubar en una placa giratoria para agitación suave a 4 ° C durante 5 minutos.
  10. Transferir la franja cortical en el cuarto así que contiene 4 mL de solución (BTS, preparado en el paso 4.2.1).
  11. Incubar en una placa giratoria para agitación suave a 4 ° C durante 5 minutos.
  12. Transferir la franja cortical en el último bien que contiene 4 mL de medio frío (preparado en el paso 2.1.1). No tejido ovárico descongelado el hielo hasta realizar el trasplante.

6. encapsulado de tejido ovárico

  1. Preparar las siguientes soluciones
    1. Preparar 25 mL de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina al 0.9%. Filtrar y almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar 1 mL de CaCl2 en la concentración de 1 mol/L. filtro y almacenar a 4 ° C.
  2. Preparar una solución madre de 50 mg/mL de fibrinógeno
    1. Añadir 1 g de fibrinógeno en 20 mL de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina al 0.9% mezclando lentamente el fibrinógeno en el HEPES tamponada con solución salina durante varias horas a 37 ° C.
    2. Etiqueta de 1,7 mL tubos de microcentrífuga.
    3. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0.45 μm y luego a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    4. Alícuota de la solución en 200 μL en el tubo de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  3. Preparar una solución stock de trombina 100 U/mL
    Nota: Soluciones de trombina por adsorción al vidrio, alícuota la solución en frascos de tubos de plástico.
    1. Añadir 2,5 mL de solución salina estéril 0,9% a 250 U de la trombina.
    2. Agitar suavemente hasta la solución para disolver completamente.
    3. Etiqueta de 1,7 mL tubos de microcentrífuga.
    4. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,2 μm, alícuotas de 50 μL en tubos de microcentrífuga y tienda a-80 ° C.
  4. Hacer un coágulo de fibrina de 70 μl, obteniendo una concentración final de 10 mg/mL fibrinógeno y trombina U/mL 5
    Nota: Asegúrese de trabajar rápido, la solución coagula en unos segundos. También, evitar la adición de burbujas a la mezcla.
    1. Preparar una solución de fibrinógeno en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      1. Añadir 360 μl de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina 0.9% a la alícuotas de 200 μL de los valores de fibrinógeno, preparado en el paso 6.2.4.
      2. Mezclar mediante pipeteo suave.
      3. Mantener en hielo.
    2. Preparar una solución de trombina en un segundo tubo de microcentrífuga.
      1. Añadir 148.7 μl de DMEM a las alícuotas de 50 μl de la acción de la trombina, preparado en el paso 6.3.4.
      2. Mezclar mediante pipeteo suave.
      3. Añade el 1.3 μl de 1 mol/L de CaCl2.
      4. Mezclar mediante pipeteo suave.
      5. Mantener en hielo.
    3. Preparar una suspensión unicelular, en un tercer tubo de microcentrífuga.
      1. Separar las ingeniería de las células endoteliales de la placa utilizando un medio de separación celular enzima.
      2. Girar hacia abajo la y contar las células usando un hemocitómetro con una cubierta de vidrio.
      3. Utilizar 20.000 células por cada 1 mm2 de tejido ovárico. Calcula 20.000 x área de tejido ovárico en mm2.
      4. Desactivación de las células endoteliales ingeniería y resuspender en medio básico (DMEM) para alcanzar un volumen total de 16.8 μl.
      5. Mantener en hielo.
    4. Coloque un pedazo de tejido ovárico en una esponja de gasa estéril para secar durante unos segundos.
    5. Coloque el pedazo de tejido ovárico sobre la película de parafina plástica dentro de la caja de Petri de 50 mm.
    6. Añadir 39.2 μl de la solución de fibrinógeno, preparada en el paso 6.4.1.2, en la suspensión preparada en el paso 6.4.3.4, mezclar mediante pipeteo suave. Mantener en hielo.
    7. Añadir 14 μl de la solución de trombina preparada en el paso 6.4.2.4. Mezclar suavemente transfiriendo una vez. Trabajar rápido.
    8. Coloque la mezcla en la parte superior el tejido ovárico, pipeta en forma de una gota alargada.
    9. Coloque la placa de Petri con el coágulo en la incubadora a 37 ° C.

7. bilateral ooforectomía y co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales ingeniería NSG ratones

Nota: Diez a catorce semanas de edad hembra NSG ratones21 fueron utilizados (laboratorios de Jackson).

  1. Preparar herramientas todo quirúrgicas, como elaborada en el paso 2.1.3, asegúrese de que tener todas las suturas, almohadillas y cintas quirúrgicas prácticas.
  2. Anestesiar el ratón mediante un sistema de anestesia con isoflurano.
    1. Colocar el ratón en la cámara de inducción, cierre la tapa y abra la llave de paso correspondiente.
    2. Medidor de caudal abierto a 1.000 mL/min encienda el vaporizador y configurarlo para entregar 2-3.5%.
    3. Observar los efectos de la anestesia; pérdida de conciencia, lento y respiraciones regulares.
    4. Traslado al cono de nariz para mantener la anestesia. Gire el vaporizador para entregar 1-3%, dependiendo de los signos vitales.
    5. Verificar ausencia de reflejo pedal o cola. Si el reflejo está presente, aumente isoflurano hasta que está ausente.
  3. Recortar el pelo del ratón, desde la cola hasta la línea de las clavículas, con un cortapelos eléctrico.
  4. Coloque el ratón en una posición prona en la plataforma quirúrgica.
  5. Fijar el cono de la nariz a la plataforma quirúrgica usando una cinta quirúrgica.
  6. Extremidades del ratón suavemente a la plataforma quirúrgica usando una cinta de papel quirúrgica de 1.25 cm de ancho de cinta.
  7. Usar una jalea lubricante estéril e inserte un termómetro PR. fijar el termómetro por grabar a la plataforma quirúrgica usando un esparadrapo plástico perforado de 1,25 cm de ancho.
  8. Cinta la cola a la plataforma quirúrgica usando una cinta de papel quirúrgica amplia de 2.5 cm.
  9. Calor, mediante un infrarrojo o un cojín, de calefacción por agua caliente y controlar la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento. Mantener temperatura corporal dentro del rango de 35-37 ° C.
  10. Limpie el área recortado con un palo de escobillón estéril solución de povidona-yodo y limpie con preparación de alcohol estéril.
  11. Repita el paso dos veces más de 6.9.
  12. Coloque una gota de ungüento veterinario lubricante ocular estéril sobre cada uno de los ojos del ratón para proteger de la deshidratación y daño a la córnea.
  13. Cubre el ratón con un paño quirúrgico estéril.
  14. Inyección sub cutánea (buprenorfina (1 mg/Kg) de S/C).
  15. Realizar una incisión dorsal medial longitudinal con bisturí (hoja #21).
  16. Realizar una ooforectomía bilateral, utilizar un enfoque dorsal.
    1. Libre de tejido conectivo subcutáneo por disección Roma utilizando las tijeras.
    2. Pellizque la fascia lateralmente al hacer midline incisión y llegar a la cavidad peritoneal con las tijeras afiladas.
    3. Coge el cojín gordo ovario y el ovario suavemente con una pinza y tire de ella fuera de la cavidad abdominal.
    4. Tome el ovario y la almohadilla de grasa con una pinza vascular.
    5. Ligar el ovario y la almohadilla de grasa utilizando una sutura absorbible de monofilamento de 4/0 en la base del ovario, distal a la trompa de Falopio.
    6. Clip del ovario distal a la ligadura. Asegúrese de que no hay ningún sangrado desde la base del muñón.
    7. Coloque el tejido en la cavidad abdominal y sutura la fascia con una sutura absorbible trenzada 6/0.
    8. Repita las etapas 7.15.1-7.15.7 en el lado contralateral.
  17. Co del trasplante del tejido ovárico.
    1. Realizar una incisión horizontal en la fascia sobre el Maximus del glúteo, en la longitud que se adapta a las dimensiones de los coágulos. Para crear un bolsillo dentro de este espacio virtual, abrir las tijeras debajo de la fascia.
    2. Recoger una pieza de tejido cortical encapsulado, como preparado en el paso 6.4.8 y colóquela en este bolsillo.
    3. Sutura la fascia con un 6/0 Sutura absorbible trenzada.
  18. Repetir etapas 7.16.1-7.16.3 en el lado contralateral.
  19. Cerca de la pared dorsal con puntos interrumpidos simples con una sutura absorbible de monofilamento de 4/0.
  20. Inyectar la lidocaína 0.5% (1,2 mL/Kg) S/C en el sitio de la incisión.
  21. Usar una preparación de alcohol estéril para limpiar la piel.
  22. Apague el isoflurano mientras monitorea la temperatura del ratón.
  23. Proporcionar 1-2 min de O2, sin isoflurano. Mantener por calentamiento el ratón hasta que comience a mover y volver a la conciencia.
  24. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia y más tarde de la casa del ratón en una jaula separada hasta la completa curación de la herida quirúrgica.
  25. Inyectar la buprenorfina (1 mg/Kg) S/C según sea necesario cada 8-12 h, 24 h después de la operación.
  26. Mantener los ratones en jaulas separadas cuando todos los alimentos, agua, ropa de cama y jaulas son autoclave, hasta el punto final del experimento. Mantener las jaulas en un espacio ventilado a presión. Utilizar equipo de protección personal cuando maneje los ratones.

Resultados

Para determinar si co trasplante de ejecutivos proporciona un beneficio al tejido de pacientes, tiras corticales ováricas descongeladas se divide en trozos iguales de tamaño y engrafted bilateralmente en inmuno-comprometidos, gamma NOD scid (NSG), ratones. Con un lado encajado en un coágulo de fibrina solo (no ECs) y los otros ejecutivos que contienen (Figura 1a), cada ratón fue su propio control. Ejecutivos se obtuvieron mediante aislamiento de primaria ...

Discusión

Aquí demostramos que la trasplante de ejecutivos ofrece un beneficio significativo para la viabilidad del tejido ovárico y la función después de xenoinjerto en ratones. Normas para la aplicación clínica de la auto-trasplante de tejido ovárico para la preservación de la fertilidad no han sido conjunto y los parámetros óptimos (tamaño, sitio de trasplante, duración del injerto, etcetera.) 32 , 33 , 34 para may...

Divulgaciones

Michael Ginsberg es un empleado de Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Estados Unidos, que aislado, transfected con E4-ORF-1 y etiquetado como las células endoteliales que utilizamos.

Agradecimientos

Omar Alexander Man para las ilustraciones.
L.M. fue apoyada por un premio de piloto de la clínica de Cornell y beca de investigación traslacional Science Center y un ASRM.
Los autores desean agradecer a James miembros de laboratorio para la lectura crítica del manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 mediumGibco11415064
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062Anti-Anti X100
SucroseSigmaS 1888
FibrinogenSigmaF 8630from bovine plasma
ThrombinSigmaT 1063from human plasma
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastic paraffin filmBemis NAParafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm3M1530-1Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm3M1530-0Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Absorbable SutureCovidienUM-203Biosyn
Braided Absorbable SutureCovidienGL-889Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine Solution Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
sterile ocular lubricantDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Anasthesia systemVetEquipV-1 table top system with scavenging
Endothelial cellsAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stainSigmaHT15-1ktTrichrome Stain (Masson) Kit
IsolectinInvitrogenI32450isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

Referencias

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