人卵巢组织与工程化内皮细胞联合移植: 一种以细胞为基础的快速灌注与直接分泌的融合策略

摘要

对某些患者来说, 保留生育能力的唯一选择是保存卵巢组织。不幸的是, 延迟血管重建破坏卵泡活力。在这里, 我们提出一个协议, 共同移植人卵巢组织与内皮细胞作为一种基于细胞的战略结合加速灌注与直接分泌交付的生物活性分子。

摘要

不孕是化疗和/或放疗的经常性副作用, 对某些患者来说, 冷冻的卵母细胞或胚胎不是一种选择。作为替代, 越来越多的这些患者选择 cryopreserve 卵巢组织的移植后恢复和缓解。尽管保存的卵巢组织自动移植患者的预后有所改善, 但移植组织的有效血管重建仍然是一个主要障碍。为了减轻缺血, 从而改善自动移植患者的预后, 我们开发了一种以血管细胞为基础的加速卵巢组织灌注的策略。本文描述了一种在小鼠同种异体模型中联合移植保存卵巢组织的外源性内皮细胞 (执行官) 的方法。我们扩大这一做法, 雇用已设计为组成性表达抗苗勒激素 (AMH) 的执行官, 从而使持续分泌信号输入到卵巢移植。联合移植与执行官增加卵泡体积和改善窦卵泡发育, 和 AMH 表达的执行官促进保留静态原始卵泡。这一联合战略可能是一个有用的工具, 以减轻缺血和调节卵泡激活的背景下的生育率保存和/或不育的大。

引言

癌症仍然是发达国家死亡的主要原因之一, 但数十年的研究已经取得了重大进展, 在大多数类型的癌症, 并在某些情况下, 几乎加倍的生存率¹。不幸的是, 化疗药物经常 gonadotoxic, 耗尽卵巢原始卵泡的储备, 并减少生育率²。这种日益增长的人口可以受益于多种生育方法, 包括卵母细胞和/或胚胎超低温保存, 但是, 需要迅速启动癌症治疗和青春期前患者的患者不符合这些选择。另外, 一些患者选择在进行治疗方案之前 cryopreserve 卵巢组织, 并在恢复和缓解后, 自动移植组织恢复生育率³。然而, 到目前为止, 自动移植后的移植生存和卵泡输出仍然相对较低⁴, 主要是由于组织缺血和缺氧^5,6,7。尽管许多努力改善卵巢皮质移植的生存能力使用抗氧化剂^8,9, 支持血管生成素^{10,11,12,1 3}或机械操作¹⁴, 5 至7天窗口移植后的移植物缺血损害了移植⁷的生存和生存。为了解决这一问题, 我们制定了一个基于细胞的策略, 以促进宿主和移植血管的吻合, 从而加速卵巢组织的再灌注。

除了在移植后的窗口中对接枝卵巢组织的缺血性侮辱外, 卵泡间信号的中断可能导致池的耗尽^15,16。由于外源性内皮细胞 (执行官) 有助于在移植周围的稳定和功能的血管, 他们提供了一个独特的机会, 向移植组织传达定义的分子输入。作为一项原则的证明, 执行官们被设计来表达超生理水平的抗苗勒激素 (AMH), 一个成员的转化生长因子 beta (TGFβ) 超家族, 已被证明限制卵泡生长¹⁷。用控制和 AMH 表达细胞联合移植移植滤泡分布的比较验证了工程主管的生物活性和效力。

总之, 通过提高移植的生存能力和抑制卵泡池的过早动员, 这种方法可以提高在生育保护患者中自动移植卵巢组织的生产率。此外, 基于 ExEC 的平台还能对与卵泡发育有关的分子调控器进行实验性审讯。

研究方案

所有涉及动物的程序都已由威尔康奈尔医学院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。所有使用卵巢组织的异种移植实验均按照相关的指导原则和规定进行。人卵巢组织收集的病人计划化疗或放疗的癌症治疗或前骨髓移植。威尔康奈尔医学院的机构审查委员会批准了为潜在自体使用的组织的收集, 并在患者知情同意下, 捐赠多达10% 的卵巢组织供研究使用。

1. 人类卵巢组织的收集

注意: 当卵巢组织从远程设施中转运输时, 时间不应超过 5 h^18,19。

1. 收集卵巢组织和冲洗与无菌盐水溶液。
2. 将卵巢置于无菌容器中。
3. 倒入莱博维茨的 L-15 培养基, 直到卵巢完全浸入培养基中。
4. 关闭并密封容器。
5. 把容器运到冰上。

2. 加工所采购的卵巢组织, 改编自施密特et 。¹⁸

1. 卵巢加工和冷冻的准备工作
   1. 准备100毫升的培养基进行加工: 莱博维茨的 L-15 中99毫升 + 1 毫升抗生素防霉溶液。使用0.2 µm 过滤器过滤介质。保持中间冷藏。
   2. 用亚砜作为冷冻防护, 制备100毫升冷冻溶液。添加69.64 毫升莱博维茨的 L-15 培养基, 17.66 毫升胎牛血清 (血清), 3.42 克蔗糖 (创建最终浓度0.1 摩尔/升), 10.65 毫升亚砜 (以创建最终浓度的1.5 摩尔/升), 和1毫升抗生素防霉解决方案。使用150毫升过滤器单元过滤介质, 0.2 µm. 将培养基存放在4摄氏度。
   3. 使用用于包装固体灭菌循环的高压釜消毒手术工具。
2. 组织到达后
   1. 在生物安全柜中设置无菌手术工具: 手术刀与刀片 21, 锋利的细弯剪刀和钳在不同的大小: 长 (大约150毫米长度) 和2中等大小 (大约110毫米长度)。
   2. 戴上无菌手套, 在安全柜内打开容器。将卵巢放在150毫米培养皿中, 然后在卵巢的2.1.1 上倒入冷培养基, 以防止卵巢组织脱水。
   3. 将卵巢从任何残留的组织中分离出来, 用冷媒冲洗, 直到没有组织和血液。
   4. 将卵巢放在一个干净的150毫米培养皿中, 加入冷媒, 在台阶2.1.1 中准备, 直到卵巢半淹没在它里面。
3. 卵巢组织解剖
   1. 对开卵巢, 先用弯细剪刀取出髓质。然后用一把21刀片的无菌手术刀刮掉髓质。之前, 直到皮质组织是 1-1. 5 毫米的厚度。
   2. 将皮质组织切成2-3 毫米宽的薄片, 该条的长度将是所处理的卵巢片的整个长度。

3. 卵巢组织缓慢冰冻, 适应牛顿et al。和 Oktay et 。^6,20

1. 冷冻准备
   1. 标签 cryovials (1.8 毫升)。
   2. 在步骤2.1.2 中添加1.5 毫升的冷冻溶液至每瓶。
   3. 每一个含冷冻溶液的低温小瓶转移一皮质带。
   4. 在旋转板上平衡皮质带20分钟, 在4摄氏度处应用温和搅拌。
2. 卵巢组织缓慢冰冻
   1. 将 cryovials 装入可编程的刨床冷冻机, 从0摄氏度开始。
   2. 冷却在2°c/分钟到-7 °c。
   3. 保持组织在这个恒定的温度为10分钟。
   4. 执行人工播种的冰晶成核诱导, 通过触摸每个 cryovial 与棉花尖端浸泡在液氮 (在₂)。
   5. 继续冷却在0.3 °c/分钟, 直到样品温度达到-40 摄氏度。
   6. 冷却速度快10°c/分钟到-140 摄氏度。
   7. 将 cryovials 转移到 LN2 (-196 °c) 中用于存储的杜瓦瓶中。

4. 手术准备 (双边卵巢切除术和联合移植)

1. 板材的制备
   1. 解冻卵巢组织移植前的一天
      1. 将一块塑料石蜡膜放在50毫米培养皿的底部, 用70% 乙醇喷雾, 直到完全覆盖。
      2. 把培养皿放在安全柜里过夜。每只老鼠准备2培养皿。
   2. 在手术当天
      1. 在生物安全柜内含有塑料石蜡膜的培养皿中吸入乙醇。
      2. 离开培养皿铅半开, 直到乙醇完全蒸发。
      3. 当塑料石蜡膜完全干燥时, 关闭培养皿的盖子。把它放在安全柜里。
      4. 6井板标签井相应, 0.1 摩尔/升蔗糖 + 1 摩尔/升亚砜, 0.1 摩尔/升蔗糖 + 0.5 摩尔/升亚砜, 0.1 摩尔/升蔗糖, 基本解冻溶液 (基站), 培养基。
2. 解决方案的准备工作
   1. 准备100毫升的基站: 莱博维茨的 L-15 中等79毫升 + 血清20毫升 + 抗生素防霉溶液1毫升。过滤器与0.22 µm 过滤系统。
   2. 用0.1 摩尔/升蔗糖制备10毫升的基站。0.342 克的蔗糖和添加10毫升的4.2.1 在步骤中制备, 轻轻搅动, 直到蔗糖完全溶解。使用注射器过滤器0.22 µm 过滤解决方案。
   3. 根据表 1准备解决方案。带铝箔的含亚砜的盖管。保持冷藏, 直到使用。

5. 卵巢组织快速解冻

1. 取出₂杜瓦瓶中含有冰冻卵巢组织的瓶子, 并将其保持在室温下三十年代。
2. 用纸巾擦干净瓶子。
3. 将瓶子浸泡在30摄氏度的水浴中1-2 分钟, 直到它的内容解冻。
4. 打开瓶子, 并将皮质带放在第一个井中, 其中第一个溶液中含有 3ml (0.1 摩尔/升蔗糖 + 1 摩尔/升亚砜, 在步骤4.2.3 中制备)。
   注: 所有涉及打开板盖的步骤将在层流下完成。
5. 在4摄氏度的旋转板上孵化6井板, 5 分钟. 用铝箔盖住这一步。
6. 将皮质带转入第二个含3毫升第二溶液的井中 (0.1 摩尔/升蔗糖 + 0.5 摩尔/升二甲基亚砜, 在步骤4.2.3 中制备)。
7. 在旋转板上孵育6井板, 使其在4摄氏度处进行温和搅拌, 5 分钟. 用铝箔盖住这一步。
8. 将皮质带转入第三井, 含4毫升溶液 (基站与0.1 摩尔/L 蔗糖, 在步骤4.2.2 中制备)。
9. 在旋转板上孵育, 以在4°c 5 分钟的温和搅拌。
10. 将皮质带移植到含有4毫升溶液的第四井中 (4.2.1)。
11. 在旋转板上孵育, 以在4°c 5 分钟的温和搅拌。
12. 将皮质带移植到最后一个含4毫升冷介质的井中 (在步骤2.1.1 中制备)。保持解冻的卵巢组织在冰上, 直到执行移植。

6. 卵巢组织的封装

1. 准备以下解决方案
   1. 在0.9% 盐水中准备25毫升20毫摩尔 HEPES 缓冲液。过滤和存储在4摄氏度。
   2. 准备1毫升的 CaCl₂在浓度为1摩尔/l 过滤器和存储在4°c。
2. 制备纤维蛋白原50毫克/毫升库存溶液
   1. 将1克纤维蛋白原加入20毫升20毫摩尔/升 HEPES 缓冲液中, 在0.9% 盐水中慢慢将纤维蛋白原混合到 HEPES 缓冲的盐水中, 在37摄氏度以上数小时。
   2. 标签1.7 毫升微离心管。
   3. 过滤解决方案通过0.45 µm 注射器过滤器, 然后通过0.2 µm 注射器过滤器。
   4. 整除将溶液分为200µL 微离心管, 贮存在-20 摄氏度。
3. 制备凝血酶 100 U/毫升库存溶液
   注: 凝血酶溶液吸附在玻璃上, 整除溶液中的塑料管/瓶。
   1. 添加2.5 毫升0.9% 不育生理盐水到 250 U 的凝血酶。
   2. 轻轻摇动, 直到溶液完全溶解。
   3. 标签1.7 毫升微离心管。
   4. 过滤通过0.2 µm 注射器过滤器, 整除50µL 入微离心管并且存放在-80 °c。
4. 使纤维蛋白凝块70µL, 获得最终浓度10毫克/毫升纤维蛋白原和 5 U/毫升凝血酶
   注意: 确保快速工作, 解决方案在几秒钟内凝结。此外, 避免添加气泡的混合物。
   1. 在1.7 毫升微离心管中制备纤维蛋白原溶液。
      1. 在0.9% 盐水溶液中添加360µL 20 毫摩尔/升 HEPES 缓冲液, 用于纤维蛋白原库存的 aliquoted 200 µL, 在步骤6.2.4 中制备。
      2. 由温和的吹打混合。
      3. 把它放在冰上。
   2. 在第二微离心管中制备凝血酶溶液。
      1. 在步骤6.3.4 中加入148.7 µL 的 DMEM, aliquoted 50 µL 的凝血酶。
      2. 由温和的吹打混合。
      3. 添加1.3 µL 1 摩尔/升 CaCl₂。
      4. 由温和的吹打混合。
      5. 把它放在冰上。
   3. 在第三个微离心管中制备单个细胞悬浮液。
      1. 用酶细胞脱离培养基从板中分离出工程化的内皮细胞。
      2. 用 hemocytometer 和盖玻璃旋转并计数单元格。
      3. 每1毫米²的卵巢组织使用2万个细胞。在 mm²中计算卵巢组织的20,000x 面积。
      4. 旋转的工程内皮细胞, 并重新悬浮在基本培养基 (DMEM), 以达到16.8 µL 的总容量。
      5. 把它放在冰上。
   4. 将一块卵巢组织放在无菌纱布海绵上晾干几秒钟。
   5. 将卵巢组织放在50毫米培养皿内的塑料石蜡膜上。
   6. 添加39.2 µL 的纤维蛋白原溶液, 准备在步骤 6.4.1.2, 进入细胞悬浮在步骤6.4.3.4 准备, 混合由温和的吹打。把它放在冰上。
   7. 添加14µL 在步骤6.4.2.4 中制备的凝血酶溶液。轻轻地混合吹打一次。工作快点。
   8. 将混合物放在卵巢组织的顶端, 吸管它以拉长的水滴的形式。
   9. 在37摄氏度的孵化器中放置培养皿与血栓。

7. 人卵巢组织与工程化内皮细胞对核型核型小鼠的双边卵巢切除术和联合移植

注: 十至十四周前的雌性核供应国小鼠使用²¹ (杰克逊实验室)。

1. 准备所有的外科工具, 如步骤2.1.3 所阐述的, 确保你有所有的缝合, 垫, 和外科磁带方便。
2. 用异氟醚的麻醉系统麻醉老鼠。
   1. 将鼠标放在感应腔内, 关闭盖子, 打开适当的旋塞阀。
   2. 打开流量计到1000毫升/分. 打开蒸发器并设置它提供 2-3. 5%。
   3. 观察麻醉效果;失去知觉, 缓慢和定期呼吸。
   4. 转到鼻锥保持麻醉。根据生命体征, 将蒸发器送出1-3%。
   5. 验证没有踏板或尾部反射。如果反射存在, 增加异氟醚, 直到它缺席。
3. 修剪鼠标的背部头发, 从尾部到锁骨线, 使用一个电动理发。
4. 把鼠标放在手术台上的俯卧位置上。
5. 用手术胶带将鼻锥固定在手术平台上。
6. 用1.25 厘米宽的外科胶带将鼠标的四肢轻轻地贴到手术平台上。
7. 使用无菌润滑剂果冻和插入温度计 PR. 用1.25 厘米宽的穿孔塑料手术胶带将温度计固定在手术平台上。
8. 用2.5 厘米宽的外科纸带将尾部胶带贴到手术平台上。
9. 加热, 使用红外线或热水加热垫, 并监测整个过程中鼠标的体温。保持体温在35-37 摄氏度范围内。
10. 用无菌聚维酮碘溶液拭子清洁修剪区域, 用无菌酒精进行擦拭。
11. 重复步骤6.9 两次。
12. 在鼠标的眼睛上放置一滴不育的眼部润滑剂兽医软膏, 以防止脱水和角膜损伤。
13. 用不育的外科悬垂盖住老鼠。
14. 注射丁丙诺啡 (1 毫克/千克) 亚皮肤 (S/C)。
15. 使用手术刀 (刀片 #21) 进行纵向内侧背切口。
16. 执行双侧卵巢切除术, 使用背侧方法。
    1. 用剪刀把皮下结缔组织用钝夹层释放出来。
    2. 将筋膜侧向中线, 用锋利的剪刀切开并到达腹膜腔。
    3. 用镊子轻轻抓住卵巢脂肪垫和卵巢, 将其拉出腹腔。
    4. 用血管钳抓住卵巢和脂肪垫。
    5. 结扎卵巢和脂肪垫使用4/0 单丝可吸收缝合在卵巢的基础上, 在输卵管远端。
    6. 将子房夹在领带的远端。确保从树桩底部没有出血。
    7. 将纸巾放回腹腔, 用6/0 编织可吸收缝线缝合筋膜。
    8. 重复阶段 7.15.1-7.15.7 在对侧。
17. 联合移植卵巢组织。
    1. 在臀高肌上方的筋膜上进行水平切口, 长度与凝块尺寸相符。通过打开筋膜下面的剪刀, 在这个虚拟空间内创建一个口袋。
    2. 拿起一个包裹的皮质组织, 准备在步骤 6.4.8, 并把它放在这个口袋里。
    3. 用6/0 编织可吸收缝线缝合筋膜。
18. 重复阶段 7.16.1-7.16.3 在对侧, 以及。
19. 用4/0 单丝可吸收缝线闭合背部壁, 使用简单的间断缝线。
20. 在切口部位注射利多卡因 0.5% (1.2 毫升/千克) 的 S/C。
21. 使用无菌酒精的准备清洁皮肤。
22. 在监视鼠标的温度时关闭异氟醚。
23. 提供1-2 分钟 O₂, 不带异氟醚。继续变暖鼠标, 直到它开始移动和恢复知觉。
24. 把鼠标放在一个干净的恢复笼子里, 然后把老鼠放在一个单独的笼子里, 直到手术伤口完全愈合。
25. 每8-12 小时注射丁丙诺啡 (1 毫克/千克), 术后24小时。
26. 当所有的食物、水、被褥和笼子都是蒸压的时候, 把老鼠放在单独的笼子里, 直到实验的终点。把笼子放在有压力的通风室里。在处理小鼠时使用个人防护设备。

结果

为了确定联合移植的执行官是否为患者的组织提供了好处, 解冻后的卵巢皮质带被分成同等大小的部分, 并嫁接为免疫性损害, 点头, 伽玛 (核供应), 小鼠。在单独嵌入纤维蛋白血块 (无 ECs) 和其他包含执行官 (图 1a) 的一侧, 每只鼠标都充当自己的控制项。执行官是通过从人脐带分离的原发性内皮和随后的治疗与腺病毒基因片段 E4-ORF1, 如前所述

讨论

在这里我们证明, 联合移植的执行官提供了一个重要的好处, 卵巢组织的生存能力和功能后, 移植的小鼠。未设置卵巢组织自动移植的临床应用标准和最佳参数 (大小, 移植部位, 移植时间,等)。^32,33,34对于滤泡池的增强恢复仍未定义。当进行自动移植时, 解冻皮层卵巢组织的缺血性移植主要表现在骨盆部位, 如其余的卵巢、?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	11415064
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	Anti-Anti X100
Sucrose	Sigma	S 1888
Fibrinogen	Sigma	F 8630	from bovine plasma
Thrombin	Sigma	T 1063	from human plasma
DMSO	Sigma	D 2650
DMEM	Gibco	12491015
Enzyme Cell Detachment Medium	Invitrogen	00-4555-56	Accutase
Plastic paraffin film	Bemis NA		Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm	3M	1530-1	Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm	3M	1530-0	Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm	3M	1527-0	Transpore
Monofilament Absorbable Suture	Covidien	UM-203	Biosyn
Braided Absorbable Suture	Covidien	GL-889	Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%	Purdue Products	67618-153-01	Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales	Nunc	377267	CryoTube
sterile ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube	Denville	C-2172	Eppendorf
Anasthesia system	VetEquip	V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells	Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA		Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain	Sigma	HT15-1kt	Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin	Invitrogen	I32450	isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate