공동 설계 된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식: 세포 기반 전략 결합 가속 직접 Paracrine 배달 관류

요약

일부 환자에 대 한 다 산 보존에 대 한 유일한 옵션은 난소 직물의 cryopreservation. 불행히도, 지연된 revascularization follicular 생존을 위태롭게합니다. 여기, 우리는 공동 bioactive 분자의 직접 paracrine 배달 가속 결합 세포 기반 전략으로 활용 관류에 대 한 내 피 세포와 인간 난소 조직을 이식 하는 프로토콜을 제시.

초록

불 임은 화학요법 또는 방사선 치료와 일부 환자에 대 한 빈번한 부작용, oocytes 또는 배아의 cryopreservation는 옵션이 아니다. 대신,이 환자의 증가 cryopreserve autograft 위한 난소 조직을 선택 하는 복구 및 면제. 개선 결과 자동-cryopreserved 난소 조직 이식 받은 환자 중에 불구 하 고 효율적인 revascularization 이식할 조직의 주요 장애물 남아 있습니다. 허 혈을 완화 하 고 따라서 자동 이식 환자에 있는 결과 개선, 우리 난소 조직 관류 가속을 위한 혈관 세포 기반 전략 개발. 마우스가 종이 식 모델에서 cryopreserved 난소 조직으로 외 인 내 피 세포 (경영진)의 공동 이식 하는 방법을 설명합니다. 우리는 지속적인된 paracrine 난소 이식에 대 한 입력 신호를 활성화 constitutively 안티 Mullerian 호르몬 (AMH)를 표현 하기 위해 설계 되었습니다 경영진을이 이렇게 확장. 그리고 임원으로 공동 이식 증가 follicular 볼륨과 향상 된 antral 여 포 개발, AMH 표현 임원 승진 무부하 원시 낭의 보존. 이 결합 된 전략 허 혈을 완화 및 다 산 보존 불 임 대형의 컨텍스트에서 follicular 활성화 변조에 대 한 유용한 도구 있을 수 있습니다.

서문

개발된 된 세계에서 죽음의 주요 원인 가운데 암 남아 아직 수 십년 연구의 중요 한 진행 암, 그리고 일부의 경우 거의 두 배로 생존 율¹에 대부분의 종류에 대 한 굴복 했다. 불행히도, 종종 화학요법 에이전트는 gonadotoxic, 원시 낭 난소에서의 파괴 및 불 임²감소. 그러나이 인구 증가 다 산 보존 oocyte 또는 배아 cryopreservation 등의 다양 한 방법에서 혜택을 받을 수,, 암 치료와 사전 pubertal 환자의 신속한 개시를 요구 하는 환자는 이러한 옵션에 적격이 지 않다. 대신, 일부 환자는 전과 그들의 치료 처방 사업 복구 및 면제, 자동 이식 조직 다 산³복원 시 난소 조직 cryopreserve 선택 했습니다. 그러나, 날짜, 이식 생존 및 follicular 출력 자동 이식 다음에 상대적으로 낮은⁴, 조직 허 혈과 저 산소 증^5,,67때문에 주로 남아 있습니다. 난소의 피 질 이식의 생존 능력을 개선 하기 위해 수많은 노력에도 불구 하 고 안티 oxidants^8,9, 프로-신생 cytokines^{10,,1112,1 사용 하 여 3}또는 기계적인 조작¹⁴이식 허 혈 5-7 일 창 포스트 이식 가능성 및 이식⁷의 생존 저해. 이 해결 하기 위해 우리는 호스트와 이식 혈관의 문 합을 촉진 하기 위하여 따라서 난소 조직의 reperfusion 서두르는 셀 기반 전략을 개발 했다.

포스트 이식 창에서 이식할된 난소 조직에 허 혈 성 모욕 뿐만 아니라 간 follicular 신호 중단 풀^15,16의 고갈에 기여할 수 있습니다. 외 인 내 피 세포 (임원)는 이식의 주변에 있는 혈관을 안정적이 고 기능에 기여, 때문에 그들은 이식된 조직에 정의 된 분자 입력을 전달 하는 독특한 기회를 제시. 원리의 증거로, 경영진 안티 Mullerian 호르몬 (AMH), 소 낭 모양 성장¹⁷제한 표시 되었습니다 변형 성장 인자 베타 (TGFβ) superfamily의 구성원의 익스프레스 슈퍼 생리 적 수준으로 설계 했다. 공동 제어와 AMH 표현 세포 이식 이식 follicular 분포의 비교는 생물 학적 활동 엔지니어링된 경영진의 힘을 확인 합니다.

요약 하자면, 이식 가능성 및 억제 조 동원 follicular 풀을 개선 하 여이 이렇게 자동 이식 환자 다 산 보존 난소 조직의 생산성을 증가할 수 있다. 또한, ExEC 기반 플랫폼 follicular 개발에 연루 되어 분자 레 귤 레이 터의 실험 심문 수 있습니다.

프로토콜

동물 주제와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) Weill 코넬 의학 대학에 의해 승인 되었습니다. 난소 조직을 사용 하 여 모든 xenotransplantation 실험 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 인간의 난소 조직 화학 요법 이나 방사선 암 치료 또는 이전 골 수 이식 치료 예정 환자에서 수집 되었다. 기관 심사 위원회 (IRB) 위원회의 Weill 코넬 의학 대학 조직의 잠재적인 헌 용, 그리고 환자의 동의 연구 사용에 대 한 그들의 난소 조직의 최대 10%의 기부를 수행한 컬렉션 승인.

1입니다. 인간 난소 조직의 수집

참고: 때 난소 조직을 원격 시설 교통에서 수송 된다, 시간 5 h^18,19을 초과 하지 말아야 합니다.

1. 난소 조직 수집 하 고는 멸 균 생리 식 염 수로 헹 구 십시오.
2. 멸 균 용기에 난소를 놓습니다.
3. 난소는 완전히 매체에 잠기 다 때까지 Leibovitz의 L-15 매체를 붓는 다.
4. 닫고 컨테이너를 밀봉 합니다.
5. 얼음에 컨테이너를 수송.

2. 슈미트 외. 에서 적응 조달된 난소 조직 처리 ¹⁸

1. 난소 처리 및 동결에 대 한 준비
   1. 100 mL 매체의 처리를 위한 준비: Leibovitz의 L-15 중간 99 + 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 미디어를 필터링 합니다. 냉장 하는 매체를 유지.
   2. 100 mL cryo 막는으로 DMSO를 사용 하 여 냉동 솔루션의 준비. 추가 69.64 mL Leibovitz L-15 중간, 17.66 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 3.42 g (0.1 mol/L의 최종 농도 만들려고) 자당의 10.65 mL (1.5 mol/L의 최종 농도 만들려고) DMSO, 1 mL 항생제 antimycotic 솔루션. 150 mL 필터 유닛, 0.2 µ m. 4 ° c.에 중간 저장소를 사용 하 여 매체를 필터링
   3. 래핑된 고체 살 균 주기 위해 프로그램 압력솥을 사용 하 여 수술 도구를 소독.
2. 조직의 도착 시
   1. 무 균 수술 도구는 biosafety 내각 설정: 날카로운 곡선 잘 블레이드 번호 21, 메스가 위와 집게에 다양 한 크기: 긴 (약 150 m m 길이)와 중간 크기의 2 (약 110 m m 길이).
   2. 멸 균 장갑을 착용, biosafety 내각 내에서 컨테이너를 엽니다. 난소를가지고 하 고 150 mm 페 트리 접시에 부 어 냉 매체 난소 조직의 탈수를 방지 하기 위해 난소 위에 2.1.1 단계에서 준비.
   3. 어떤 잔여 조직에서 난소를 분리 하 고 조직 및 혈액 없다 때까지 차가운 매체와 그것을 씻어.
   4. 깨끗 한 150 mm 페 트리 접시에에서 난소, 차가운 추가 중간, 2.1.1 난소는 절반 그것에 빠져들 때까지 단계에서 준비.
3. 난소 조직의 해 부
   1. 난소를 이등분 하 고 곡선된 좋은 위를 사용 하 여 예리한 해 부에 의해 모 수를 먼저 제거 하는 방법. 다음에 블레이드 번호 21 살 균 메스를 사용 하 여, 모 다쳤어요. 대뇌 피 질의 조직 될 때까지 1-1.5 m m 두께에 앞.
   2. 대뇌 피 질의 조직 폭에서 2-3 mm의 조각으로 잘라, 스트립의 길이 처리 된 난소 작품의 전체 길이 될 것입니다.

3. 난소 조직 느린 동결, 뉴턴 외에서 적응. 그리고 아나 외. ^{6 , 20}

1. 동결에 대 한 준비
   1. 라벨 cryovials (1.8 mL).
   2. 2.1.2 각 유리병에 단계에서 준비 냉동 솔루션의 1.5 mL를 추가 합니다.
   3. 극저온 유리병 동결 솔루션이 포함 된 당 한 대뇌 피 질의 스트립 전송.
   4. Equilibrate 회전 접시에 20 분에 대 한 대뇌 피 질의 스트립, 부드러운 동요 4 ° c.에 적용
2. 천천히 난소 조직 동결
   1. 0 ° c.에 시작 하는 프로그래밍 가능한 평면 냉장고에는 cryovials를 로드
   2. 2 ° C/min-7 ° c에 냉각
   3. 10 분이 일정 한 온도에서 조직 유지.
   4. 액체 질소 (선₂)에 목화 팁 각 cryovial으로 얼음 크리스탈 nucleation 유도, 수동 시드를 수행 합니다.
   5. 0.3 ° C/min에 시료의 온도-40 ° c.에 도달할 때까지 계속
   6. -140 ° c에 10 ° C/min의 빠른 속도로 냉각
   7. LN2에 저장 dewar cryovials 전송 (-196 ° C).

4. 수술 (양측 Oophorectomy와 공동 이식)에 대 한 준비

1. 접시의 준비
   1. 이식에 대 한 난소 조직을 녹고 전날
      1. 50 mm 페 트리 접시의 하단에 플라스틱 파라핀 필름 조각을 넣으십시오, 스프레이 그것을 70% 에탄올까지 완전히 덮여 있을 것입니다.
      2. 페 트리 접시 하룻밤에 떠나지는 biosafety 캐비닛. 마우스 당 2 접시를 준비 합니다.
   2. 수술 날에
      1. Biosafety 내각 내에서 플라스틱 파라핀 영화를 포함 하는 배양 접시에서 에탄올 발음
      2. 에탄올을 완전히 증발 될 때까지 페 트리 접시 리드를 반 열어 둡니다.
      3. 플라스틱 파라핀 영화는 완전히 건조 될 때 페 트리 접시의 뚜껑을 닫습니다. 유지는 biosafety 내 캐비닛.
      4. 0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 0.1 mol/L 자당, 기본적인 녹고 솔루션 (BTS), 매체는 6의 레이블 우물 잘 따라, 플레이트.
2. 솔루션의 준비
   1. BTS의 100 mL를 준비: Leibovitz의 L-15 중간 79 mL + FBS 20 mL + 항생제 Antimycotic 솔루션 1 mL. 0.22 μ m 필터 시스템으로 필터링 합니다.
   2. 0.1 mol/l 자당 BTS의 10 mL를 준비 합니다. 자당의 0.342 g 확장 하 고 준비 단계 4.2.1, 동요는 자당 완전히 해산 될 때까지 부드럽게에서 BTS의 10 mL를 추가 합니다. 필터 주사기를 사용 하 여 솔루션 0.22 μ m 필터.
   3. 표 1에 따라 솔루션을 준비 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 DMSO를 포함 하는 관. 사용할 때까지 냉장 하십시오.

5. 난소 조직을 급속 한 해빙

1. LN₂ 를 꺼내 dewar 난소 조직 동결을 포함 하는 유리병 30 실 온에서 보관 하 고 s.
2. 티슈 페이퍼를 사용 하 여 깨끗 한 유리병을 닦아냅니다.
3. 1-2 분까지 30 ° C 물 욕조에 유리병을 담가 그것의 ' 콘텐츠 해 동.
4. 유리병을 열고 첫 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 1 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비) 3 ml를 포함 하는 첫 번째 잘에서 대뇌 피 질의 스트립을 놓습니다.
   참고: 모든 단계는 접시의 뚜껑을 열고 관련 된 층 류에서 수행 됩니다.
5. 알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 4 ° C에서 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.
6. 두 번째 솔루션 (0.1 mol/L 자당 + 0.5 mol/L DMSO, 단계 4.2.3에서에서 준비)의 두 번째 잘 포함 3 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
7. 알루미늄 호 일이 단계에 대 일 분 접시 덮여 유지 위한 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 6 잘 플레이트를 품 어.
8. 솔루션 (0.1 mol/L 자당, 4.2.2 단계에서 준비와 BTS)의 4 mL를 포함 하는 세 번째 잘으로 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
9. 5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.
10. 솔루션 (BTS, 단계 4.2.1에서에서 준비)의 네 번째 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다.
11. 5 분 동안 4 ° C에서 부드러운 동요에 대 한 회전 접시에 품 어.
12. (2.1.1 단계에서 준비) 차가운 매체의 마지막 잘 포함 4 mL에 대뇌 피 질의 스트립을 전송 합니다. 얼음 해 동된 난소 조직을 이식 수행까지 유지.

6입니다. 난소 조직의 캡슐화

1. 다음 솔루션을 준비
   1. 25 mL의 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼를 준비 합니다. 필터와 4 ° c.에 게
   2. CaCl₂ 농도 1 mol/l. 필터의 1 mL를 준비 하 고 4 ° c.에 저장
2. Fibrinogen 50 mg/mL 재고 솔루션을 준비
   1. 천천히 fibrinogen는 HEPES에 혼합 하 여 0.9% 식 염 수에 20 mmol/L HEPES 버퍼의 20 mL으로 Fibrinogen의 1 g 37 ° c.에 몇 시간 동안 염 분 버퍼 추가
   2. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.
   3. 0.45 μ m 주사기 필터를 통해 그리고 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 솔루션을 필터링 합니다.
   4. 약 수 마이크로 원심 튜브와-20 ° c.에 게 200 µ L로 솔루션
3. 트 롬 빈 100 U/mL 재고 솔루션을 준비
   참고: 트 롬 빈 솔루션 adsorb 유리, aliquot 플라스틱 튜브/튜브에 솔루션.
   1. 트 롬 빈의 U 250에 0.9% 멸 균 식 염 수의 2.5 mL를 추가 합니다.
   2. 솔루션 완전히 녹을 때까지 부드럽게 흔들어입니다.
   3. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브 라벨.
   4. 마이크로 원심 튜브 및 저장소-80 ° c.에 aliquot 50 µ L 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링
4. 70 µ L, 10 mg/mL fibrinogen 및 5 U/mL 트 롬 빈의 최종 농도 얻기의 섬유 소 혈전을 만들기
   참고: 빨리, 몇 초에 솔루션 병 일 있는지 확인 합니다. 또한, 혼합물에 거품의 추가 하지 마십시오.
   1. 1.7 mL 마이크로 원심 튜브에서 Fibrinogen 솔루션을 준비 합니다.
      1. 360 추가 20 mmol/L의 µ L HEPES Fibrinogen 주식의 aliquoted 200 µ L 0.9% 염 분 해결책에서 버퍼링 단계 6.2.4에서에서 준비.
      2. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      3. 얼음에 그것을 유지.
   2. 두 번째 마이크로 원심 튜브에서 트 롬 빈 솔루션을 준비 합니다.
      1. DMEM의 148.7 µ L, 트 롬 빈의 aliquoted 50 µ L을 추가 단계 6.3.4에서에서 준비.
      2. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      3. 1 mol/L CaCl₂의 1.3 µ L를 추가 합니다.
      4. 부드러운 pipetting으로 혼합.
      5. 얼음에 그것을 유지.
   3. 3 마이크로 원심 튜브에서 단일 셀 정지를 준비 합니다.
      1. 격판덮개는 효소 세포 분리 매체를 사용 하 여에서 설계 된 내 피 세포를 분리 합니다.
      2. 스핀 다운는 커버 유리를 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 카운트.
      3. 난소 조직 마다 1 m m² 당 20000 셀을 사용 합니다. M m²에서 난소 조직의 20000 x 영역을 계산 합니다.
      4. 설계 된 내 피 세포 아래로 회전 시키십시오 그리고 다시 기본 매체 (DMEM) 16.8 µ L의 총 볼륨에 도달에서 그것을 중단.
      5. 얼음에 그것을 유지.
   4. 몇 초 동안 그것을 건조 멸 균 거 즈 스펀지에 난소 조직의 조각을 넣으십시오.
   5. 50 mm 페 트리 접시 내 플라스틱 파라핀 필름 위에 난소 조직의 조각 장소.
   6. 세포 현 탁 액 단계 6.4.3.4, 부드러운 pipetting으로 믹스에서에서 준비에 준비 단계 6.4.1.2, Fibrinogen 솔루션의 39.2 µ L를 추가 합니다. 얼음에 그것을 유지.
   7. 6.4.2.4 단계에서 준비 하는 트 롬 빈 솔루션의 14 µ L를 추가 합니다. 한 번 pipetting으로 부드럽게 혼합. 빠른 작업.
   8. 난소 조직 위에 혼합 배치 피펫으로 길쭉한 작은 물방울의 형태로.
   9. 37 ° c.에 인큐베이터에는 응고와 페 트리 접시를 놓으십시오

7. 양자 Oophorectomy와 공동 NSG 마우스 조작된 내 피 세포와 인간 난소 조직 이식

참고: 10 14 주 된 여성 NSG 쥐²¹ 사용 했다 (잭슨 실험실).

1. 2.1.3 단계에서 정교로 모든 수술 도구를 준비, 모든 봉합, 패드, 및 유용 외과 테이프를가지고 있는지 확인 하십시오.
2. 마우스와 Isoflurane 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize
   1. 유도 챔버에 마우스를 놓고 뚜껑 닫고 적절 한 자 지를 엽니다.
   2. 오픈 유량 1000 mL/분 하는 기화 기에 설정 하 고 설정 2-3.5% 제공.
   3. 마 취;의 효과 관찰 의식, 천천히 그리고 일반 호흡의 손실입니다.
   4. 마 취를 유지 하는 원뿔을 전송. 생체 신호에 따라 1-3%를 제공 하는 기화 기를 설정 합니다.
   5. 페달 또는 꼬리 반사의 부재를 확인 합니다. 그것은 결 석 때까지 반사 있으면 isoflurane 증가.
3. 전기 헤어 트리머를 사용 하 여 clavicles 줄에서 마우스의 뒤로 머리를 잘라.
4. 수술 플랫폼에서 발생 하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다.
5. 외과 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼 코 콘 수정 합니다.
6. 1.25 cm 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼을 부드럽게 마우스의 사지를 테이프.
7. 살 균 윤활제 젤리를 사용 하 고 수술 플랫폼 1.25 c m 구멍 플라스틱 외과 테이프를 사용 하 여 그것을 녹화 하 여 홍보 수정 온도계 온도계를 삽입.
8. 테이프 2.5 c m 넓은 외과 종이 테이프를 사용 하 여 수술 플랫폼에 꼬리.
9. 적외선 또는 열 패드, 온수를 사용 하 여 열 하 고 절차를 통해 마우스의 온도 모니터링 합니다. 35-37 ° c.의 범위 내에서 체온을 유지
10. 살 균 Povidone-요오드 솔루션 면봉 막대기로 잘린된 영역을 청소 하 고 닦아 무 균 알코올 준비를 사용 하 여.
11. 6.9 두 번 더 반복 합니다.
12. 탈수에서 보호 하 고 각 막에 손상에 마우스의 눈의 각각 메 마른 눈 윤활제 수 의사 연 고의 드롭 장소.
13. 메 마른 외과 용 드 레이프를 사용 하 여 마우스를 커버.
14. 주사 Buprenorphine (1 mg/Kg) 하위 피부 (S/C).
15. 메스 (블레이드 #21)를 사용 하 여 경도 중간 등 쪽 절 개를 수행 합니다.
16. 양국간 oophorectomy를 지 방식을 사용 합니다.
    1. 피하 결합 조직 무딘 해 부가 위를 사용 하 여 무료.
    2. 중간 확인 절 개를 옆으로 근 막 꼬 집 고 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍에 도달.
    3. 난소와 난소 지방 패드 부드럽게 핀셋으로을 복 부 구멍에 그것을 꺼내.
    4. 혈관 클램프와 난소 및 지방 패드를 파악.
    5. 난소와 난소, 나 팔 관을 원심의 기지에서 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 지방 패드를 선.
    6. 넥타이 원심 난소를 클립. 그 루터 기의 기지에서 아무 출혈은 다는 것을 확인 하십시오.
    7. 복 부 구멍으로 다시 조직을 놓고 6/0 꼰된 흡수 봉합 사를 사용 하 여 근 막 봉합 합니다.
    8. Contralateral 측면 단계 7.15.1-7.15.7를 반복 합니다.
17. 공동 난소 조직을 이식.
    1. Gluteus Maximus 혈전 크기에 맞는 길이에 위에 근 막에 수평 절 개를 수행 합니다. 근 막 아래가 위를 열어이 가상 공간 내에서 포켓을 만듭니다.
    2. 단계 6.4.8에서에서 준비 캡슐화 대뇌 피 질의 조직의 원피스를 선택 하 고이 주머니에.
    3. 6/0를 사용 하 여 근 막 봉합 꼰 흡수 봉합 사.
18. 또한 contralateral 측면 단계 7.16.1-7.16.3를 반복 합니다.
19. 간단한 중단된 바늘 4/0 monofilament 흡수 봉합 사를 사용 하 여 등 쪽 벽을 닫습니다.
20. Lidocaine 주사 0.5% (1.2 mL/Kg) 절 개 사이트에 S/C.
21. 무 균 알코올 준비를 사용 하 여 피부를 청소.
22. 해제는 isoflurane 마우스의 온도 모니터링 하는 동안.
23. O₂, Isoflurane 없이 1-2 분을 제공 합니다. 그것은 이동 하 고 의식 돌아가기 시작 될 때까지 마우스를 온난화에 계속.
24. 깨끗 한 복구에 마우스를 놓고 수술 상처의 완전 한 치료까지 나중에 별도 마우스를 집.
25. 필요에 따라 모든 8-12 h 24 h postoperatively Buprenorphine (1 mg/Kg) S/C를 주입.
26. 실험의 끝 지점까지 모든 음식, 물, 침구, 및 감 금 소는 압력가 마로 소독, 쥐 별도 연습장에 계속. 가압 통풍이 방에 감 금 소를 유지. 개인 보호 장비를 사용 하 여 쥐를 처리 하는 때마다.

결과

경영진의 공동 이식 환자의 조직에 게 혜택 제공 여부를 확인 하려면 해 동된 난소 외피 스트립 동등한 크기의 조각으로 분할 되었고 양측 면역-손상, 끄 덕 scid 감마 (NSG), 쥐에 engrafted. 한쪽에 포함 된 섬유 소 혈전 혼자 (ECs) 그리고 다른 포함 임원 (그림 1a)와 각 마우스 자체 컨트롤을 역임 했습니다. 경영진은 인간의 탯 및 앞에서 설명한

토론

여기 우리 경영진의 그 공동 이식 보여 난소 조직 생존 능력 및 기능 마우스에이 종이 식 다음에 상당한 혜택을 제공 합니다. 난소 조직 자동-다 산 보존을 위한 이식의 임상 적용에 대 한 표준을 설정 하 고 최적의 매개 변수 (크기, 이식 사이트, 이식 등의 기간) 되지 않은 ^{32 , 33 , 34} follicular 풀의 향상 된 복구에 대 한 정?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	11415064
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	Anti-Anti X100
Sucrose	Sigma	S 1888
Fibrinogen	Sigma	F 8630	from bovine plasma
Thrombin	Sigma	T 1063	from human plasma
DMSO	Sigma	D 2650
DMEM	Gibco	12491015
Enzyme Cell Detachment Medium	Invitrogen	00-4555-56	Accutase
Plastic paraffin film	Bemis NA		Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm	3M	1530-1	Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm	3M	1530-0	Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm	3M	1527-0	Transpore
Monofilament Absorbable Suture	Covidien	UM-203	Biosyn
Braided Absorbable Suture	Covidien	GL-889	Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%	Purdue Products	67618-153-01	Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales	Nunc	377267	CryoTube
sterile ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube	Denville	C-2172	Eppendorf
Anasthesia system	VetEquip	V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells	Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA		Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain	Sigma	HT15-1kt	Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin	Invitrogen	I32450	isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate