設計の内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植: セル ベースの戦略の組み合わせは直接パラクリン配信による血液灌流を加速

要約

何人かの患者の妊孕性温存のための唯一のオプションは卵巣組織の凍結保存です。残念ながら、遅延の血行再建術は、濾胞性を損ないます。ここでは、共同生物活性分子の直接パラクリン配信と加速を組み合わせたセル ベースの戦略として利用循環内皮細胞とひと卵巣組織を移植するためのプロトコルを提案する.

要約

不妊症は化学療法および/または放射線療法の何人かの患者のための頻繁な副作用、卵子や胚の凍結保存は、オプションではありません。自家の卵巣組織の凍結保存する代わりに、これらの患者数の増加の選択次の回復と赦し。凍結保存した卵巣組織の自動移植を受ける患者の転帰の改善にもかかわらず移植組織の効率的な血行再建術の主要な障害のままです。虚血を軽減し自動移植を受ける患者の転帰を向上させる、卵巣組織の灌流を加速するための血管細胞ベースの戦略を開発しました。マウス異種移植モデルにおける卵巣組織の凍結保存と外因性血管内皮細胞 (幹部) の共同移植法について述べる。私たちは持続的なパラクリン シグナル移植卵巣への入力ができ恒常抗ミュラー管ホルモン (AMH) を表現するために設計されている幹部を採用するこのアプローチを拡張します。幹部と共同移植増加卵胞ボリュームと改良された幽門発育卵胞、AMH を表現する幹部昇格静止原始卵胞の保持。この複合戦略虚血を軽減し、妊孕性温存や大規模で不妊のコンテキストで卵胞活性化を調節することのための便利なツールがあります。

概要

がんは、先進国の死の主要な原因の中ではまだ数十年の研究のほとんどの種類のがん、およびいくつかの場合 2 倍近く生存率¹に向けて大きな進展が得られています。残念ながら、化学療法薬が gonadotoxic、多くの場合卵巣内の原始卵胞のリザーブを破壊し、出生率²を削減です。この人口の増加は卵子や胚の凍結保存を含む妊孕性温存のさまざまな方法の恩恵を受けることができます、ただし、がん治療、思春期前の患者の発生を必要とする患者はこれらのオプションの対象ではありません。代わりに、何人かの患者は彼らの治療を着手する前に、回復と赦し、不妊³を復元する自動移植組織に卵巣組織の凍結保存する選択しました。まだ、日には、着と卵胞出力自動移植まま組織虚血と低酸素^5,6、7のために主に、比較的低い⁴。卵巣皮質移植の生存率を改善するために多くの努力にもかかわらず抗酸化物質^8,9, プロ新生サイトカイン^{10、11,12,1 を使用してください。}移植後 5 に 7 日ウィンドウで³、または機械的操作¹⁴グラフトの虚血を損なう生存率および移植の⁷サバイバル。この問題を解決、ホストとグラフト血管の吻合を容易にし、このように卵巣組織の再灌流を早めるために細胞に基づく戦略を開発しました。

移植後ウィンドウ内移植卵巣組織に虚に加えて間卵胞シグナル伝達の混乱プール^15,16の枯渇に貢献するかもしれない。外因性血管内皮細胞 (幹部) は、移植片の周囲血管の安定と機能に貢献するため、移植された組織に定義された分子入力を伝えるためにユニークな機会を提示します。原則の証拠として幹部は抗ミュラー管ホルモン (AMH) 卵胞¹⁷を制限する示されている変形の成長因子ベータ (TGFβ) スーパーファミリーのメンバーのエクスプレス超生理学的レベルに設計されました。共同管理と AMH 発現細胞移植移植で卵胞の分布の比較生物学的活性および設計された幹部の効力を検証します。

要約すると、卵胞のプールのグラフト生存し、抑制する早期動員の向上このアプローチ増やすことが患者の妊孕性温存の自動移植卵巣組織の生産性。また、ExEC ベースのプラットフォームは、卵胞の発育に関与している分子の調節物質の実験的尋問をできます。

プロトコル

動物を対象とするすべての手順は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ワイル ・ コーネル医科大学によって承認されています。関連するガイドラインは法令に従い卵巣のティッシュを使用してすべての異種移植実験を行った。ひと卵巣組織は、化学療法や放射線治療がん治療や前骨髄移植予定の患者から採取しました。制度上の審査委員会 (IRB) 委員会のワイル ・ コーネル医科大学組織の潜在的な自己使用と彼らの卵巣組織研究用の 10% までの寄付を行った患者のインフォームド コンセントのコレクションを承認しました。

1. ひと卵巣組織のコレクション

注: リモート施設交通から卵巣組織が運ばれるとき時間を超えない 5 h^18,19。

1. 卵巣の組織を収集し、溶液を滅菌生理食塩水ですすいでください。
2. 滅菌コンテナーに卵巣を配置します。
3. 媒体に完全に没頭して、卵巣までリーボビッツの L-15 媒体を注ぐ。
4. 閉じ、容器を密封します。
5. 氷の上のコンテナーを輸送します。

2. 適応シュミットらから調達した卵巣組織の処理¹⁸

1. 卵巣の処理および凍結のための準備
   1. 処理のための媒体の 100 mL の準備: リーボビッツの L-15 中 99 mL + 1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。0.2 μ m フィルターを使用してメディアをフィルターします。冷蔵中を保ちます。
   2. 低温保護剤として DMSO を使用して凍結溶液 100 mL を準備します。69.64 mL リーボビッツの L-15 中、17.66 mL ウシ胎児血清 (FBS)、ショ糖 (最終濃度 0.1 mol/L を作成)、3.42 g 10.65 mL (1.5 モル/L の最終濃度を作成する) には、DMSO を追加し、1 mL 抗生物質抗真菌薬ソリューション。150 mL フィルター ユニット、0.2 μ m ストア 4 ° C で媒体を使用してメディアをフィルターします。
   3. ラップされた固形物の滅菌サイクルのためにプログラム、オートクレーブを使用して手術器具を滅菌します。
2. 組織の到着
   1. キャビネット、バイオ セーフティにおける滅菌の手術器具を設定: シャープ罰金湾曲ブレード数 21、メスのハサミ、鉗子で様々 なサイズ: ロング (約 150 mm) と中型 2 (約 110 mm)。
   2. 滅菌手袋を着用する、バイオ セーフティ キャビネット内のコンテナーを開きます。卵巣を取ると 150 mm ペトリ皿にそれを置くし、卵巣組織の脱水を防ぐために卵巣の上に 2.1.1 手順で調製した冷たい培地を注ぐ。
   3. 任意の残留組織から卵巣の分離、組織や血液を欠いてまで寒い中それをすすいでください。
   4. きれいな 150 mm のペトリ皿に卵巣を配置して、風邪を追加中、2.1.1 卵巣が半分で水没するまでのステップで準備されました。
3. 卵巣組織の郭清
   1. 卵巣を二等分して曲線の良いはさみを使用して、シャープな郭清によって最初に髄質を削除します。滅菌メスを用いたブレード数 21 で延髄をこすり。大脳皮質組織は厚さが 1 〜 1.5 ミリメートルまでの前に。
   2. 幅 2-3 mm の千切りに大脳皮質組織をカット、ストリップの長さは処理された卵巣部分の全体の長さになります。

3. 卵巣組織遅い凍結、ニュートンらから適用しました。オクタイら^6,20

1. 凍結のための準備
   1. クリオバイアル (1.8 mL) のラベルを付けます。
   2. 2.1.2 各バイアルの手順で準備凍結溶液 1.5 mL を追加します。
   3. 凍結溶液極低温バイアルあたり 1 つの皮質ストリップを転送します。
   4. 回転プレート上で 20 分間皮質のストリップを平衡させ、4 ° C で穏やかな攪拌を適用
2. 遅い卵巣組織の凍結
   1. 0 ° C から始まるプログラム可能な平面の冷凍庫に、クリオバイアルを読み込む
   2. -7 ° C に 2 ° C/分でクールな
   3. 10 分のこの一定した温度で組織を維持します。
   4. 綿棒を液体窒素 (LN₂) 中に浸漬と各クリオバイアルに触れることにより、氷結晶核形成誘導の手動シードを実行します。
   5. サンプル温度が-40 ° c. に達するまで 0.3 ° C/分で冷却し続ける
   6. -140 ° C まで 10 ° C/分の速度で冷却します。
   7. LN2 のストレージのデュワーにクリオバイアルを転送 (-196 ° C)。

4. 手術 (両側の卵巣と共同移植) のための準備

1. プレートの準備
   1. 移植卵巣組織を融解前日
      1. 50 mm のペトリ皿の下部にプラスチック パラフィン膜の部分を置き、70% スプレー エタノールそれの完全に覆われているまで。
      2. 一晩を残す、ペトリ皿、バイオ セーフティにおけるキャビネット。マウスあたり 2 枚のペトリ皿を準備します。
   2. 手術の日
      1. シャーレ バイオ セーフティ キャビネット内プラスチック パラフィン フィルムを含むからエタノールを吸引します。
      2. エタノールが完全に蒸発するまで、ペトリ皿リードは半分開いたままにしておきます。
      3. プラスチック パラフィン フィルムが完全に乾燥するとき、シャーレの蓋を閉じます。キャビネット、バイオ セーフティ内でそれを保ちます。
      4. 6 ラベル井戸ウェル プレート、0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L DMSO、0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、0.1 mol/L 基本的な解凍ソリューション (BTS)、ショ糖培地。
2. 溶液の調製
   1. BTS の 100 mL を準備: リーボビッツの L-15 中 79 mL + FBS 20 mL + 抗生物質抗真菌薬液 1 mL。0.22 μ m のフィルター システムをフィルター処理します。
   2. 0.1 mol/L ショ糖と BTS の 10 mL を準備します。ショ糖の 0.342 g をスケールし、BTS ステップ 4.2.1、サッカロースは完全になるまでそっと撹拌機で準備の 10 mL を追加します。シリンジ フィルター 0.22 μ m を使用して、ソリューションをフィルター処理します。
   3. 表 1に従ってソリューションを準備します。アルミ箔で DMSO を含むチューブをカバーします。使用するまで冷蔵しておきます。

5. 卵巣組織の急速な融解

1. LN₂の取るデュワー卵巣組織の凍結バイアル含む 30 の部屋の温度でそれを維持と s。
2. バイアルをティッシュ ペーパーを使ってきれいに拭いてください。
3. まで 1-2 分の 30 ° C の水浴のバイアルを浸しその ' コンテンツを解凍します。
4. バイアルを開き、最初の溶液 (0.1 mol/L スクロース + 1 mol/L 4.2.3 準備した DMSO) 3 ml を含む最初の井戸で皮質のストリップを配置します。
   注: 層流の下でプレートの蓋を開けるに関連するすべての手順を行います。
5. このステップのアルミ箔で 5 分維持プレート カバー 4 ° C で回転皿の上 6 ウェル プレートを孵化させなさい。
6. (0.1 mol/L スクロース + 0.5 mol/L DMSO、4.2.3 準備した) の 2 番目のソリューションの 2 番目も含む 3 mL に皮質のストリップを転送します。
7. このステップのアルミ箔を 5 分保持プレート カバーの 4 ° C で穏やかな撹拌のため回転板 6 ウェル プレートを孵化させなさい。
8. 4 mL の溶液 (0.1 mol/l ショ糖、4.2.2 準備した BTS) を含む 3 番目の井戸に皮質のストリップを転送します。
9. 4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。
10. ソリューション (BTS、4.2.1 の手順で準備) の 4 番目も含む 4 mL に皮質のストリップを転送します。
11. 4 ° C で 5 分間の穏やかな撹拌のため回転板上の孵化させなさい。
12. 最後も含む (2.1.1 の手順で調製した) 冷たい培地 4 mL に皮質のストリップを転送します。氷の融解の卵巣組織を移植を実行するまでしてください。

6. 卵巣組織のカプセル化

1. 次の解決策を準備します。
   1. 20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液 0.9% 生理食塩水中での 25 mL を準備します。フィルターし、4 ° C で保存
   2. CaCl₂ 1 mol/L フィルターの濃度での 1 mL を準備し、4 ° C で保存
2. フィブリノゲン 50 mg/mL のストック溶液を調製します。
   1. 37 ° C で数時間にわたって 20 ミリ モル/L HEPES 緩衝液、HEPES にフィブリノゲンをゆっくりと混合することによって 0.9% 生理食塩水 20 mL にフィブリノゲン 1 g 緩衝生理食塩水を追加します。
   2. 1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
   3. 0.45 μ m のシリンジ フィルターを通してし、0.2 μ m のシリンジ フィルターを通してソリューションをフィルターします。
   4. 200 μ L マイクロ遠心チューブに-20 ° C でストアにソリューションの約数
3. トロンビン 100 U/mL の原液を準備します。
   注: ガラス、分注にトロンビン ソリューション吸着プラスチック チューブ/バイアルのソリューション。
   1. トロンビンの 250 U に 0.9% 生理食塩水 2.5 mL を追加します。
   2. 完全に解消するソリューションまで穏やかな揺れ。
   3. 1.7 mL マイクロ遠心チューブにラベルを付けます。
   4. 0.2 μ m のシリンジ フィルター、マイクロ遠心チューブ、-80 ° C の店に 50 μ L 分注をフィルター処理します。
4. 70 μ L、10 mg/mL フィブリノゲンと 5 U/mL トロンビンの最終的な集中を取得のフィブリン血栓を作る
   注: 高速に動作することを確認、ソリューションが数秒で凝固します。また、泡の混合物に添加を避けます。
   1. 1.7 mL マイクロ遠心管中のフィブリノーゲン ソリューションを準備します。
      1. 360 を追加 20 ミリ モル/L の μ L HEPES バッファー フィブリノゲン株式の検体 200 μ L に 0.9% 食塩水内 6.2.4 の手順で準備します。
      2. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      3. 氷の上におきます。
   2. 番目のマイクロ遠心チューブにトロンビン溶液を準備します。
      1. トロンビン株式の検体の 50 μ L を DMEM の 148.7 μ L を追加 6.3.4 の手順で準備します。
      2. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      3. 1 mol/l CaCl₂1.3 μ L を追加します。
      4. 穏やかなピペッティングで混ぜます。
      5. 氷の上におきます。
   3. 3 番目のマイクロ遠心チューブに、単一細胞懸濁液を準備します。
      1. 酵素細胞剥離培地を用いた平板から設計された血管内皮細胞をデタッチします。
      2. スピン ・ ダウン、カバーガラスと診断を使用してセルをカウントします。
      3. 卵巣組織ごとに 1 mm²あたり 20,000 セルを使用します。Mm²の卵巣組織の 20,000 x 領域を計算します。
      4. スピン ・ ダウン設計の内皮細胞と再基本培地 (DMEM) 16.8 μ L の容量に到達するために中断します。
      5. 氷の上におきます。
   4. 数秒間乾燥滅菌ガーゼ スポンジの卵巣組織片を配置します。
   5. 50 mm のペトリ皿内プラスチック パラフィン フィルム上に卵巣の組織片を配置します。
   6. 6.4.3.4、穏やかなピペッティングによるミックスの手順で作製した細胞懸濁液に 6.4.1.2 の手順で用意して、フィブリノゲン ソリューションの 39.2 μ L を追加します。氷の上におきます。
   7. 6.4.2.4 の手順で、トロンビン溶液の 14 μ L を追加します。一度ピペットで穏やかに混合します。高速に動作します。
   8. 卵巣組織の上に混合物を配置ピペット細長い液滴の形で。
   9. 37 ° C でインキュベーターで血栓にペトリ皿を置く

7. 両側の卵巣と NSG マウスに設計された内皮細胞とひと卵巣組織の共同移植

注: 10 14 週齢女性 NSG マウス²¹が使用された (ジャクソン研究所)。

1. 2.1.3 の手順で詳しく述べられているのすべての手術器具を準備、縫合糸、パッド、サージカル テープ ハンディがあるかどうかを確認します。
2. イソフルレンで麻酔システムを使用してマウスを麻酔します。
   1. 誘導チャンバーにマウスを置き、ふたを閉じ、適切なバルブを開きます。
   2. オープン流量計、気化器をオンに 1,000 mL/分にし 2-3.5% を提供するように設定します。
   3. 麻酔の効果を確認します。意識、遅いと通常呼吸の損失。
   4. 麻酔を維持するために鼻の円錐形に転送します。バイタル サインによっての 1-3% を提供する気化器をオンにします。
   5. ペダルまたはテールの反射の有無を確認します。反射が存在する場合は、それは存在しないまで、イソフルランを増やします。
3. 電気髪トリマーを使用して鎖骨ラインまで尾からマウスの後ろの髪をトリミングします。
4. 腹臥位手術のプラットフォーム上にマウスを配置します。
5. サージカル テープを使用して手術のプラットフォームに鼻の円錐形を修正します。
6. 1.25 cm wide 手術紙テープを用いた手術のプラットフォームに優しくマウスの手足をテープします。
7. 無菌潤滑ゼリーを使用し、1.25 cm の穴あきプラスチック サージカル テープを使用して手術のプラットフォームにテーピングで広報修正温度計温度計を挿入します。
8. テープ 2.5 cm の広範囲の外科的紙テープを用いた手術のプラットフォームに尻尾。
9. 熱、赤外線または加熱パッド、お湯を使用し、プロシージャ全体でマウスの体温を監視します。35-37 ° c. の範囲の内で体温を保つ
10. 滅菌ポビドン ヨード液綿棒スティックとトリム エリアをきれいにし無菌アルコール準備を使用して拭いてください。
11. 6.9 倍の手順を繰り返します。
12. 脱水から保護し、角膜にダメージを与えるマウスの目の各滅菌眼潤滑獣医軟膏のドロップを配置します。
13. 滅菌手術用ドレープを使用してマウスをカバーします。
14. ブプレノルフィン (1 mg/Kg 皮下 (S ・ C) を挿入します。
15. メス (刃物 #21) を使用して縦内側背側切開を実行します。
16. 両側卵巣摘出例を実行、背側アプローチを使用します。
    1. はさみを使って切開して皮下の結合組織を解放します。
    2. 正中を切開して横方向に筋膜をピンチし、鋭いはさみを使用して腹腔内に達する。
    3. 卵巣の脂肪パッドと卵巣をピンセットでそっとつかむ、腹腔内から引き出します。
    4. 血管クランプと卵巣と脂肪パッドを把握します。
    5. 卵巣と卵巣、卵管の遠位の基地で 4/0 のモノフィラメントの吸収性の縫合糸を使用して脂肪パッドを縛る。
    6. ネクタイの遠位の卵巣をクリップします。切り株の根元から出血がないかどうかを確認します。
    7. 組織を腹腔内に戻し、6/0 の編みこみ吸収性縫合糸を用いた筋膜を縫合します。
    8. ステージ側で 7.15.1-7.15.7 を繰り返します。
17. 共同卵巣組織を移植します。
    1. 血栓の大きさに合った長さで大殿の上筋膜の横切開を実行します。筋膜の下にはさみを開くことによってこの仮想空間内でポケットを作成します。
    2. 6.4.8 の手順で準備としてカプセル化された皮質組織の 1 つの作品をピックアップし、このポケットにそれを置きます。
    3. 6/0 を使用した筋膜縫合糸は吸収性縫合糸を編組。
18. 側同様に段階 7.16.1-7.16.3 を繰り返します。
19. 背壁 4/0 のモノフィラメントの吸収性縫合糸で簡単な中断されたステッチを使用してを閉じます。
20. リドカインを注入する 0.5% (1.2 mL/Kg) 切開部位で S ・ C。
21. 滅菌アルコール準備を使用して、皮膚をきれいにします。
22. マウスの温度を監視しながら、イソフルランをオフにします。
23. O₂、イソフルランなしの 1-2 分を提供します。それを開始する移動し、意識に戻るまでマウスを温暖化維持に。
24. きれいに回復ケージの中にマウスを置くし、後で手術の傷の完全な治癒まで別々 のケージでマウスの家します。
25. 術後 24 時間ごとの 8-12 h を必要に応じて、ブプレノルフィン (1 mg/Kg) S/C を挿入します。
26. 実験の終了点まですべての食料、水、寝具、ケージ、オートクレーブときに、別ケージでマウスを飼うため。加圧換気の部屋にケージをしてください。個人用保護具を使用して、マウスを処理するたびに。

結果

幹部の共同移植が患者の組織にメリットを提供するかどうかを決定するには、解凍卵巣皮質ストリップ サイズの等しい部分に分けられ、免疫妥協された NOD scid ガンマ (NSG) マウスに両側にしみ込んでいます。フィブリン血栓だけで (ない ECs) と含まれている幹部 (図 1 a) に埋め込まれている 1 つの側面で各マウスは独自のコントロールとして提供...

ディスカッション

ここに示す幹部の共同移植卵巣組織の生存率および機能のマウス異種移植に大きな利点があります。妊孕性温存の卵巣組織自動移植の臨床応用のための標準セットと最適なパラメーター (サイズ、移植サイト、移植等の期間) されていません。^32,33,34卵胞のプールの強化された回復の未定義のまま。自動移植を実行す...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	11415064
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	Anti-Anti X100
Sucrose	Sigma	S 1888
Fibrinogen	Sigma	F 8630	from bovine plasma
Thrombin	Sigma	T 1063	from human plasma
DMSO	Sigma	D 2650
DMEM	Gibco	12491015
Enzyme Cell Detachment Medium	Invitrogen	00-4555-56	Accutase
Plastic paraffin film	Bemis NA		Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm	3M	1530-1	Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm	3M	1530-0	Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm	3M	1527-0	Transpore
Monofilament Absorbable Suture	Covidien	UM-203	Biosyn
Braided Absorbable Suture	Covidien	GL-889	Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%	Purdue Products	67618-153-01	Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales	Nunc	377267	CryoTube
sterile ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube	Denville	C-2172	Eppendorf
Anasthesia system	VetEquip	V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells	Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA		Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain	Sigma	HT15-1kt	Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin	Invitrogen	I32450	isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate