JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבור חלק מהחולים, האפשרות היחידה לשימור פוריות היא הקפאה קריוגנית רקמת השחלה. למרבה הצער, שאיחרו revascularization מערערת הכדאיות הזקיקים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיתוף להשתיל רקמה אנושית השחלות עם תאי אנדותל עבור זלוף ניצול כאסטרטגיה מבוססת תא שילוב מואצת עם משלוח ישיר paracrine של מולקולות ביו...

Abstract

פוריות היא תופעת לוואי תכופים של כימותרפיה ו/או הקרנות, עבור חלק מהחולים, הקפאה קריוגנית של oocytes או עוברי הוא לא אופציה. כחלופה, מספר גדל והולך של חולים אלו בוחרים cryopreserve רקמות השחלה עבור בשתל בעקבות התאוששות, הפוגה. למרות שיפורים בתוצאות בקרב חולים שעברו אוטומטי-השתלת רקמת השחלה cryopreserved, revascularization יעיל של רקמות המושתל נשאר ולקידמה. כדי להמתיק איסכמיה ובכך לשפר את התוצאות בחולים העוברים השתלת אוטומטי, פיתחנו כלי הדם מבוססת תא אסטרטגיה האצת זלוף רקמת השחלה. נתאר שיטת שיתוף השתלת תאי אנדותל אקסוגני (המנהלים) עם cryopreserved רקמות השחלה במודל xenograft של עכברים. אנחנו מרחיבים גישה זו להעסיק. את המנהלים כי יש מהונדס לבטא צורונים הורמון אנטי-mullerian מעורבת (AMH), ובכך מאפשר paracrine מתמשכת איתות של הקלט שתלי השחלות. השתלת שיתוף עם המנהלים גדל נפח הזקיקים ופיתוח זקיק antral משופר, המנהלים לבטא AMH קידום השמירה של זקיקי הקדמוני השבתה הדרגתית. אסטרטגיה משולבת זו עשויה להיות כלי שימושי מקלים איסכמיה להתכוונן הפעלה הזקיקים בהקשר של שימור פוריות ו/או עקרות בכללותו.

Introduction

הסרטן נשאר בין הגורמים המובילים. למוות בעולם המפותח, עדיין עשורים של מחקר הניבו התקדמות משמעותית במרבית הסוגים של סרטן, ובעוד כמה שיעורי הישרדות כמעט כפולים מקרים1. למרבה הצער, סוכנים כימותרפיות הם לעתים קרובות gonadotoxic, depleting השמורה של זקיקים הקדמוני של השחלות והפחתת פוריות2. זו אוכלוסיה גדלה יכולים להפיק תועלת שיטות שונות של שימור פוריות כולל הקפאה קריוגנית oocyte ו/או העובר, עם זאת, חולים הנזקקים בקש חניכה של טיפול בסרטן ומטופלים מראש המתבגר הם מושעים. אפשרויות אלה. לחלופין, בחרו חלק מהחולים cryopreserve רקמות השחלה לפני התחייבות משטר טיפולי שלהם, וגם על שחזור, רמיסיה, אוטומטי משתילים רקמה לשחזור פוריות3. ובכל זאת, עד כה, הישרדות השתל פלט הזקיקים בעקבות אוטומטי-השתלת עדיין נמוך יחסית4, בעיקר בשל רקמת איסכמיה, היפוקסיה5,6,7. למרות המאמצים הרבים כדי לשפר את הכדאיות של שתלי קורטיקלית השחלות באמצעות8,נוגדי חמצון9, pro-אנגיוגנזה ציטוקינים10,11,12,1 איסכמיה שתל 3או מניפולציות מכני14, ב- 5 עד 7 יום חלון שלאחר ההשתלה מערער את יכולת הקיום וההישרדות של שתל7. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על התא כדי להקל על השקה של המארח וספינות השתל ובכך לזרז פגיעה reperfusion רקמת השחלה.

בנוסף העלבון איסכמי המושתל רקמת השחלה בחלון שלאחר ההשתלה, שיבוש איתות בין הזקיקים עשוי לתרום דלדול של מאגר ה-15,16. כי תאי אנדותל אקסוגני (המנהלים) לתרום כלי יציב ופועל בפריפריה של השתל, הם מציגים הזדמנות ייחודית להעביר קלט מולקולרית מוגדר לרקמות המושתלים. מהווה הוכחה של עיקרון, המנהלים היו מתוכנן אקספרס סופר-פיזיולוגיים רמות של הורמון אנטי-mullerian מעורבת (AMH), חבר הפיכת superfamily בטא (TGFβ) גורם גידול זה הוכח להגבלת פוליקולרי17. השוואה של הזקיקים הזרעון השתלים מושתלים במשותף עם שליטה והתאים לבטא AMH מאמת את פעילות ביולוגית ואת העוצמה של המנהלים מהונדסים.

לסיכום, על ידי שיפור שתל הכדאיות ודיכוי גיוס מוקדמת של מאגר הזקיקים, גישה זו יכול להגדיל את הפרודוקטיביות של מושתלים אוטומטי רקמת השחלה בחולים שעברו שימור פוריות. יתר על כן, הפלטפורמה מבוססת ExEC מאפשרת חקירה ניסויית של ווסתי מולקולרית כי היו מעורבים בהתפתחות הזקיקים.

Protocol

בכל ההליכים הכרוכים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) במכללה לרפואה וייל קורנל. כל הניסויים השתלת איברים מבעלי חיים באמצעות רקמות השחלה בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות. . מרקמות השחלה נאסף מחולים מתוכננת כימותרפיה או הקרנות לטיפול בסרטן או השתלת מח עצם מוקדמת. ועדת הבדיקה מוסדיים (IRB) ועדה של וייל קורנל גוויות אישרה את האוסף של רקמות לשימוש עצמיים פוטנציאל ובעת מדעת של החולה שתרומה של עד 10% רקמת השחלה שלהם לשימוש המחקר בוצע.

1. אוסף של השחלות רקמה אנושית

הערה: כאשר רקמות השחלה מועבר מן מעבר מתקן מרחוק, הזמן לא יעלה על 5 שעות18,19.

  1. לאסוף את רקמת השחלה ולשטוף עם פתרון סטרילי מלוחים.
  2. מקם את השחלה במיכל סטרילי.
  3. יוצקים L-15 בינוני של ליבוביץ עד השחלה הוא שקוע לגמרי המדיום.
  4. סגור, לסגור את המיכל.
  5. תחבורה המכולה על קרח.

2. עיבוד רקמת השחלה Procured, מ. שמידט et al. 18

  1. ההכנות לקראת הקפאה ועיבוד השחלות
    1. להתכונן 100 מ של מדיום עיבוד: L-15 בינונית 99 מ ל + 1 מ"ל פתרון של ליבוביץ אנטיביוטיקה-antimycotic. לסנן מדיה באמצעות 0.2 µm סינון. שמור את המדיום בקירור.
    2. הכן 100 מ של פתרון הקפאת שימוש דימתיל סולפוקסיד הקפאה-חדש. להוסיף של 69.64 mL ליבוביץ L-15 בינוני, 17.66 mL עוברי שור סרום (FBS), 3.42 גר' סוכרוז (כדי ליצור ריכוז סופי של 0.1 מול/ליטר), 10.65 mL דימתיל סולפוקסיד (כדי ליצור ריכוז סופי של 1.5 מול/ליטר), הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic 1 מ"ל. לסנן את המדיום באמצעות יחידת מסנן 150 מ"ל, 0.2 µm. חנות המדיום ב 4 º C.
    3. סטריליזציה של כלי ניתוח באמצעות החיטוי מתוכנת מחזור עיקור עטופה מוצקים.
  2. עם ההגעה של הרקמה
    1. להגדיר את כלי כירורגי סטרילי ארון אבטחה: מספריים סכין עם להב מספר 21, חד בסדר מעוקל ומלקחיים -מגוון גדלים: ארוך (כ- 150 מ מ אורך) ו- 2 בגודל בינוני (כ-110 מ מ אורך).
    2. ללבוש כפפות סטריליות, לפתוח למכולה בתוך ארון אבטחה. לקחת את השחלה, מניחים אותה 150 מ מ פטרי ויוצקים מדיום קר מוכן בשלב 2.1.1 על גבי השחלה כדי למנוע התייבשות של רקמת השחלה.
    3. לבודד את השחלה מרקמות כל שיורית ולשטוף אותו קר בינונית עד שזה חסר ברקמות ובדם.
    4. למקם את השחלה מ מ 150 נקי פטרי, להוסיף קור בינונית, מוכן בשלב 2.1.1 עד השחלה הוא חצי שקוע בה.
  3. דיסקציה של רקמת השחלה
    1. קטיעות השחלה ולהסיר לשד לראשונה על ידי חיתוך חדות, באמצעות מספריים בסדר מעוקל. ואז לגרד לשד, באמצעות אזמל סטרילי עם מספר להב 21. להקדים עד הרקמה קורטיקלית 1-1.5 מ מ עובי.
    2. חותכים את הרקמה קורטיקלית ניצוצות של 2-3 מ מ רוחב, אורך רצועת יהיה לכל אורכה של חתיכה השחלות, עובדה.

3. השחלה רקמות איטי הקפאה, Adapted של ניוטון ואח. ו. Oktay et al. 6 , 20

  1. לקראת הקפאה
    1. תווית cryovials (1.8 מ ל).
    2. להוסיף 1.5 מ של הפתרון מקפיא המבושלות צעד 2.1.2 כל מבחנה.
    3. העברת רצועה קורטיקלית אחת לכל קריוגני בקבוקון המכיל את הפתרון מקפיא.
    4. Equilibrate רצועת קורטיקלית במשך 20 דקות על צלחת מסתובבת, להחיל עצבנות עדין ב 4 º C.
  2. לאט הקפאת רקמת השחלה
    1. לטעון את cryovials לתוך מקפיא פלנר לתכנות החל מ- 0 מעלות צלזיוס.
    2. מגניב ב- 2 ° C/דקה ל-7 מעלות צלזיוס.
    3. לשמור על הרקמות בטמפרטורה קבועה זו במשך 10 דקות.
    4. לבצע זריעה ידנית עבור אינדוקציה התגרענות של גביש קרח, על-ידי נגיעה כל cryovial עם טיפ כותנה שקוע חנקן נוזלי (LN2).
    5. המשך להתקרר ב- 0.3 מעלות צלזיוס/דקה עד טמפרטורה מדגם מגיע ל-40 מעלות צלזיוס.
    6. מגניב בקצב מהיר יותר של 10 ° C/min ל-140 מעלות צלזיוס.
    7. להעביר cryovials דיואר עבור אחסון ב- LN2 (-196 מעלות צלזיוס).

4. ההכנות הניתוחים (Oophorectomy דו-צדדיים והשתלות משותף)

  1. הכנת לוחות
    1. יום לפני מפשיר את רקמת השחלה עבור השתלת
      1. מניחים חתיכת סרט פרפין פלסטיק בתחתית של 50 מ מ פטרי, תשפריץ עם 70% אתנול עד זה יכוסו לחלוטין.
      2. השאירו את צלחות פטרי בן לילה אבטחה בארון. להכין 2 צלחות פטרי לכל העכבר.
    2. ביום של ניתוחים
      1. האחות האתנול מ הפטרי המכיל הסרט פלסטיק פרפין בתוך ארון אבטחה.
      2. להשאיר את ההובלה פטרי חצי פתוחות עד אתנול מתאדה לחלוטין.
      3. סגור את מכסה הפטרי כאשר הסרט פלסטיק פרפין הוא יבש לחלוטין. להשאיר את זה בגדר אבטחה הקבינט.
      4. ובכן, בארות תווית של 6 צלחת בהתאם, 0.1 מול/ליטר סוכרוז + 1 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, 0.1 מול/ליטר סוכרוז + 0.5 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, 0.1 מול/ליטר סוכרוז, בסיסי מפשיר פתרון (BTS), בינוני.
  2. אופן ההכנה של פתרונות
    1. להכין 100 מ של מוזיקה עממית מודרנית: L-15 של ליבוביץ mL 79 בינוני + FBS 20 מ"ל + אנטיביוטיקה-Antimycotic פתרון 1 מ"ל. לסנן עם מערכת סינון 0.22 מיקרומטר.
    2. הכינו 10 מ"ל של מוזיקה עממית מודרנית עם 0.1 מול/ליטר סוכרוז. קנה מידה 0.342 גר' סוכרוז ולהוסיף 10 מ"ל של BTS מוכן בשלב 4.2.1, מתפרעים בעדינות עד התפרקה לחלוטין סוכרוז. לסנן את הפתרון באמצעות מיקרומטר מסנן 0.22 של המזרק.
    3. הכינו את הפתרונות לפי טבלה 1. מכסים צינורות המכיל דימתיל סולפוקסיד ברדיד אלומיניום. לשמור בקירור עד השימוש.

5. מפשיר מהירה רקמות השחלה

  1. להוציא LN2 דיואר בקבוקון המכיל קפוא רקמות השחלה ולשמור אותה בטמפרטורת החדר במשך 30 s.
  2. . תנקה את המבחנה בעזרת נייר טישו.
  3. לטבול את המבחנה באמבט מים של 30 מעלות צלזיוס למשך 1-2 דקות עד שלה ' מופשר הוא תוכן.
  4. לפתוח את הצנצנת ולמקם את רצועת קורטיקלית הבאר הראשונה המכילה 3 מ"ל של הפתרון הראשון (0.1 מול/ליטר סוכרוז + 1 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, מוכן בשלב 4.2.3).
    הערה: כל השלבים הכרוכים בפתיחת המכסה של הצלחת ייעשה תחת זרימה שכבתית.
  5. דגירה את הצלחת היטב 6 על צלחת מסתובבת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לשמור הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בשלב זה.
  6. להעביר את הרצועה בקליפת המוח השני טוב המכיל 3 מ של הפתרון השני (0.1 מול/ליטר סוכרוז + 0.5 מול/ליטר דימתיל סולפוקסיד, מוכן בשלב 4.2.3).
  7. דגירה את הצלחת היטב 6 על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לשמור הצלחת מכוסה ברדיד אלומיניום בשלב זה.
  8. להעביר את הרצועה בקליפת המוח לתוך הבאר השלישית, המכיל 4 מ"ל של פתרון (BTS עם 0.1 מול/ליטר סוכרוז, מוכן בשלב 4.2.2).
  9. דגירה על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. להעביר את רצועת בקליפת המוח הרביעי טוב המכיל 4 מ של פתרון (BTS, מוכן בשלב 4.2.1).
  11. דגירה על צלחת מסתובבת על עצבנות עדין ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  12. להעביר רצועת קורטיקלית mL 4 טוב המכיל האחרון של מדיום קר (להכין בשלב 2.1.1). לשמור המופשרים רקמות השחלה על הקרח עד ביצוע של השתלת.

6. כימוס של רקמת השחלה

  1. להכין את הפתרונות הבאים
    1. להכין 25 מ של מאגר HEPES mmol/L 20 ב- saline 0.9%. לסנן ולאחסן ב 4 º C.
    2. להכין 1 מ"ל של CaCl2 -ריכוז 1 mol/ל' מסנן ולאחסן ב 4 º C.
  2. להכין פתרון מניות של 50 מ"ג/מ"ל פיברינוגן
    1. להוסיף 1 g של פיברינוגן לתוך 20 מ של מאגר HEPES mmol/L 20 ב- saline 0.9% על ידי ערבוב לאט פיברינוגן לתוך HEPES באגירה תמיסת מלח על פני מספר שעות ב 37 º C.
    2. תווית 1.7 mL צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
    3. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 ואז דרך פילטר מזרק 0.2 µm.
    4. Aliquot הפתרון לתוך µL 200 מיקרו-צנטריפוגה שפופרת ואת החנות ב-20 ° C.
  3. להכין פתרון מניות 100 תרומבין U/mL
    הערה: פתרונות תרומבין לספוח לזכוכית, aliquot את הפתרון ב צינורות פלסטיק/בקבוקונים.
    1. להוסיף 2.5 מ ל תמיסת סטרילית 0.9% 250 U של תרומבין.
    2. טלטול עדין עד לפתרון נמסים לחלוטין.
    3. תווית 1.7 mL צינורות מיקרו-צנטריפוגה.
    4. לסנן דרך מסנן מזרק 0.2 µm, aliquot 50 µL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה, חנות ב-80 מעלות צלזיוס.
  4. להפוך את קריש פיברין של 70 µL, להשגת ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל פיברינוגן ו 5 תרומבין U/mL
    הערה: הקפד לעבוד מהר, הפתרון קרישי תוך מספר שניות. כמו כן, הימנע התוספת של בועות לתערובת.
    1. להכין פתרון פיברינוגן בשפופרת מיקרו-צנטריפוגה 1.7 מ.
      1. להוסיף 360 µL של 20 mmol/L HEPES מאגר ב- 0.9% תמיסת מלח כדי µL 200 aliquoted המניה פיברינוגן, מוכן בשלב 6.2.4.
      2. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      3. . לשמור את זה על קרח.
    2. להכין פתרון תרומבין בצינור השני מיקרו-צנטריפוגה.
      1. הוספת µL 148.7 של DMEM µL 50 aliquoted של המניה תרומבין, מוכן בשלב 6.3.4.
      2. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      3. הוסף µL 1.3 של 1 מול/ליטר CaCl2.
      4. מערבבים על-ידי pipetting עדין.
      5. . לשמור את זה על קרח.
    3. להכין השעיה תא בודד, בצינור השלישי מיקרו-צנטריפוגה.
      1. ניתוק תאי אנדותל מהונדסים מהצלחת באמצעות בינוני ניתוק התא של אנזים.
      2. ספין למטה ולספור את התאים באמצעות hemocytometer עם כיסוי זכוכית.
      3. להשתמש בתאים 20,000 עבור כל 1 מ2 של רקמת השחלה. חישוב שטח 20,000 x של רקמות השחלה מ מ2.
      4. ספין למטה תאי אנדותל מהונדסים, מחדש להשעות אותו במדיום בסיסי (DMEM) כדי להגיע הנפח הכולל של 16.8 µL.
      5. . לשמור את זה על קרח.
    4. מניחים חתיכת רקמת השחלה על ספוג גזה סטרילית לייבש את זה במשך כמה שניות.
    5. מניחים פיסת הרקמה השחלות על גבי הסרט פלסטיק פרפין בתוך 50 מ מ פטרי.
    6. הוסף µL 39.2 של הפתרון פיברינוגן, מוכן בשלב 6.4.1.2, לתוך התליה תא מוכן בשלב 6.4.3.4, מיקס על ידי עדין pipetting. . לשמור את זה על קרח.
    7. הוסף µL 14 של הפתרון תרומבין מוכן בשלב 6.4.2.4. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting פעם. עובד מהר
    8. מניחים את התערובת על גבי רקמת השחלה, pipet אותו בדמות droplet מוארך.
    9. מניחים על צלחת פטרי עם קריש הדם בחממה ב 37 º C.

7. דו צדדיים Oophorectomy והשתלות שיתוף של רקמה אנושית השחלות עם תאי אנדותל מהונדסים NSG לעכברים

הערה: 10 עד 14 בת נקבה NSG עכברים21 שימשו (מעבדות ג'קסון).

  1. הכנת כלי כל ניתוח, כמו הארוטיות בשלב 2.1.3, ודא כי ברשותך כל בתפרים, רפידות, וגם קלטות כירורגי בהישג יד.
  2. עזים ומתנגד העכבר באמצעות מערכת הרדמה עם איזופלוריין.
    1. הנח את העכבר בבית הבליעה אינדוקציה, לסגור את המכסה ולפתוח את צימוד המתאים.
    2. זרימה פתוחה כדי 1000 מ ל לדקה להפעיל את מכשיר אידוי ולהגדיר אותו למסור 2-3.5%.
    3. לבחון את השפעת הרדמה; אובדן ההכרה, איטי, נשימות רגילות.
    4. להעביר חרוט האף כדי לשמור על הרדמה. הפעל את מכשיר אידוי כדי לספק 1-3%, בהתאם סימנים חיוניים.
    5. ודא היעדר רפלקס פדלים או זנב. אם רפלקס, להגדיל איזופלוריין עד שהוא נעדר.
  3. קיצוץ שיער גב של העכבר, לכיוון הזנב עד הקו הכסל, באמצעות טרימר שיער חשמלי.
  4. הנח את העכבר במצב של שכיבה על פלטפורמת כירורגי.
  5. לתקן את האף חרוט פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת כירורגי.
  6. להקליט את הגפיים של העכבר בעדינות לפלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת 1.25 ס מ ברוחב נייר כירורגי.
  7. השתמש עם ריבה סיכה סטרילי והכנס מדחום PR. לתקן המדחום על ידי מקליטה אותה פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת כירורגי פלסטיק 1.25 ס מ מחורר.
  8. . טוב, קלטת הזנב פלטפורמת כירורגי באמצעות קלטת נייר רחב כירורגי 2.5 ס מ
  9. חום, באמצעות אינפרא או של מים חמים, חימום pad, ולפקח על טמפרטורת הגוף של העכבר לאורך כל ההליך. לשמור על טמפרטורת גוף בטווח של 35-37 מעלות צלזיוס.
  10. לנקות את האזור המקוצץ עם מקל אוזניים Povidone-יודיפלור תמיסה סטרילית ונגב באמצעות הכנה סטרילית אלכוהול.
  11. חזור על שלב 6.9 עוד פעמיים.
  12. הנח טיפה של משחה סטרילי הוטרינר סיכה עינית מעל כל אחת העיניים של העכבר כדי להגן מפני התייבשות, נזק בקרנית.
  13. מכסים את העכבר באמצעות תלוי כירורגי סטרילי.
  14. להזריק הבופרנורפין (1 מ ג/ק ג) תת עורית (S/C).
  15. לבצע חתך אורכי הגבי המדיאלי באמצעות אזמל (להב #21).
  16. לבצע oophorectomy דו צדדיים, להשתמש בגישה הגבי.
    1. חינם רקמת חיבור תת עורי ע י ניתוח עמום באמצעות המספריים.
    2. לצבוט fascia רוחבית לעשות קו האמצע חתך ולהגיע חלל הצפק באמצעות מספריים חדות.
    3. קחו כרית השומן השחלות ו השחלה בעדינות עם פינצטה, להוציא אותו מתוך חלל הבטן.
    4. לאחוז את השחלה, כרית השומן של מלקחיים לכלי הדם.
    5. מאתרים ומפסיקים את השחלה, כרית השומן באמצעות monofilament 4/0 בתפר שנספג בבסיס של השחלה, דיסטלי אל החצוצרה.
    6. קליפ השחלה דיסטלי השולטת. ודא כי אין דימום מבסיס של הגדם.
    7. מקם את הרקמה בחזרה לתוך חלל הבטן, תפר fascia באמצעות 6/0 בתפר שנספג קלועה.
    8. חזור על שלבים 7.15.1-7.15.7 על הצד contralateral.
  17. השתלות במשותף את רקמת השחלה.
    1. ביצוע חתך אופקי fascia מעל העכוז, ב אורך שמתאים הממדים קרישי דם. יצירת כיס בתוך סביבה וירטואלית זו על-ידי פתיחת את המספריים מתחת fascia.
    2. להרים חתיכה אחת של רקמות קורטיקלית שעברו אנקפסולציה, מוכן בשלב 6.4.8 ולמקם אותו בכיס.
    3. תפר fascia באמצעות 6/0 קלוע תפר שנספג.
  18. חזור על שלבים 7.16.1-7.16.3 בצד contralateral גם כן.
  19. סגור את הקיר הגבי באמצעות תפרים קטע פשוט monofilament 4/0 בתפר שנספג.
  20. להזריק לידוקאין 0.5% (1.2 מ"ל/ק"ג) S/C-החתך.
  21. השתמש הכנה סטרילית אלכוהול כדי לנקות את העור.
  22. לבטל את איזופלוריין תוך ניטור הטמפרטורה של העכבר.
  23. לספק 1-2 דקות של O2, בלי איזופלוריין. לשמור על התחממות העכבר עד שהוא מתחיל לעבור ולחזור להכרה.
  24. למקם את העכבר בתוך כלוב ההתאוששות נקי, מאוחר יותר הבית העכבר בכלוב נפרד עד ריפוי מלא של הפצע כירורגי.
  25. להזריק הבופרנורפין (1 מ"ג/ק"ג) S/C לצורך כל 8-12 שעות, 24 שעות ביממה במשככי.
  26. מחזיקים העכברים בתוך כלובים נפרדים כאשר כל מזון, מים, מצעים, כלובים הם בלוק, עד נקודת הסיום של הניסוי. שמור את הכלובים בחדר מאוורר בלחץ. השתמש ציוד מגן אישי בכל פעם טיפול העכברים.

תוצאות

כדי לקבוע אם השתלת שיתוף של המנהלים מספק לתועלת רקמות המטופלים, המופשרים רצועות קורטיקלית השחלות היו מחולקים לחתיכות בגודל שווה, engrafted דו צדדיים לתוך פגועה, הנהון scid גמא (NSG), עכברים. בצד השני מוטבע clot פיברין לבד (לא ECs), את המנהלים המכיל אחרים (איור 1 א'), כל עכ?...

Discussion

כאן אנחנו מוכיחים את השתלת שיתוף של המנהלים מספק יתרון משמעותי רקמות השחלה הכדאיות ותפקוד בעקבות xenograft בעכברים. תקנים עבור יישומים קליניים של רקמות השחלה אוטומטית-השתלת לשימור פוריות לא היה סט של פרמטרים אופטימליים (גודל, השתלת באתר, משך הזמן של השתל, וכו '.) 32 ,

Disclosures

מיכאל גינסבורג הוא עובד של Angiocrine החיים, inc., סן דייגו, CA, 92130, ארצות הברית, מבודד, transfected עם E4-ORF-1, שכותרתו תאי אנדותל השתמשנו.

Acknowledgements

עומר אדם אלכסנדר על האיורים.
ל. מ נתמכה על ידי פרס טייס מן במישור הקליני של קורנל, מרכז מדעים Translational ו- ASRM של מלגת מחקר.
המחברים רוצה להודות ג'יימס חברי המעבדה לקריאה ביקורתית של כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Leibovitz’s L-15 mediumGibco11415064
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062Anti-Anti X100
SucroseSigmaS 1888
FibrinogenSigmaF 8630from bovine plasma
ThrombinSigmaT 1063from human plasma
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastic paraffin filmBemis NAParafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm3M1530-1Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm3M1530-0Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Absorbable SutureCovidienUM-203Biosyn
Braided Absorbable SutureCovidienGL-889Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine Solution Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
sterile ocular lubricantDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Anasthesia systemVetEquipV-1 table top system with scavenging
Endothelial cellsAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stainSigmaHT15-1ktTrichrome Stain (Masson) Kit
IsolectinInvitrogenI32450isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology?. Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135autoRevascularizationmullerian AMH

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved