استخدام الأبعاد شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد اثنين لتأكيد عدم تجانس حجم الألياف اميلويد أو اميلويد مثل

Summary

هنا نستخدم الأبعاد شبه يشوه [اغروس] هلام التفريد لتأكيد وجود ألياف اميلويد مثل الحجم غير المتجانسة، واستبعاد إمكانية أن يعود إلى التباين في حجم الانفصال الألياف اميلويد خلال الجل العملية قيد التشغيل.

Abstract

ألياف اميلويد أو اميلويد تشبه ارتبطت بالعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان، والآن يجري اكتشافها مهما للعديد من مسارات الإشارات. القدرة على اكتشاف سهولة تكوين هذه الألياف تحت الظروف التجريبية المختلفة أمر ضروري لفهم وظيفتها المحتملة. وقد استخدمت العديد من الأساليب للكشف عن الألياف، ولكن لا يخلو من بعض العيوب. على سبيل المثال، الميكروسكوب الإلكتروني (م)، أو تلطيخ مع أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين غالباً ما يتطلب تنقية الألياف. من ناحية أخرى، يتيح شبه يشوه المنظفات [اغروس] هلام التفريد (SDD-العمر) الكشف عن الألياف اميلويد تشبه المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي في مقتطفات الخلية دون تنقية. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يسمح مقارنة الفرق حجم الألياف. الأهم من ذلك، يمكن استخدامه للتعرف على بروتينات محددة داخل الألياف من النشاف الغربية. وأقل استهلاكاً للوقت وأكثر سهولة لعدد أوسع من مختبرات. غالباً ما تظهر النتائج SDD-العمر متغير درجة من عدم التجانس. فإنه يثير المسألة ما إذا كان جزء من التباين النتائج من التفكك للبروتين معقدة أثناء التفريد حضور الحزب الديمقراطي الصربي. لهذا السبب، نحن قد استخدمت بعد ثاني من SDD-سن لتحديد ما إذا كان تباين حجم ينظر في SDD-العمر حقاً نتيجة للألياف عدم التجانس في فيفو وليس نتيجة لتدهور أو تفكك بعض البروتينات خلال التفريد. يسمح هذا الأسلوب تأكيد سريعة ونوعية الألياف اميلويد أو مثل اميلويد هي لا الناي جزئيا خلال عملية SDD-العمر.

Introduction

منذ فترة طويلة كان معروفا تشكيل ألياف اميلويد بسبب البروتين misfolding لتلعب دوراً في ظروف مرضية مثل مرض الزهايمر ومرض باركنسون، ومرض هنتنغتون¹. في الآونة الأخيرة، قد تبين تشكيل ألياف اميلويد أو اميلويد مثل أن تكون جزء من مسارات الإشارات في البشر، بما في ذلك من خلال الاستجابة المناعية الفطرية المضادة للفيروسات² ونيكروبتوسيس^3،4، وفي انخفاض الكائنات الحية مثل الخميرة^5،6. ولذلك، من المهم القدرة على الكشف عن هذه الألياف في المعمل. حاليا، هناك ثلاثة طرق رئيسية للكشف عن اميلويد وألياف اميلويد مثل: استخدام الأصباغ، وطب الطوارئ و SDD-العمر.

ويتيح استخدام الأصباغ، مثل أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين، تتميز بأنها سريعة ويمكن كشفها بسهولة باستخدام الفحص المجهري أو التحليل الطيفي⁷. ومع ذلك، يوفر الكشف عن طريق الفحص المجهري، وفي حالة الكونغو الحمراء، خصوصية لا التي تشمل بروتينات الألياف، أو حجم الألياف. وبالمثل، يوفر استخدام التحليل الطيفي للكشف عن ربط أحمر الكونغو أو تي ثيوفلافين إلى مجمعات البروتين فقط نتيجة إيجابية أو سلبية.

م توفر أدلة قاطعة على وجود الألياف وكمية من المعلومات حول الألياف طولها وقطرها⁸أيضا. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تنقية صارمة للغاية. بالإضافة إلى ذلك، أم هو أسلوب متخصصة الذي يستخدم معدات باهظة الثمن.

وقد استخدمت SDD-العمر للكشف عن مجمعات البروتين المقاوم للحزب الديمقراطي الصربي دالتون الضخمة بما في ذلك ألياف اميلويد أو مثل اميلويد. ويوفر العديد من المزايا. أولاً، أنها لا تتطلب تنقية الألياف ومن السهل peform⁹. ثانيا، فإنه يوفر معلومات نوعية عن الحجم الألياف، بما في ذلك الحجم النسبي وكمية من الألياف هيتيروجينيسيتي. وأخيراً، لأنه يمكن أن يؤديها النشاف الغربية بعد التفريد، فمن السهل الكشف عن وجود أي البروتين الذي يوجد جسم، على الرغم من أنه تجدر الإشارة إلى أنه نظراً لأن يشوه شبه SDD-العمر، بعض [ابيتوبس] قد تظل أخفى الذي يعقد الكشف بالضد.

في الآونة الأخيرة، أبلغ مستقبلات التفاعل البروتين كيناز 1 (RIPK1) و 3 (RIPK3) على شكل ألياف اميلويد لتكون بمثابة إشارات المنصات خلال نيكروبتوسيس، نموذج مبرمجة من نخر³. أثناء دراسة هذه الألياف، لدينا مختبر أظهرت أن آخر البروتين المرتبطة نيكروبتوسيس، خلط النسب كيناز مثل المجال (ملكل)، وشكلت أيضا ألياف اميلويد مثل⁴. ومع ذلك، عند الفحص مع SDD-العمر، ظهرت حجم الألياف ملكل متميزة من ألياف RIPK1 و RIPK3، التي بدت متطابقة مع بعضها البعض (الشكل 1). وكان هذا غير متوقع لأنه من المعروف جيدا أن يربط ملكل RIPK1/RIPK3 لتشكيل نيكروبتوسيس إشارة معقدة تسمى نيكروسومي¹⁰.

وهناك مالا يقل عن اثنين من التفسيرات. أولاً، قد تشكل ألياف اميلويد تشبه تماما متميزة اثنين أثناء نيكروبتوسيس، واحدة تحتوي على RIPK1/RIPK3 وملكل الأخرى التي تحتوي على. ثانيا، هو نوع واحد فقط من ألياف اميلويد تشبه قد شكلت المحتوية على RIPK1/RIPK3/ملكل أثناء نيكروبتوسيس، ولكن رابطة ملكل مع البروتينات الأخرى ضعف ما يكفي أنه ينأى خلال SDD-العمر.

لمعالجة هذه المشكلة، نقترح إجراء ثنائي الأبعاد (2D) SDD-عمر. وسيكون اميلويد SDD-العمر-مستقرة أو ألياف اميلويد تشبه نفس نمط الهجرة أثناء التفريد البعد الأول والثاني. سيكون هذا الاكتشاف بعد نقل البروتينات إلى غشاء والاضطلاع بوصمة عار غربية. ألياف مستقرة سوف يحمل نقش قطري حادة. أي انحراف عن هذا يوحي بأن الألياف تغيرات بسبب مخزونات النشر الاستراتيجي-التفريد.

Protocol

1-إعداد العينات

1. ثقافة 2 × 10⁶ اميلويد إنتاج خلايا سرطان القولون HT-29 في طبق استنبات الأنسجة 10 سم في 10 مل من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين والبنسلين والستربتوميسين. خلايا الثقافة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
   1. بعد زراعة الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، تغسل الخلايا مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS). أضف 3 مل من محلول التربسين واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   2. بعد الخلايا معزولة تماما من الطبق، أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة ونقل الخلايا ماصة 10 مل أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح المتوسطة وريسوسبيند الخلايا في 5 مل من الثقافة المتوسطة عد الخلايا باستخدام عداد خلايا. لوحة 2 × 10⁶ خلايا في كل من اثنين 10 سم الأطباق.
   3. السماح للخلايا للتقيد واسترداد بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂. تطبيق العلاج على صحن واحد للحث على تشكيل أميلويدس مع 20 نانوغرام/مليلتر ألفا عامل نخر الورم (تنف-α)، 100 نانومتر عموم ميكرومتر الألغام ميميتيك، و 20-caspase المانع Z-نقص فيتامين-مارك فنلندي¹¹. يتم اختصار التركيبة كالمنطقة الأمنية المؤقتة. علاج الطبق الأخرى مع مركبة كعنصر تحكم.
2. وبعد طول الوقت المناسب، الحصاد عادة ح 6، الخلية ليستي.
   1. كشط الخلايا خارج اللوحة مع مكشطة بلاستيكية واستخدم ماصة 10 مل لتحويل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الخلايا في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
   2. تغسل الخلايا 2 مرات ريسوسبيندينج في 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني وسينتريفوجينج في 1,000 س ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح الحل برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا بتجميد بيليه الخلية في النتروجين السائل، وتخزينها في ˗80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   3. نقل الخلية بيليه إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحتضان في 0.3 مل من تحلل المخزن المؤقت لمدة 30 دقيقة على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. المادة طافية هي الخلية كله ليستي.
      ملاحظة: هذه العملية يمكن أن يكون مؤقتاً هنا عن طريق تخزين العينة في-20 درجة مئوية لتصل إلى عدة أشهر.
   4. قياس تركيز البروتين بمقايسة برادفورد وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. إضافة 4 × SDD-العمر تحميل المخزن المؤقت إعداد 20 ميليلتر من 3 ميكروغرام/ميليلتر عينة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

2-إعداد وتشغيل المواد الهلامية

1. إضافة 2 ز [اغروس] إلى 200 مل س 1 تريس-خلات المخزن المؤقت (تاي) في كوب زجاج والحرارة في فرن ميكروويف تذوب في [اغروس]. أضف 1 مل من الحزب الديمقراطي الصربي 20% لتركيز نهائي من الحزب الديمقراطي الصربي 0.1%. دوامة بعناية مزيج. الحرص على عدم توليد فقاعات بعد إضافة صحيفة بيانات السلامة.
2. من أجل الحل [اغروس] إلى لوح جل 15 سم × 14 سم. استخدام ماصة 1 مل لإزالة أي فقاعات. مكان واحد مشط 20-جيدا في الجزء العلوي.
3. البعد الأول: ماصة 60 ميكروغرام كل خلية في حارة اليمين المتطرف. تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح (حتى الصبغ والجبهة هي حوالي ¾ من خلال الجل) استخدام تاي التي تحتوي على مخزونات النشر الاستراتيجي 0.1% كالمخزن المؤقت قيد التشغيل.
4. البعد الثاني: تدوير بعناية للهلام 90° عقارب الساعة (الشكل 2أ). تشغيل الهلام في 60 الخامس لحوالي 4 ح.
   ملاحظة: حالة تشغيل عامة 4 طول جل الخامس/سم. من المهم أن شروط التشغيل هي بالضبط نفس الأبعاد الأولى والثانية.

3-نقل

1. استخدام أسلوب النقل الشعرية لنقل البروتينات إلى غشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن (الشكل 2ب).
   1. إضافة 500 مل من المخزن المؤقت نقل إلى حاوية 20 سم × 20 سم تقريبا. جعل كومة عالية 5 سم من المناشف الورقية بجانب الحاوية. يجب أن تكون المساحة السطحية للجزء العلوي من المكدس أكبر من أبعاد هلام.
   2. نقع ورقة تصفية 14 سم × 15 سم في نقل المخزن المؤقت ثم ضعه أعلى المكدس منشفة ورقة. الحرص على وضع على الورق مع لا التجاعيد أو فقاعات. كرر مع آخر قطعة من ورق الترشيح.
   3. تنشيط غشاء PVDF 14 سم × 15 سم في الميثانول لمدة 30 ثانية ثم طبقة على ورق الترشيح مع الحرص على استخدام اسطوانة إزالة جميع فقاعات. شطف الجل مع نقل المخزن المؤقت وطبقة من أعلى الغشاء، مرة أخرى وطرح أي فقاعات.
   4. تغطي حافة مناشف ورقية الأقرب إلى حاوية لنقل المخزن المؤقت مع غلاف بلاستيكي. من المهم أن الجسر الورقة التي شيدت في الخطوة التالية لا تتلامس مباشرة مع مكدس منشفة ورقة.
   5. نقع قطعة من ورق الترشيح 15 سم × 35 سم في نقل المخزن المؤقت ووضعه حتى نهاية واحد يغطي الجزء العلوي من الجل والطرف الآخر في حاوية نقل المخزن المؤقت. كرر مع جسر آخر.
   6. تغطية الحاوية مع غلاف بلاستيكي وتترك ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة.

4-الغربية النشاف الكشف

1. شطف الغشاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني تحتوي على 0.05% 20 توين (ببست) في حاوية 20 سم × 20 سم. إضافة 20 مل حليب 5% في ببست. صخرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة كتلة.
2. "الماصة؛" 10 ميليلتر من جسم الأرنب ملكل المضادة إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
3. يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
4. "الماصة؛" 4 ميليلتر لمكافحة rabbit HRP إلى 20 مل حليب 5% في ببست، وإضافة إلى الحاوية. تبني على الروك في درجة حرارة الغرفة ح 2.
5. يغسل الغشاء في 20 مل ببست 5 دقيقة كرر 5 مرات.
6. إضافة تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة (القامة) وعرض لأفلام الأشعة السينية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

النتائج

بعد التعريفي نيكروبتوسيس، و RIPK1 و RIPK3 وأظهرت أنماط مثل اميلويد مماثلة تقريبا (الممرات 2 و 4، الشكل 1). ومع ذلك، ألياف ملكل متغايرة أكثر ويبدو أصغر من ألياف RIPK1/RIPK3 (لين 6، الشكل 1). الذي حدا بنا إلى وضع أسلوب SDD-العمر 2D لمعالجة احتمال ملكل يشكل ألي?...

Discussion

الجانب الأكثر أهمية في 2D SDD-السن أن شروط التفريد هي نفسها بالنسبة للبعد الأول والثاني. اليكتروفوريسيس القدرة على الكشف عن خط قطري حادة في 45° (التي تشير إلى أن حدوث لا تفكك أو تدهور) يعتمد على الألياف يهاجرون بطريقة مماثلة أثناء على حد سواء. استخدام شروط مختلفة، على سبيل المثال تغيير الجهد أو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L