Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Resumen

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Resumen

Fibras amiloides o amiloide-como han sido asociadas con muchas enfermedades humanas y ahora se están descubriendo importantes para muchas vías de señalización. La capacidad de detectar fácilmente la formación de estas fibras en diferentes condiciones experimentales es esencial para la comprensión de su función potencial. Muchos métodos se han utilizado para detectar las fibras, pero no sin algunos inconvenientes. Por ejemplo, microscopía electrónica (EM), o tinción con rojo Congo o Thioflavin T a menudo requiere purificación de las fibras. Por otra parte, la electroforesis en gel de agarosa detergente la desnaturalización (SDD-edad) permite la detección de las fibras de amiloide-como SDS-resistente en los extractos de célula sin purificación. Además, permite la comparación de la diferencia de tamaño de las fibras. Más importante aún, puede utilizarse para identificar proteínas específicas dentro de las fibras por borrar occidental. Es mucho menos tiempo y más fácilmente accesible a un mayor número de laboratorios. SDD-edad resultados a menudo muestran grados variables de heterogeneidad. Plantea la pregunta de si parte de la heterogeneidad resulta de la disociación de la proteína del compleja durante la electroforesis en presencia de SDS. Por esta razón, hemos empleado una segunda dimensión de SDD-edad para determinar si la heterogeneidad de tamaño vista en SDD-edad es realmente consecuencia de la heterogeneidad de fibra en vivo y no un resultado de la degradación o la disociación de algunas de las proteínas durante el electroforesis. Este método permite la confirmación rápida y cualitativa que las fibras de amiloide o amiloide-como no están disociando parcialmente durante el proceso de SDD-edad.

Introducción

La formación de fibras amiloides debido a mal plegamiento de proteínas ha sido conocida para jugar un papel en condiciones patológicas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington¹. Más recientemente, la formación de fibras amiloides o amiloide-como se ha demostrado que una parte de vías de señalización en los seres humanos, incluyendo durante la respuesta inmune innata antiviral² y necroptosis^3,4y en organismos inferiores como levadura^5,6. Por lo tanto, la capacidad para detectar estas fibras en el laboratorio es importante. Actualmente, hay tres maneras principales para detectar amiloide y las fibras de amiloide-como: el uso de tintes, EM y SDD-edad.

El uso de tintes, como el rojo Congo o tioflavina T, ofrece la ventaja de ser rápida y fácilmente detectable mediante microscopía o espectroscopia⁷. Sin embargo, la detección por microscopía, en el caso de Congo rojo, proporciona ninguna especificidad acerca de que las proteínas constituyen las fibras, o el tamaño de las fibras. Del mismo modo, el uso de la espectroscopia para detectar rojo Congo o Thioflavin T Unión a complejos de proteínas proporciona sólo un resultado positivo o negativo.

EM proporciona pruebas concluyentes de la presencia de fibras y también información cuantitativa acerca de la fibra longitud y diámetro⁸. Sin embargo, este método requiere purificación muy estricta. Además, la EM es una técnica especializada que utiliza el equipo costoso.

SDD-edad se ha utilizado para detectar resistente SDS mega Dalton complejos incluyendo las fibras de amiloide o amiloide-como. Ofrece muchas ventajas. En primer lugar, no requiere la purificación de las fibras y es fácil de realizar⁹. En segundo lugar, proporciona información cualitativa sobre el tamaño de las fibras, como el tamaño relativo y la cantidad de heterogenicidad de la fibra. Por último, porque el borrar occidental puede realizarse después de la electroforesis, es fácil de detectar la presencia de cualquier proteína que se encuentra un anticuerpo, aunque cabe señalar que debido a SDD-edad es semi-desnaturalización, algunos epitopos pueden permanecer oculto que complica la detección de anticuerpos.

Recientemente, receptor interacción proteína quinasa 1 (RIPK1) y 3 (RIPK3) se han divulgado para formar fibras amiloides para servir como plataformas de señalización durante la necroptosis, forma programada de necrosis³. Mientras que de estudiar estas fibras, nuestro laboratorio demostró que otra proteína asociada a la necroptosis, mezclado quinasa de linaje como dominio (MLKL), también forma las fibras de amiloide-como⁴. Sin embargo, en el examen con SDD-edad, el tamaño de las fibras MLKL apareció distinto de las fibras RIPK1 y RIPK3, que parecían idénticas entre sí (figura 1). Esto fue inesperado porque es bien sabido que MLKL se une a RIPK1/RIPK3 para formar la necroptosis señalización complejo llamado el necrosome¹⁰.

Hay al menos dos explicaciones. En primer lugar, dos fibras de amiloide-como totalmente distintas pueden formar durante la necroptosis, RIPK1/RIPK3 con uno y el otro MLKL que contiene. En segundo lugar, sólo un tipo de amiloide-como las fibras que contienen RIPK1/RIPK3/MLKL pueden formarse durante la necroptosis, pero la Asociación de MLKL con otras proteínas es débil lo suficiente que disocia en SDD-edad.

Para hacer frente a esto, proponemos realizar una edad SDD bidimensional (2D). SDD-edad-stable amiloide o fibras de amiloide-como tienen el mismo patrón de migración durante la electroforesis de la primera y la segunda dimensión. Esta será detectable después de la transferencia de las proteínas a una membrana y realizar un Western blot. Fibras estables exhiben un patrón diagonal fuerte. Cualquier desviación de esto sugeriría que las fibras se someten a cambios debido a la electroforesis de SDS.

Protocolo

1. preparar las muestras

1. Amiloide de cultura 2 x 10⁶ produciendo las células de cáncer de colon HT-29 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con suero bovino fetal 10% y penicilina-estreptomicina. Las células de cultivos durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂.
   1. Después de que las células crecen al 80% de confluencia, lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 mL de solución de tripsina e incubar a 37 ° C durante 3 minutos.
   2. Después de que las células están totalmente disociadas de la fuente, añadir 10 mL de medio de cultivo y transferencia de las células con una pipeta de 10 mL a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Aspire el medio, resuspender las células en 5 mL de medio de cultivo y contar las células usando un contador de células. Placa de 2 x 10⁶ células en cada uno de los dos platos de 10 cm.
   3. Permitir que las células se adhieren y recuperar durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂. Aplicar un tratamiento a un plato para inducir la formación de amiloides con 20 ng/mL de Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α), 100 inhibidor nM Smac mimética y 20 μm pan-caspasas Z-VAD-FMK¹¹. La combinación se abrevia como zona temporal de seguridad. Tratar el otro plato con el vehículo como un control.
2. Después de la longitud adecuada de tiempo, generalmente 6 h, cosecha el lysate de la célula.
   1. Raspar las células de la placa con una rasqueta de plástico y usar una pipeta de 10 mL para transferir a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
   2. Lavar las células 2 veces a resuspender en 10 mL de PBS frío hielo y centrifugación a 1.000 x g durante 3 min a 4 ° C. Aspirar la solución de PBS.
      Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí congelando el precipitado de células en nitrógeno líquido y guardar a ˗80 ° C durante 1 mes.
   3. Transfiera el sedimento de células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar en 0,3 mL de tampón de lisis por 30 min en hielo. Centrifugar a 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante es el lisado de células enteras.
      Nota: El proceso puede hacer una pausa aquí mediante el almacenamiento de la muestra a-20 ° C por hasta varios meses.
   4. Medir la concentración de proteína por un ensayo de Bradford según protocolo del fabricante. Añadir 4 x buffer de carga de SDD-edad preparar 20 μl de muestra de 3 μg/μl e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

2. preparar y ejecutar geles

1. Añadir 2 g de agarosa a 200 mL de tampón de Tris acetato 1 x (TAE) en un vaso de vidrio y calor en el microondas para fundir la agarosa. Añadir 1 mL de SDS 20% para una concentración final de 0.1% SDS. Agitar cuidadosamente para mezclar. Tenga cuidado de no para generar burbujas después de la adición de SDS.
2. Verter la solución de agarosa en una placa de gel de 15 cm x 14 cm. Utilice una pipeta de 1 mL para eliminar cualquier burbuja. Coloque un peine de 20 pozos en la parte superior.
3. Primera dimensión: pipeta 60 μg de células enteras lisado en el carril de extrema derecha. Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas (hasta que el frente del tinte es de ¾ a través del gel) con la TAE que contiene 0.1% SDS como el búfer de ejecución.
4. Segunda dimensión: gire con cuidado el gel 90° en sentido antihorario (figura 2A). Correr el gel a 60 V por cerca de 4 horas.
   Nota: La condición general de la corriente es 4 V/cm longitud de gel. Es importante que las condiciones son exactamente iguales a las dimensiones primeras y segunda.

3. transferencia

1. Utilice el método de transferencia capilar para transferir las proteínas a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno (figura 2B).
   1. Añadir 500 mL de tampón de transferencia a un contenedor de 20 cm x 20 cm aproximadamente. Hacer una pila alta de 5 cm de toallas de papel al lado del contenedor. La superficie de la parte superior de la pila debe ser mayor que las dimensiones del gel.
   2. Empapar un papel de filtro de 14 cm x 15 cm en tampón de transferencia y coloque encima de la pila de toallas de papel. Tenga cuidado de colocar en el papel sin arrugas o burbujas. Repita con el otro trozo de papel de filtro.
   3. Activar una membrana PVDF de 14 cm x 15 cm en metanol por 30 s entonces la capa en el papel filtro, teniendo cuidado de utilizar un rodillo para quitar todas las burbujas. Enjuagar el gel con el tampón de transferencia y capa encima de la membrana, otra vez el despliegue de las burbujas.
   4. Cubrir el borde de las toallas de papel más cercanos al recipiente que contiene el tampón de transferencia con envoltura de plástico. Es importante que el puente de papel, construido en el paso siguiente no entra en contacto directo con la pila de toallas de papel.
   5. Remoje un pedazo de papel de filtro de 15 cm x 35 cm en tampón de transferencia y coloque un extremo cubre la parte superior del gel y el otro está en el recipiente que contiene el tampón de transferencia. Repita con el otro puente.
   6. Cubrir el recipiente con papel plástico y dejar durante la noche a temperatura ambiente.

4. Western Blot detección

1. Lavar la membrana con 50 mL de PBS que contenga 0.05% Tween-20 (SAFT) en un recipiente de 20 cm x 20 cm. Añadir 20 mL de leche de 5% en SAFT. Roca a temperatura ambiente durante 30 min para bloquear.
2. Pipetear 10 μl de anticuerpo de conejo anti-MLKL en 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín de la noche a 4 ° C.
3. Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.
4. Pipetear 4 μL de HRP anti-conejo a 20 mL de leche de 5% en SAFT y agregar al contenedor. Incubar en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 2 h.
5. Lavar la membrana en 20 mL de SAFT para 5 minutos repita 5 veces.
6. Añadir substrato quimioluminescencia realzada (ECL) y exponga a las películas de radiografía según protocolo del fabricante.

Resultados

Después de la inducción de la necroptosis, RIPK1 y RIPK3 mostraron patrones de amiloide-como casi idénticos (carriles 2 y 4, figura 1). Sin embargo, las fibras MLKL fueron más heterogéneas y parecen ser más pequeño que las fibras RIPK1/RIPK3 (carril 6, figura 1). Nos impulsó a desarrollar el método SDD-edad 2D para hacer frente a la posibilidad o MLKL forma fibras RIPK1/RIPK3-independiente MLKL simplemente se disocia de ...

Discusión

El aspecto más crítico de la SDD-edad 2D es que las condiciones de electroforesis son las mismas para la primera y la segunda dimensión. La capacidad para detectar una fuerte línea diagonal a 45° (lo que indica que no se ha producido ninguna disociación o degradación) depende de las fibras de migrar de manera idéntica durante electroforesis. Usando diferentes condiciones, por ejemplo cambiando la tensión o la longitud de tiempo de ejecución, se oscurecen estos resultados. También, como es el caso de tradiciona...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L