Uso di elettroforesi del Gel di agarosio detergente semi-denaturante dimensionale due per confermare dimensioni eterogeneità delle fibre amiloidi o amiloide-come

Riepilogo

Qui usiamo l'elettroforesi del gel dell'agarosi semi-denaturante bidimensionale per confermare la presenza di amiloide-come le fibre di dimensioni eterogenee ed escludere la possibilità che l'eterogeneità di dimensioni è dovuto dissociazione delle fibre amiloidi durante il gel processo in esecuzione.

Abstract

Fibre amiloidi o amiloide-come sono stati associati con molte malattie umane e ora stanno scoprende sarà importante per molte vie di segnalazione. La capacità di rilevare prontamente la formazione di queste fibre nelle varie circostanze sperimentali è essenziale per capire la loro funzione potenziale. Molti metodi sono stati utilizzati per rilevare le fibre, ma non senza alcuni inconvenienti. Ad esempio, la microscopia elettronica (EM), o colorazione con rosso Congo o Thioflavin T spesso richiede purificazione delle fibre. D'altra parte, elettroforesi su gel di agarosio detergente semi-denaturante (SDD-età) permette la rilevazione delle fibre amiloide-come SDS-resistente in estratti delle cellule senza purificazione. Inoltre, permette il confronto tra la differenza di dimensioni delle fibre. Ancora più importante, può essere utilizzato per identificare le proteine specifiche nelle fibre mediante Western blotting. È molto meno tempo e più facilmente accessibile a un più ampio numero di laboratori. SDD-età risultati mostrano spesso variabile grado di eterogeneità. Solleva la questione se parte dell'eterogeneità deriva dalla dissociazione della proteina complessa durante l'elettroforesi in presenza di SDS. Per questo motivo, abbiamo impiegato una seconda dimensione di SDD-età per determinare se l'eterogeneità di dimensioni visto in SDD-età è davvero un risultato di fibra eterogeneità in vivo e non il risultato di degradazione o di dissociazione di alcune delle proteine elettroforesi. Questo metodo permette la veloce, qualitativa conferma che le fibre amiloidi o amiloide-come non sono parzialmente dissociando durante il processo di SDD-età.

Introduzione

La formazione di fibre amiloidi a causa di misfolding proteico a lungo è stata conosciuta per svolgere un ruolo in condizioni patologiche come il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson e la malattia di Huntington¹. Più recentemente, la formazione di fibre amiloidi o amiloide-come è stata indicata per essere una parte delle vie di segnalazione in esseri umani, compreso durante la risposta immunitaria innata anti-virale² e necroptosis^3,4e negli organismi inferiori come lievito^5,6. Pertanto, la capacità di rilevare queste fibre in laboratorio è importante. Attualmente, ci sono tre modi principali per rilevare amiloide e amiloide-come le fibre: l'uso di coloranti, EM e SDD-età.

L'uso di coloranti, come il rosso Congo o Tioflavina T, offre il vantaggio di essere veloce e facilmente rilevabile mediante microscopia o spettroscopia⁷. Tuttavia, il rilevamento da microscopia, nel caso di colore rosso di Congo, non fornisce nessuna specificità sulle proteine comprendono le fibre, o la dimensione delle fibre. Analogamente, l'uso della spettroscopia per rilevare associazione rosso Congo o Thioflavin T complessi proteici fornisce solo un risultato positivo o negativo.

EM fornisce prove inconfutabili della presenza di fibre e anche informazioni quantitative sulla fibra di lunghezza e diametro⁸. Tuttavia, questo metodo richiede purificazione molto rigorose. Inoltre, EM è una tecnica specializzata che utilizza apparecchiature costose.

SDD-età è stato utilizzato per rilevare SDS-resistente complessi proteici di Dalton mega compreso amiloide o amiloide-come le fibre. Offre molti vantaggi. In primo luogo, esso non richiede la purificazione delle fibre ed è facile da peform⁹. In secondo luogo, fornisce informazioni qualitative circa le dimensioni delle fibre, tra cui la dimensione relativa e la quantità di heterogenicity di fibra. Infine, poiché macchiarsi occidentale può essere eseguita dopo l'elettroforesi, è facile rilevare la presenza di tutta la proteina per la quale c'è un anticorpo, anche se va notato che poiché SDD-età è semi-denaturante, alcuni epitopi possono rimanere nascosta che complica la rilevazione di anticorpi.

Recentemente, chinasi di proteina d'interazione del ricevitore 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) sono stati segnalati alle fibre amiloidi forma per servire come piattaforme di segnalazione durante necroptosis, una forma programmata di necrosi³. Studiando queste fibre, il nostro laboratorio ha dimostrato che un'altra proteina associata necroptosis, miscelati di chinasi di lignaggio dominio simile (MLKL), formata anche amiloide-come le fibre⁴. Tuttavia, su esame con SDD-età, la dimensione delle fibre MLKL apparso distinta dalle fibre RIPK1 e RIPK3, che è comparso identiche tra loro (Figura 1). Questo è stato inaspettato perché è ben noto che MLKL si lega al RIPK1/RIPK3 per formare la necroptosis segnalazione complesso denominato il necrosome¹⁰.

Ci sono almeno due spiegazioni. In primo luogo, due totalmente distinte amiloide-come le fibre possono formarsi durante necroptosis, contenente un RIPK1/RIPK3 e l'altro contenente MLKL. In secondo luogo, un solo tipo di amiloide-come le fibre che contenenti RIPK1/RIPK3/MLKL possono formarsi durante il necroptosis, ma l'associazione di MLKL con le altre proteine è abbastanza debole che dissocia in epoca di SDD.

Per risolvere questo problema, vi proponiamo di eseguire un bidimensionale (2D) SDD-età. SDD-età-stable amiloide o amiloide-come le fibre avrà lo stesso pattern di migrazione durante l'elettroforesi di prima e seconda dimensione. Questo sarà rilevabile dopo trasferimento le proteine ad una membrana e lo svolgimento di un Western blot. Stabile fibre esporrà un reticolo diagonale affilato. Qualsiasi deviazione da questo vorrei suggerire che le fibre subiscono cambiamenti dovuto l'elettroforesi di SDS.

Protocollo

1. preparare i campioni

1. Amiloide di cultura 2 x 10⁶ producendo le cellule di cancro del colon HT-29 in un piatto di coltura del tessuto 10 cm in 10 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) contenente 10% siero bovino fetale e penicillina-streptomicina. Cellule di coltura durante la notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
   1. Dopo che le cellule crescono per 80% confluency, lavare le cellule con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina e incubare a 37 ° C per 3 min.
   2. Dopo che le cellule sono totalmente dissociate dal piatto, aggiungere 10 mL di terreno di coltura e trasferire le cellule con una pipetta 10 mL in una provetta conica 15 mL. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 min a temperatura ambiente. Aspirare il mezzo, risospendere le cellule in 5 mL di terreno di coltura e contare le celle utilizzando un contatore di cellule. Piastra di 2 x 10⁶ cellule in ciascuno dei due piatti di 10 cm.
   3. Permettono alle cellule di aderire e recuperare durante la notte in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂. Applicare il trattamento per un piatto di indurre la formazione di amiloidi con un fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α), inibitore di 100 nM Smac-mimetici e 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK¹¹20 ng/mL. La combinazione è abbreviata come TSZ. Trattare l'altro piatto con veicolo come un controllo.
2. Dopo l'appropriato intervallo di tempo, solitamente 6 h, raccolto il lysate delle cellule.
   1. Raschiare le cellule fuori la piastra con un raschietto di plastica e usare una pipetta di 10 mL per trasferire in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 min a 4 ° C.
   2. Lavare le cellule 2 volte, risospendere in 10 mL di PBS freddo ghiaccio e centrifugazione a 1.000 x g per 3 min a 4 ° C. Aspirare la soluzione di PBS.
      Nota: Il processo può essere sospeso qui il pellet cellulare di congelamento in azoto liquido e archiviando a ˗80 ° C per 1 mese.
   3. Trasferire il pellet cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e incubare in 0,3 mL di tampone di lisi per 30 min in ghiaccio. Centrifuga a 20.000 x g per 15 min a 4 ° C. Il supernatante è l'intero lisato cellulare.
      Nota: Il processo può essere sospeso qui memorizzando il campione a-20 ° C per fino a diversi mesi.
   4. Misurare la concentrazione di proteina da un'analisi di Bradford secondo il protocollo del produttore. Aggiungere 4 x buffer di caricamento del SDD-età preparare 20 µ l di 3 µ g / µ l di campione e incubare a temperatura ambiente per 10 min.

2. preparare ed eseguire gel

1. Aggiungere 2 g di agarosio per 200 mL di tampone Tris-acetato di 1x (TAE) in un becher di vetro e il calore nel forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Aggiungere 1 mL di SDS 20% per una concentrazione finale di 0.1% di SDS. Agitare accuratamente per mescolare. Fare attenzione a non per generare bolle dopo l'aggiunta di SDS.
2. Versare la soluzione di agarosio in una lastra di gel di 15 cm x 14 cm. Utilizzare una pipetta 1 mL per eliminare eventuali bolle. Inserire un pettine 20-bene all'inizio.
3. Prima dimensione: pipetta 60 µ g di intera cella lysata sulla corsia di destra. Esegua il gel a 60 V per circa 4 h (fino a quando la parte anteriore della tintura è circa ¾ attraverso il gel) utilizzando il TAE contenente 0,1% SDS del buffer in esecuzione.
4. Secondo quota: ruotare delicatamente il gel 90° in senso antiorario (Figura 2A). Esegua il gel a 60 V per circa 4 ore.
   Nota: La condizione di esecuzione generale è 4 V/cm di lunghezza di gel. È importante che le condizioni di funzionamento sono esattamente lo stesso per le dimensioni di prime e seconda.

3. trasferimento

1. Utilizzare il metodo di trasferimento capillare per trasferire le proteine ad una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Figura 2B).
   1. Aggiungere 500 mL di buffer di trasferimento da un contenitore di 20 x 20 cm circa. Fare un 5 cm e alta pila di asciugamani di carta accanto al contenitore. L'area della superficie della parte superiore dello stack deve essere maggiore delle dimensioni del gel.
   2. Immergere un filtro di carta 14 x 15 cm in tampone di trasferimento e posto in cima alla pila di asciugamani di carta. Fare attenzione a posizionare sulla carta senza rughe o bolle. Ripetere con un altro pezzo di carta da filtro.
   3. Attivare una membrana PVDF 14 x 15 cm in metanolo per 30 s quindi lo strato su carta da filtro avendo cura di utilizzare un rullo per eliminare tutte le bolle. Risciacquare il gel con tampone di trasferimento e lo strato sulla parte superiore della membrana, ancora rotolando fuori tutte le bolle.
   4. Coprire il bordo degli asciugamani carta più vicini al contenitore del tampone di trasferimento con involucro di plastica. È importante che il ponte di carta costruito nel passaggio successivo non entrare in contatto diretto con la pila di asciugamani di carta.
   5. Immergere un pezzo di carta da filtro 15 x 35 cm in tampone di trasferimento e posizionarlo in modo che un'estremità copre la parte superiore del gel e l'altra estremità è nel contenitore del tampone di trasferimento. Ripetere con un altro ponte.
   6. Coprire il recipiente con pellicola trasparente e lasciare per una notte a temperatura ambiente.

4. Western Blotting rilevamento

1. Risciacquare la membrana con 50 mL di PBS contenente 0.05% Tween-20 (PBST) in un contenitore di 20 × 20 cm. Aggiungere 20 mL di latte di 5% in PBST. Roccia a temperatura ambiente per 30 min bloccare.
2. Pipettare 10 µ l di anticorpo di coniglio anti-MLKL in 20 mL di latte di 5% in PBST e aggiungere al contenitore. Incubare il bilanciere durante la notte a 4 ° C.
3. Lavare la membrana in 20 mL di PBST per 5 min., ripetere 5 volte.
4. 4 µ l di anti-coniugato-HRP a 20 mL di latte di 5% in PBST e aggiungere al contenitore. Incubare il rocker a temperatura ambiente per 2 h.
5. Lavare la membrana in 20 mL di PBST per 5 min., ripetere 5 volte.
6. Aggiungere substrato di chemiluminescenza (ECL) ed esporre a pellicole di raggi x secondo il protocollo del produttore.

Risultati

Dopo induzione di necroptosis, RIPK1 e RIPK3 hanno mostrato amiloide-come i modelli quasi identici (corsie 2 e 4, Figura 1). Tuttavia, MLKL fibre erano più eterogenei e sembravano di essere più piccolo di fibre di RIPK1/RIPK3 (corsia 6, Figura 1). Che li ha spinti a sviluppare il metodo 2D SDD-età per affrontare la possibilità se MLKL forma fibre di RIPK1/RIPK3-indipendente o MLKL semplicemente si dissocia da grandi fibre di ...

Discussione

L'aspetto più critico della 2D SDD-età è che le condizioni di elettroforesi sono gli stessi per la prima e la seconda dimensione. La capacità di rilevare una forte linea diagonale a 45° (che indica che non si è verificato nessun dissociazione o degradazione) dipende le fibre la migrazione in maniera identica sia durante electrophoreses. Utilizzando diverse condizioni, ad esempio cambiando la tensione o la lunghezza della fase di esecuzione, nasconderanno questi risultati. Inoltre, come è il caso per tradizionale 1...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L