アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

要約

ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

要約

アミロイドやアミロイド様線維は多くの人間の病気に関連付けられている、今多くのシグナル伝達経路の重要であることが発見されています。様々 な実験条件下でのこれらの繊維の形成を容易に検出する機能は潜在的な機能を理解するために不可欠です。多くの方法は、繊維を検出するために使用されているいくつかの欠点がないわけで。たとえば、電子顕微鏡検査 (EM) やコンゴーレッドまたは Thioflavin T にしばしば染色繊維の精製が必要です。その一方で、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は精製することがなく細胞抽出液の SDS 耐性のアミロイド様線維の検出をことができます。さらに、それは繊維の大きさの違いの比較をことができます。もっと重大に、それは西部にしみが付くことによって繊維内の特定の蛋白質を識別するために使用できます。時間がかかるであり、ラボの広い数をより簡単にアクセスできます。SDD 時代結果しばしば不均質性が変化します。それはタンパク質の SDS 存在下での電気泳動の中に複合体の解離に起因する不均一性の一部であるかどうか質問を上げます。このため、我々 は SDD 時代の SDD 時代に見られるサイズの不均一性が真に繊維不均質体内の結果、劣化または中にタンパク質のいくつかの解離の結果ではないかどうかの 2 番目の次元を採用しています。電気泳動。このメソッドは、SDD 時代プロセス中にアミロイドやアミロイド様線維が部分的に解離しない高速、定性の確認できます。

概要

¹アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの病態に関与するタンパク質のミスフォールディングによるアミロイド繊維の形成を知られている長い。最近では、アミロイドやアミロイド様線維形成が抗ウイルス自然免疫応答²ネクロトーシス^3,4中を含む人間と低い有機体のシグナル伝達経路の一部であると示されています。酵母^5,6などしたがって、実験室でこれらの繊維を検出する機能は重要です。現在、アミロイドとアミロイド様線維を検出する 3 つの主な方法があります: 染料、EM、および SDD 時代の使用。

コンゴ赤や Thioflavin T などの染料の使用では、急速な顕微鏡、分光法⁷を使用して容易に検出できるという利点を提供しています。しかし、コンゴ赤の場合、顕微鏡による検出には、繊維、または繊維のサイズを構成するタンパク質の特異性は提供しません。同様に、コンゴ赤または Thioflavin T のバインディングを蛋白質の複合体を検出する分光学の使用は、正または負の結果のみを提供します。

EM は、繊維と繊維の長さと直径の⁸について定量的な情報の存在の決定的な証拠を提供します。ただし、この方法では、非常に厳格な浄化が必要です。さらに、EM は高価な機器を使用する特殊な技術です。

SDD 時代は、SDS 耐性メガ ダルトン タンパク質やアミロイドのようなアミロイド繊維を含むを検出するために使用されています。多くの利点を提供しています。最初に、それは繊維の精製を必要としないし、peform⁹に簡単です。第二に、それは相対的なサイズおよび繊維の heterogenicity の量を含む繊維のサイズに関する定性的情報を提供します。ウェスタンブロッティングは、電気泳動後実行できます、ために、最後に、それは、SDD 時代は半変化、いくつかのエピトープが隠されたままにするそれに注意する必要がありますを任意のタンパク質、抗体がある存在を検出する簡単です抗体による検出を複雑になります。

最近では、受容体相互作用タンパク質キナーゼ 1 (RIPK1) と 3 (RIPK3) は、ネクロトーシス、壊死³のプログラムのフォームの間にプラットフォームをシグナルとして機能するフォーム アミロイド線維に報告されています。これらの繊維を勉強しながら私たちの研究室は、リネージュ キナーゼ ドメインのような (MLKL) を混合、別のネクロトーシス関連蛋白質がまた⁴アミロイド様線維を形成を示した。しかし、SDD の年齢を調べると、MLKL 繊維のサイズ登場登場お互い (図 1) と同じ RIPK1 と RIPK3 の繊維とは異なる。MLKL RIPK1/RIPK3 にバインド ネクロトーシス シグナリング複合 necrosome¹⁰と呼ばれる形成して知られているのでこれは予想外だった。

少なくとも 2 つの説明があります。最初に、2 つのまったく異なるアミロイドのような繊維がネクロトーシス、1 つ含む RIPK1/RIPK3 およびその他の含まれている MLKL の中にフォームがあります。第二に、含む RIPK1/RIPK3/MLKL 可能性がありますネクロトーシス、MLKL 協会他の蛋白質との間に形成されるアミロイド様線維の 1 種類のみですそれは SDD 時代の間に電離する十分に弱いです。

これに対処するため二次元 (2 D) SDD 時代を実行することを提案します。SDD 時代安定アミロイドやアミロイド様線維は最初と 2 番目のディメンションの電気泳動中に同じの移行パターンをあります。膜へのタンパク質の転送、西部のしみの実施後、これは検出可能になります。安定した繊維は、シャープな斜めパターンを展示いたします。これからの逸脱は、繊維が SDS 電気泳動による変化を受けることを示唆するでしょう。

プロトコル

1. 試料を準備します。

1. 2 x 10 の文化⁶アミロイド 10 ml のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシンを含む 10 cm 培養皿に HT 29 大腸がん細胞を生産します。培養細胞は、5% CO₂と 37 ° C のインキュベーターで一晩します。
   1. セルは、80% の confluency に成長後は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml セルを洗浄しています。トリプシン溶液 3 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。
   2. セルはお皿から完全解離後培地 10 mL を追加し、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットで細胞を転送します。室温で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心します。培地を吸引を 5 mL の培地、細胞を再懸濁します、携帯カウンターを使用してセルをカウントします。それぞれ 2 つの 10 cm 料理のプレート 2 x 10⁶セルです。
   3. 細胞が接着し、5% CO₂と 37 ° C のインキュベーターで一晩回復を許可します。一皿 20 ng/ml の腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、100 nM Smac 擬態と 20 μ M 汎カスパーゼ阻害剤 Z VAD FMK¹¹アミロイドの形成を誘導するために治療を適用します。組み合わせはチーリンと省略されます。コントロールとして車両と他の料理を扱います。
2. 適切な期間後 6 h 通常細胞ライセートの収穫します。
   1. プラスチックのスクレーパーとプレートから細胞をこすり、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットを使用します。4 ° C で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離します。
   2. 10 mL の氷冷 PBS に再、4 ° C で 3 分間 1,000 × g で遠心分離によってセルを洗浄して 2 回PBS ソリューションを吸い出しなさい。
      注: プロセスをここで休止して細胞ペレットを液体窒素で凍結し、˗80 ° C で 1 ヶ月保存できます。
   3. 1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを転送し、0.3 mL の氷の上で 30 分間溶解バッファーで孵化させなさい。4 ° C で 15 分間 20,000 × g で遠心します。上清は全細胞ライセートです。
      注: プロセスは、-20 ° c で数ヶ月にサンプルを格納することによってここで休止できます。
   4. 製造元のプロトコルに従ってブラッドフォードの試金蛋白質濃度を測定します。4 x 20 μ 3 μ g/μ L のサンプルを準備し、10 分間室温でインキュベート SDD 時代読み込みバッファーを追加します。

2. 準備し、ゲルを実行

1. 寒天 2 g を 200 mL のガラス製ビーカーで agarose を溶かし、電子レンジで加熱 1 x トリス酢酸バッファー (TAE) に追加します。最終濃度 0.1 %sds の 20 %sds の 1 mL を追加します。慎重に混合旋回します。SDS 添加後泡を生成しないように注意してください。
2. 15 cm × 14 cm ゲル平板にアガロース溶液を注ぐ。1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去します。1 つの 20 も櫛を上部に配置します。
3. まず寸法: ピペット 60 μ g の全細胞ライセート一番右車線で。(染料のフロントはゲルを通って約 ¾) まで約 4 時間 60 V でゲルを実行実行バッファーとして 0.1 %sds を含む TAE を使用します。
4. 2 番目の寸法: 慎重回転させるとゲル 90 ° 反時計回り (図 2A)。約 4 時間の 60 V でゲルを実行します。
   注: 一般的な走行条件は 4 V/cm のゲルの長さです。実行条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることが重要です。

3. 転送

1. ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜 (図 2B) に蛋白質を転送するための毛管転送メソッドを使用します。
   1. 転送バッファーの 500 の mL を追加し、約 20 cm × 20 cm のコンテナー。コンテナーの横にあるペーパー タオルの 5 cm 高スタックを確認します。スタックの先頭の表面積は、ゲルの大きさよりも大きくなければなりません。
   2. 転送バッファーの 14 cm x 15 cm のフィルター ペーパーを浸し、紙タオルのスタック上に配置。しわや気泡がない紙の上に注意してください。フィルター紙の別の部分でを繰り返します。
   3. 30 のメタノールで 14 cm x 15 cm PVDF 膜をアクティブに s は、ローラーを使用して、すべてのバブルを削除する世話ろ紙上にレイヤーします。転送バッファーでゲルを洗い流すし、再び任意の気泡をロールアウト、膜上にレイヤーします。
   4. プラスチック製のラップと転送バッファーのコンテナーに最も近いペーパー タオルの端をカバーします。ペーパー タオルのスタックとの直接接触に次の手順で紙の鉄橋が来ないことが重要です。
   5. 転送バッファーの 15 cm × 35 cm フィルター紙を浸漬し、一端がゲルの上をカバーしてもう一方の端は、転送バッファーのコンテナー内に配置します。別の橋を繰り返します。
   6. プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、室温で一晩おきます。

4. ウエスタンブロット検出

1. 0.05% を含む PBS の 50 mL の膜を洗浄トゥイーン 20 (pbst;) 20 cm × 20 cm のコンテナー。PBST で 5% ミルク 20 mL を追加します。ブロックを 30 分間室温でロック。
2. PBST で 5% ミルク 20 mL にウサギ抗 MLKL 抗体の 10 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。4 ° C で一晩ロッカーでインキュベートします。
3. 5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。
4. Pbst; 5% ミルク 20 mL に抗うさぎ HRP の 4 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。ロッカー 2 時間室温で孵化させなさい。
5. 5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。
6. 基板化学発光 (ECL) を追加し、製造元のプロトコルによると x 線フィルムを公開します。

結果

ネクロトーシス誘導後 RIPK1 と RIPK3 は、ほぼ同一のアミロイドのようなパターン (レーン 2、4、図 1) を示した。しかし、MLKL 繊維はより均一であった、RIPK1/RIPK3 繊維 (レーン 6、図 1) よりも小さくなるように見えた。求め、私たちは MLKL フォーム RIPK1/RIPK3 に依存しない繊維または MLKL を単に SDD 時代に大規模な RIPK1/RIPK3/MLKL ?...

ディスカッション

2 D の SDD 時代の最も重要な側面は、電気泳動条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることです。45 ° (解離や劣化が発生しなかったことを示す) でシャープな斜めラインによって異なります両方中に同じ方法で移行する繊維を検出する能力は electrophoreses します。電圧または実行時間の長さを変更するなど、さまざまな条件を使用して、これらの結果があいまいされます。また、従?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L