Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Resumo

Aqui usamos a eletroforese em gel de agarose semi desnaturação bidimensional para confirmar a presença de amiloide-como fibras de tamanho heterogêneo e excluir a possibilidade de que a heterogeneidade de tamanho é devido à dissociação das fibras de amiloides durante o gel processo em execução.

Resumo

Fibras de amiloides ou amiloide-como tem sido associadas com muitas doenças humanas e agora estão sendo descobertas importante para muitas vias de sinalização. A capacidade de detectar prontamente a formação destas fibras sob diferentes condições experimentais é essencial para a compreensão de sua função potencial. Muitos métodos têm sido utilizados para detectar as fibras, mas não sem alguns inconvenientes. Por exemplo, microscopia de elétron (EM), ou coloração com vermelho Congo ou Thioflavin T muitas vezes requer purificação das fibras. Por outro lado, eletroforese em gel de agarose detergente semi desnaturação (SDD-idade) permite a detecção das fibras de amiloide como SDS-resistente em extratos de células sem purificação. Além disso, permite a comparação entre a diferença de tamanho das fibras. Mais importante, ele pode ser usado para identificar proteínas específicas dentro das fibras pela mancha ocidental. É menos demorado e mais facilmente acessível a um maior número de laboratórios. SDD-idade resultados muitas vezes mostram um grau variável de heterogeneidade. Levanta a questão se parte da heterogeneidade resulta da dissociação da proteína complexa durante a eletroforese na presença de SDS. Por esta razão, nós empregamos uma segunda dimensão de SDD-idade para determinar se a heterogeneidade de tamanho vista em SDD-idade verdadeiramente é um resultado de fibra heterogeneidade na vivo e não um resultado de degradação ou dissociação de algumas das proteínas durante eletroforese. Este método permite a confirmação rápida e qualitativa que as fibras de amiloide ou amiloide-como não são parcialmente dissociando durante o processo de SDD-idade.

Introdução

A formação de fibras amiloides devido ao enrolamento de proteínas tem sido conhecida para jogar um papel em condições patológicas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e a doença de Huntington¹. Mais recentemente, a formação de fibras amiloides ou amiloide-como foi mostrada para ser uma parte das vias de sinalização em humanos, incluindo durante anti-virais resposta imune inata² e necroptosis^3,4e em organismos inferiores como fermento^5,6. Portanto, a capacidade de detectar essas fibras no laboratório é importante. Atualmente, existem três maneiras principais para detectar amiloide e fibras de amiloide, como: o uso de corantes e EM SDD-idade.

O uso de corantes, como o vermelho de Congo ou Thioflavin T, oferece a vantagem de ser rápida e facilmente detectável usando microscopia ou espectroscopia de⁷. No entanto, a detecção de pela microscopia, no caso de vermelho de Congo, não fornece nenhuma especificidade sobre quais proteínas compõem as fibras, ou o tamanho das fibras. Da mesma forma, o uso da espectroscopia para detectar a ligação vermelho Congo ou Thioflavin T de complexos de proteínas fornece somente um resultado positivo ou negativo.

EM fornece evidência conclusiva da presença de fibras e também informações quantitativas sobre a fibra comprimento e diâmetro⁸. No entanto, este método requer purificação muito rigorosa. Além disso, é uma técnica especializada que utiliza o equipamento caro.

SDD-idade tem sido usado para detectar SDS-resistente complexos de proteínas de Dalton mega incluindo amiloides ou amiloide-como fibras. Oferece muitas vantagens. Primeiro, ele não requer a purificação das fibras e é fácil de efetuar⁹. Em segundo lugar, fornece informações qualitativas sobre o tamanho das fibras, incluindo o tamanho relativo e a quantidade de heterogenicity de fibra. Por último, porque mancha ocidental pode ser realizada após eletroforese, é fácil detectar a presença de qualquer proteína para a qual existe um anticorpo, embora Note-se que porque SDD-idade é semi desnaturação, alguns resumos podem permanecer escondida que complica a deteção pelo anticorpo.

Recentemente, interação proteína quinase do receptor do 1 (RIPK1) e 3 (RIPK3) foram relatados à fibras de amiloides formulário para servir como plataformas de sinalização durante a necroptosis, uma forma programada de necrose³. Enquanto estudava estas fibras, nosso laboratório mostrou que outra proteína associada necroptosis, misturado a quinase de linhagem como domínio (MLKL), também formado de fibras de amiloide como⁴. No entanto, após um exame detalhado com SDD-idade, o tamanho das fibras MLKL apareceu distinto das fibras RIPK1 e RIPK3, que apareceu idênticas uns aos outros (Figura 1). Isso foi inesperado porque é sabido que MLKL vincula a RIPK1/RIPK3 para formar o necroptosis sinalização complexo chamado o necrosome¹⁰.

Existem pelo menos duas explicações. Primeiro, duas fibras de amiloide como totalmente distintas possam formar durante o necroptosis, um RIPK1 contendo/RIPK3 e o outro contendo MLKL. Em segundo lugar, apenas um tipo de amiloide-como fibras que contendo RIPK1/RIPK3/MLKL podem ser formado durante a necroptosis, mas a associação de MLKL com as outras proteínas é fraco suficiente que ele dissocia-se durante a idade do SDD.

Para resolver isso, propomos realizar uma bidimensional (2D) SDD-idade. SDD-idade-stable amiloide ou fibras de amiloide, como terá o mesmo padrão de migração durante a electroforese de primeira e segunda dimensão. Isto será detectável após a transferência das proteínas para uma membrana e realizar um Western blot. Fibras estáveis irão expor um padrão diagonal afiado. Qualquer desvio isto sugeriria que as fibras se submetem a mudanças devido a electroforese de SDS.

Protocolo

1. preparar as amostras

1. Amiloide de cultura 2x10⁶ produzindo células de câncer de cólon HT-29 em um prato de cultura de tecido de 10 cm em 10 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino e penicilina-estreptomicina. Células de cultura durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂.
   1. Depois que as células crescem a confluência de 80%, lave as células com 10 mL de tampão fosfato salino (PBS). Adicionar 3 mL de solução de tripsina e incubar a 37 ° C por 3 min.
   2. Depois que as células são totalmente dissociadas do prato, adicionar 10 mL de meio de cultura e transferir as células com uma pipeta de 10 mL para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min à temperatura ambiente. Aspire o meio, Ressuspender as células em 5 mL de meio de cultura e contar as células usando um contador de célula. Placa de 2 x 10⁶ células em cada um dos dois pratos de 10 cm.
   3. Permitir que as células de aderir e recuperar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂. Aplica o tratamento por um prato para induzir a formação de amiloides com fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), inibidor de 100 nM Smac-mimética e 20 µM pan-caspase Z-VAD-FMK¹¹de 20 ng/mL. A combinação é abreviada como TZ. Trate o outro prato com veículo como um controle.
2. Após o período adequado de tempo, geralmente de 6 h, colha o lisado celular.
   1. Raspe as células no prato com uma espátula de plástico e usar uma pipeta de 10 mL para transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C.
   2. Lavar as células 2 vezes por resuspending em 10 mL de PBS frio gelo e centrifugação a 1.000 x g, durante 3 min a 4 ° C. Aspire a solução de PBS.
      Nota: O processo pode ser pausado aqui congelando o centrifugado em nitrogênio líquido e armazenando a ˗80 ° C por até 1 mês.
   3. Transfira o centrifugado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e incubar em 0,3 mL de tampão de Lise por 30 min no gelo. Centrifugar a 20.000 x g por 15 min a 4 ° C. O sobrenadante é o lisado celular.
      Nota: O processo pode ser pausado aqui armazenando a amostra a-20 º C por até diversos meses.
   4. Medir a concentração de proteína por um ensaio de Bradford, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione 4 x amortecedor do carregamento do SDD-idade para preparar 20 µ l de 3 µ g / µ l de amostra e incubar a temperatura ambiente por 10 min.

2. preparar e executar géis

1. Adicione 2 g de agarose para 200 mL de 1x Tris-Acetato tampão (TAE) num copo de vidro e calor no microondas para derreter o agarose. Adicione 1 mL de SDS 20% para uma concentração final de 0,1% SDS. Cuidadosamente agite para misturar. Tome cuidado para não gerar bolhas após a adição de SDS.
2. Despeje a solução de agarose em uma laje de gel 15 cm x 14 cm. Utilize uma pipeta de 1 mL para eliminar quaisquer bolhas. Coloque um pente de 20-bem no topo.
3. Primeira dimensão: pipeta 60 µ g de lisado na faixa da extrema-direita celular. Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h (até a frente do corante é cerca de ¾ através do gel) usando o TAE contendo SDS 0,1% como o buffer de execução.
4. Segunda dimensão: Rode cuidadosamente o gel 90° no sentido horário(Figura 2). Funcione o gel em 60 V para cerca de 4 h.
   Nota: A condição de funcionamento geral é 4 V/cm de comprimento de gel. É importante que as condições de execução são exatamente o mesmo para as primeiras e segunda dimensões.

3. transferência

1. Use o método capilar de transferência para transferir as proteínas para uma membrana de difluoreto (PVDF) do polyvinylidene (Figura 2B).
   1. Adicionar 500 mL de tampão de transferência para um contêiner de 20 x 20 cm aproximadamente. Fazer uma pilha alta de 5 cm de toalhas de papel ao lado do recipiente. A área de superfície da parte superior da pilha deve ser maior que as dimensões de gel.
   2. Mergulhe num filtro de papel 14 x 15 cm no buffer de transferência e coloque no topo da pilha de toalha de papel. Tome cuidado para colocar no papel sem rugas ou bolhas. Repita com outro pedaço de papel de filtro.
   3. Ativar uma membrana PVDF 14 x 15 cm em metanol por 30 s em seguida mergulhá-la sobre o papel de filtro, tendo o cuidado de usar um rolo para remover todas as bolhas. Enxaguar o gel com buffer de transferência e mergulhá-la em cima da membrana, lançando novamente quaisquer bolhas.
   4. Cobrir a borda as toalhas de papel mais próximas ao contêiner do buffer de transferência com o envoltório plástico. É importante que a ponte de papel construída na próxima etapa não entre em contato direto com a pilha de papel toalha.
   5. Mergulhe um pedaço de papel de filtro de 15 cm x 35 cm no buffer de transferência e colocá-lo para uma extremidade cobre a parte superior do gel e a outra extremidade é no recipiente do buffer de transferência. Repita com a outra ponte.
   6. Cubra o recipiente com filme plástico e deixe durante a noite à temperatura ambiente.

4. Western mancha deteção

1. Lavar a membrana com 50 mL de PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBST) em um recipiente de 20 cm x 20 cm. Adicione 20 mL de leite de 5% em PBST. Rocha em temperatura ambiente por 30 min bloquear.
2. Pipete 10 µ l de anticorpo anti-MLKL em 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incubar em roqueiro durante a noite a 4 ° C.
3. Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.
4. Pipete 4 µ l de anti-rabbit-HRP a 20 mL de leite de 5% em PBST e adicionar ao recipiente. Incube em balancim em temperatura ambiente por 2 h.
5. Lave a membrana em 20 mL de PBST por 5 min. Repita 5 vezes.
6. Adicione o substrato de quimioluminescência reforçada (ECL) e expor para películas de raio x, de acordo com o protocolo do fabricante.

Resultados

Após a indução de necroptosis, RIPK1 e RIPK3 mostraram quase idênticos padrões como amiloide (faixas 2 e 4, Figura 1). No entanto, fibras MLKL foram mais heterogêneas e pareciam ser menor do que fibras RIPK1/RIPK3 (faixa 6, Figura 1). Que nos levou a desenvolver o método de SDD-idade 2D para abordar a possibilidade MLKL formam fibras de RIPK1/RIPK3-independente ou MLKL dissocia-se simplesmente partir de fibras de RIPK1/RIP...

Discussão

O aspecto mais importante da 2D SDD-idade é que as condições de eletroforese são os mesmos para a primeira e segunda dimensão. A capacidade de detectar uma nítida linha diagonal a 45° (indicando que não há dissociação ou degradação ocorreu) depende das fibras migrando de forma idêntica durante os dois de electroforese. Usar diferentes condições, por exemplo, alterando a tensão ou o comprimento de tempo de execução, irá obscurecer estes resultados. Também, como é o caso de tradicional 1D SDD-idade, a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L