השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי

Summary

כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.

Abstract

סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי קושרו עם מחלות רבות, עכשיו מתגלים להיות חשובה עבור רבים איתות המסלולים. היכולת לזהות בקלות היווצרות של סיבים אלה בתנאים שונים נסיוני חיוני להבנת פונקציית הפוטנציאל שלהם. שיטות רבות השתמשו כדי לזהות את הסיבים, אבל לא בלי מספר חסרונות. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), או צביעת קונגו האדום או Thioflavin T לעיתים קרובות דורשת טיהור של הסיבים. מצד שני, agarose דטרגנט למחצה denaturing בג'ל (SDD-גיל) מאפשרת זיהוי של סיבי עמילואיד דמוי עמידים מרחביות תמציות תא ללא טיהור. בנוסף, הוא מאפשר השוואת ההבדל בגודל של הסיבים. ויותר חשוב, זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בתוך הסיבים מאת סופג המערבי. זה פחות זמן רב ונגיש בקלות רבה יותר על מספר רחב של מעבדות. המפגין-גיל התוצאות מציגות לעיתים קרובות משתנה מידת הטרוגניות. זה מעלה את השאלה אם חלק הטרוגניות נובעת הדיסוציאציה של החלבונים במהלך אלקטרופורזה בנוכחות מרחביות. מסיבה זו, יש לנו עובדים ממד השנייה של המפגין-גיל כדי לקבוע אם הטרוגניות גודל ראיתי בעידן-המפגין הוא באמת תוצאה של סיבים הטרוגניות ויוו , לא תוצאה של השפלה או דיסוציאציה של חלק החלבונים במהלך אלקטרופורזה. שיטה זו מאפשרת אישור מהיר, איכותי כי סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי לא בריא באופן חלקי במהלך תהליך המפגין-גיל.

Introduction

היווצרות של סיבי עמילואיד עקב חלבון misfolding יש כבר זמן רב ידוע לשחק תפקיד פיפטות מחלות כמו אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון¹. לאחרונה, היווצרות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי הוכח להיות חלק איתות המסלולים בבני אדם, לרבות במהלך התגובה החיסונית מולדת אנטי ויראלית² ו- necroptosis^3,4, ואת היצורים התחתון כגון שמרים^5,6. לכן, היכולת לזהות סיבים אלו במעבדה הוא חשוב. כיום, ישנן שלוש דרכים הראשי כדי לזהות עמילואיד ו סיבי עמילואיד כמו: השימוש של צבעי EM, המפגין-גיל.

השימוש של צבעים, כגון קונגו האדום או Thioflavin T, מציעה את היתרון של להיות מהירה בקלות לזיהוי באמצעות מיקרוסקופ או ספקטרוסקופיה⁷. עם זאת, זיהוי על ידי מיקרוסקופ, במקרה של קונגו אדום, מספק אין ירידה לפרטים אודותיו חלבונים המרכיבים את הסיבים, או הגודל של הסיבים. בדומה לכך, השימוש של ספקטרוסקופיה לאתר קשירה קונגו אדום או Thioflavin T מתחמי חלבון מספק רק תוצאה חיובית או שלילית.

EM מספקת ראיה חלוטה הנוכחות של סיבים וגם מידע כמותי אודות סיבי האורך ואת קוטר⁸. עם זאת, שיטה זו דורשת טיהור מחמירים מאוד. בנוסף, EM היא טכניקה מיוחדת אשר משתמשת ציוד יקר.

המפגין-גיל שימש כדי לזהות עמידים מרחביות מגה דלטון חלבון מתחמי לרבות סיבי עמילואיד או דמוי עמילואיד. הוא מציע יתרונות רבים. ראשית, הוא אינו דורש הטיהור של סיבי, הוא קל לעיתים⁹. שנית, הוא מספק מידע איכותי על הגודל של הסיבים, כולל גודלו היחסי וכמות סיבים heterogenicity. לבסוף, מאחר סופג המערבי יכול להתבצע לאחר אלקטרופורזה, קל לזהות הנוכחות של כל חלבון אשר יש נוגדן, למרות יודגש כי מכיוון המפגין-גיל denaturing למחצה, epitopes מסוימים עשויים להישאר נסתרים אשר מסבך זיהוי על ידי נוגדנים.

לאחרונה, קולטן שמעצבת קינאז 1 (RIPK1) ו- 3 (RIPK3) דווחו על סיבי עמילואיד טופס כדי לשמש איתות פלטפורמות במהלך necroptosis, צורה מתוכנתים של נמק³. תוך כדי לימוד סיבים אלו, המעבדה שלנו הראה כי חלבון אחר הקשורים necroptosis, מעורב שושלת היוחסין קינאז כמו תחום (MLKL), נוצר גם סיבי עמילואיד דמוי⁴. עם זאת, לאחר בדיקה עם המפגין-גיל, גודל הסיבים MLKL הופיע נבדל הסיבים RIPK1 ו RIPK3, אשר הופיע זהים אחד לשני (איור 1). זה היה לא צפוי כי זה ידוע כי MLKL נקשר RIPK1/RIPK3 כדי ליצור necroptosis באיתות מורכבים שנקרא necrosome¹⁰.

ישנם לפחות שני הסברים. ראשית, שני סיבי עמילואיד דמוי שונים לגמרי עלולה להיווצר במהלך necroptosis, אחד המכיל RIPK1/RIPK3, את MLKL המכיל אחרים. שנית, רק סוג אחד של סיבי עמילואיד דמוי שהמכיל RIPK1/RIPK3/MLKL עשוי להיווצר במהלך necroptosis, אבל השיוך של MLKL חלבונים אחרים הוא חלש מספיק. כי זה dissociates במהלך המפגין-גיל.

כדי לטפל בבעיה זו, אנו מציעים מבצע דו מימדי (2D) המפגין-עידן. המפגין-גיל-יציבה עמילואיד או סיבי עמילואיד דמוי יהיה אותו דפוס ההעברה במהלך אלקטרופורזה הממד הראשון והשני. זה יהיה לזיהוי לאחר העברת החלבונים קרום, בביצוע של תספיג חלבון. סיבי יציב תערוכת דפוס אלכסוני חדה. כל סטייה ממנו הייתי מציע כי הסיבים עוברים שינויים עקב מרחביות-אלקטרופורזה.

Protocol

1. מכינים דגימות

1. תרבות 2 x 10⁶ עמילואיד לייצר תאים סרטניים של המעי הגס HT-29 בקערה תרביות רקמה ס מ-10 ב- 10 מ"ל של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) המכילה 10% סרום שור בעובר ו פניצילין-סטרפטומיצין. התרבות התאים לינה חממה 37 ° C עם 5% CO₂.
   1. לאחר התאים גדלים כדי 80% confluency, לשטוף את התאים עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 3 מ"ל של פתרון טריפסין, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
   2. לאחר התאים הם לגמרי dissociated מתוך קערה, להוסיף 10 מ של תרבות בינוני ולא להעביר את התאים עם פיפטה 10-mL צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. תשאף המדיום, resuspend את התאים ב 5 מ של תרבות בינוני, ולספור את התאים באמצעות מונה תא. צלחת 2 x 10⁶ תאים של שני ס מ-10 מנות כל אחת.
   3. לאפשר את התאים לדבוק ולשחזר ללון בחממה 37 ° C עם 5% CO₂. טיפול חלות על צלחת אחת כדי לגרום להיווצרות amyloids עם 20 ng/mL הגידול נקרוזה מקדם-אלפא (TNF-α), 100 ננומטר Smac-מימטי ולאחר 20 מיקרומטר פאן-קספאז מעכב Z-VAD-FMK¹¹. השילוב הוא באופן מקוצר כ- TSZ. פנקו את המנה אחרים עם רכב כפקד.
2. לאחר משך הזמן המתאים, בדרך כלל 6-אייץ ', לקצור את התא lysate.
   1. לגרד את התאים מהצלחת עם במגרדת פלסטיק ולהשתמש פיפטה של 10-mL להעביר לתוך צינור חרוטי 15-mL. Centrifuge התאים ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס.
   2. לשטוף את התאים פי 2 על ידי resuspending ב- 10 מ"ל של PBS קר קרח צריך שתוציאו ב g x 1,000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס. האחות הפתרון PBS.
      הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על ידי קופאת בגדר תא חנקן נוזלי ואחסון ב ˗80 ° C עד כחודש.
   3. בגדר תא להעביר צינור 1.5-mL microcentrifuge, דגירה ב mL 0.3 פירוק מאגר במשך 30 דקות על קרח. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. תגובת שיקוע הוא lysate את כל התא.
      הערה: התהליך ניתן להשהות כאן על-ידי אחסון הדגימה ב-20 ° C עבור אפילו מספר חודשים.
   4. למדוד את ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד על-פי הפרוטוקול של היצרן. להוסיף 4 x המפגין-גיל מאגר טעינה כדי להכין 20 µL מדגם µg/µL 3, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.

2. מכינים ולהפעיל ג'לים

1. להוסיף 2 גר' agarose 200 מ של 1 x טריס-אצטט (טה) של מאגר כוס זכוכית ומחממים במיקרוגל כדי להמיס את agarose. להוסיף 1 מ"ל של 20% מרחביות על ריכוז סופי של 0.1% מרחביות. מערבולת בזהירות לערבב. לטפל לא כדי לייצר בועות לאחר התוספת מרחביות.
2. שופכים את הפתרון agarose לתוך לוח ג'ל 15 ס מ x 14 ס מ. להשתמש על פיפטה 1-mL כדי לחסל בועות. מקום אחד מסרק 20-ובכן בחלק העליון.
3. תחילה ממד: פיפטה 60 µg של כל תא lysate בנתיב ימני-קיצוני. להפעיל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות (עד החזית צבע היא כ ¾ דרך הג'ל) באמצעות את הגטים המכיל מרחביות 0.1% כמו המאגר המצטבר.
4. שנית ממד: לסובב בזהירות את הג'ל 90° נגד כיוון השעון (איור 2א). הפעל את הג'ל 60 V במשך כ 4 שעות.
   הערה: הפעלה כללית היא 4 V/ג'ל ס"מ. חשוב כי התנאים פועל הן בדיוק זהה עבור הממדים הראשון והשני.

3. העברה

1. השתמש בשיטת העברה נימי כדי להעביר את החלבונים קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene (איור 2B).
   1. להוסיף 500 מ"ל של מאגר העברה כ 20 ס"מ על 20 ס"מ מיכל. להפוך ערימה גבוהה 5-ס מ של מגבות נייר ליד המכל. שטח הפנים העליון של הערימה חייב להיות גדול יותר מהמימדים ג'ל.
   2. להשרות נייר סינון של 14 ס"מ על 15 ס"מ מאגר העברה ומניחים על גבי נייר מגבת המחסנית. לטפל כדי למקם על הנייר ללא קמטים או בועות. חוזר עם עוד פיסת נייר סינון.
   3. להפעיל את קרום PVDF 14 ס"מ על 15 ס"מ ב מתנול עבור 30 s ואז להחליק אותו על נייר הסינון מקפיד להשתמש מכבש כדי להסיר את כל הבועות. לשטוף את הג'ל עם מאגר העברה, להחליק אותו על גבי הקרום, מגלגלים שוב בועות.
   4. לכסות על קצה מגבות הנייר הקרוב ביותר הגורם המכיל מאגר העברה בניילון נצמד. חשוב כי הגשר נייר נבנה בשלב הבא לא בא במגע ישיר עם הערימה מגבת נייר.
   5. לטבול פיסת נייר סינון 15 ס"מ x 35 ס"מ מאגר העברה ולמקם אותו כך קצה אחד מכסה את החלק העליון של הג'ל, והקצה השני נמצא בתוך המיכל מאגר העברה. חזור עם גשר נוסף.
   6. מכסה המכולה בניילון נצמד ומשאירים למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

4. ווסטרן סופג זיהוי

1. לשטוף את הקרום עם 50 מ של PBS המכילה 0.05% Tween-20 (PBST) בתוך מיכל 20 ס"מ × 20 ס"מ. הוסף 20 מ"ל חלב 5% PBST. רוק בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לחסום.
2. פיפטה 10 µL של הארנב נוגדן anti-MLKL לתוך 20 מ ל חלב 5% PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בין לילה ב 4 º C.
3. לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
4. פיפטה µL 4 של אנטי-rabbit-HRP 20 מ ל חלב 5% ב- PBST ולהוסיף המכולה. דגירה על נדנדה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
5. לשטוף את הקרום ב- 20 מ של PBST עבור 5 דק 5 חוזר פעמים.
6. להוסיף chemiluminescence משופרת המצע (ECL) ולחשוף לסרטי רנטגן לפי הפרוטוקול של היצרן.

תוצאות

לאחר אינדוקציה necroptosis, RIPK1 ו- RIPK3 הראו כמעט זהה עמילואיד דוגמאות (נתיבים 2 ו- 4, איור 1). עם זאת, סיבי MLKL היו הטרוגנית יותר ודומה להיות קטן יותר סיבים RIPK1/RIPK3 (ליין 6, איור 1). שהביאה אותנו לפתח שיטת המפגין-גיל 2D להתייחס לאפשרות MLKL טפסים סיבי RIPK1/RIPK3-עצ...

Discussion

הפן הקריטי ביותר של המפגין 2D-הגיל הוא כי התנאים אלקטרופורזה זהים עבור הממד הראשון והשני. היכולת לזהות קו אלכסוני חדה ב- 45 מעלות (המציין שהתרחשה אין דיסוציאציה או השפלה) תלוי הסיבים מעביר בצורה זהה במהלך שני electrophoreses. שימוש בתנאים שונים, לדוגמה שינוי המתח או את משך זמן ריצה, מטשטש את התוצאות ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L