JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم تقنية للاتصال ميكرومانيبوليشن من الحويصلات، استخدام التدرجات أيون الكالسيوم المترجمة. Microinjection الحل أيون الكالسيوم، بالقرب حويصلة دهن عملاقة، يستخدم ليعيد الغشاء الدهني، أسفر عن إنتاج الأغشية نتوءات أنبوبي.

Abstract

في مجموعة متنوعة واسعة من عمليات الخلية الأساسية، مثل الاتجار بغشاء والمبرمج، تحدث التحولات شكل غشاء الخلية التزامن مع الاختلافات المحلية في تركيز أيون الكالسيوم. وقد تم التعرف على المكونات الجزيئية الرئيسية المشاركة في هذه العمليات؛ ومع ذلك، أقل بكثير يعرف التفاعل محددة بين التدرجات أيون الكالسيوم والدهون داخل غشاء الخلية، أساسا بسبب الطابع المعقد للخلايا البيولوجية وصعوبة من أنظمة المراقبة. لسد هذه الفجوة، ينفذ بنجاح نهج اصطناعية للكشف عن أثر مترجمة من أيونات الكالسيوم في غشاء الخلية يقلد. إنشاء تقليد تشبه الظروف داخل خلية مشكلة سيفيرالفولد. أولاً، أن نموذج المحاكاة البيولوجية مناسبة مع الأبعاد المناسبة وتكوين غشاء مطلوب لالتقاط الخصائص الفيزيائية للخلايا. ثانيا، مطلوب إعداد ميكرومانيبوليشن لتسليم كمية صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى مكان غشاء خاص. وأخيراً، مطلوب نظام مراقبة لاكتشاف وتسجيل استجابة الغشاء الدهني للمؤثر الخارجي. تقدم هذه المقالة نهج المحاكاة البيولوجية مفصلة لدراسة التفاعل غشاء أيون الكالسيوم، حيث يتعرض نظام حويصلة في الدهون، يتكون من أونيلاميلار العملاقة حويصلة (جيوف) متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف)، لكالسيوم مترجمة وشكلت التدرج اللوني باستخدام نظام microinjection. لاحظ استخدام مجهر الأسفار ديناميات تأثير الأيونية في الغشاء وسجلت أسعار إطار الفيديو. نتيجة تحفيز غشاء، الغاية منحنى غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) شكلت داخل جيوف، التوجه بعيداً عن الغشاء. النهج الذي وصف بالحث على إعادة عرض الغشاء الدهن وإنتاج الخطة المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال بها والتي تسيطر عليها تماما. ويدخل هذا النهج وسيلة لمعالجة تفاصيل التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم، توفير سبل جديدة لدراسة آليات إعادة تشكيل غشاء الخلية.

Introduction

دور أيونات الكالسيوم داخل العمليات البيولوجية، على وجه التحديد مشاركتهم في الإشارات وانقسام الخلايا، والغشاء الانصهار، هو محور العديد من الدراسات الميكانيكية1. تركيز أيونات الكالسيوم داخل الخلايا هيولى يقارب 100 نانومتر، بينما الكالسيوم في العضيات، مثل هيولى والحويصلات الافرازية، الميتوكوندريا، الوصول إلى مستويات تصل إلى عشرات ميليمولارس في التركيز. يؤدي هذا إلى إنشاء أوامر الانحدار تركيز أيون الكالسيوم الحاد من حجم عبر الأغشية داخل الخلية2،3،،من45،،من67،8 ،9. مستوى أيون الكالسيوم خارج الخلية حوالي 2 ملم ومن ثم تحدث اختلافات تركيز أيون الكالسيوم على الصعيدين خارج الخلية وداخل الخلية. وعلاوة على ذلك، مزامنة الأخيرة الدراسات دليلاً على أن أيون الكالسيوم داخل الخلايا مما يشير إلى الأحداث ونشاط الخلايا العصبية يمكن أن يحدث في ظل ظروف التقلبات المحلية من تركيزات أيون الكالسيوم خارج الخلية، مما يشير إلى أهمية داخلها والكالسيوم خارج الخلية أيون الاختلافات10.

تهدف إلى فهم التفاعل بين أيونات الكالسيوم والأغشية البيولوجية، واتباع نهج اصطناعية التي يتم استبدال أغشية الخلية الأصلية بدهن بلير حويصلات قد نفذت بنجاح. تعريض الحويصلات إلى حلول أيون الكالسيوم يؤدي إلى تغييرات في مجموعات دهن الرأس والهيدروكربونية سلسلة التعبئة، والغشاء زيادة التوتر، وتجميع حويصلة، فضلا عن فصل الدهون والغشاء المرحلة الانتقالية11،12 ،،من1314،،من1516. خصائص الأغشية الدهنية عند التعرض لأيونات الكالسيوم قد تم التحقيق باستخدام هذه التقنيات التجريبية كالأشعة السينية، 1ح-الرنين المغناطيسي النووي، والدراسات الطيفية أو دينامي حراري11،16، 17 , 18-وفي هذه الدراسات، تكوين غشاء يتم ضبطها وكثيراً ما تشبه أغشية الخلية الأصلية وتحتوي على مثل هذه الدهون الفسيولوجية phosphatidylcholine (PC) وفوسفاتيديليثانولاميني (PE) وفوسفاتيديلسيريني (PS). ملاحظة: يكتسي أهمية خاصة في إعداد حويصلة مصطنعة لأنها عنصر أساسي في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك الاتجار بغشاء داخل الخلايا، والرقابة، والمبرمج19،20.

غالباً ما يتراوح حجم الحويصلات الدهنية المركبة نانومتر إلى عدة ميكرومتر. بين حويصلة مختلف الاستعدادات، الحويصلات أونيلاميلار العملاقة (جوفس)، التي هي عدة عشرات ميكرومتر في القطر، تتسم بأهمية خاصة نظراً لحجمها الكبير نسبيا، تشبه الخلايا أبعاد الفرد21 , 22 , 23-مساحة متوفرة جوفس تمكن أثر التدرجات الكيميائية المحلية على غشاء الخصائص الفيزيائية دراستها. وذلك بتعريض جزء من سطح الغشاء للمؤثرات الخارجية فقط، يمكن أن يحقق أوثق ديناميات الغشاء. على سبيل المثال، فقد ثبت أن التطبيق المترجمة من التدرجات الكيميائية أو درجة الحموضة إلى سطح جوفس يؤدي إلى تكوين نتوءات أنبوبي، التي لم تراع في المجمع التعرض24،25. ما لوحظ من الاختلافات في سلوك الغشاء الدعوة لزيادة تطوير أسلوب مخططات الاستجواب حويصلة واحدة الحصول على بعض الأفكار في آليات إعادة عرض غشاء الخلية.

بناء على أساليب microinjection وميكرومانيبوليشن من أوائل القرن العشرين26،27، فيما يتعلق بالتطورات الأخيرة أكثر من مخططات التلاعب حويصلة واحدة من،القرن الحادي والعشرين2328 ، يعرض هذا المقال نهج في الغشاء الذي يعيد البناء وتشكيل غشاء نتوءات أنبوبي (MTPs) في غشاء جيوف يتم إنشاؤها استجابة للطلب المحلي من أيونات الكالسيوم.

ويستخدم نهجنا حويصلة معقدة تتألف من جيوف متصلاً حويصلة مولتيلاميلار (ملف) كنظام نموذجي غشاء المحاكاة البيولوجية (الشكل 1A). ملف مطلوب كمستودع المحتوى دهني للمجمع لتوريد المواد الدهنية جيوف أثناء التعرض لتدرج أيون كالسيوم. يتيح هذا الاتصال المعقدة للتعويض عن زيادة التوتر الغشاء أثناء إعادة عرض المستحث وشكل الانتقال من الغشاء جيوف وتوفر الدهون للنمو الخطة المتوسطة الأجل. وعلاوة على ذلك، يسهل ملف التثبيت السطحي لأن كتلته أكبر مقارنة جيوف. المجمعات جيوف-ملف، عند معطلة على ركيزة صلبة، وقد استخدمت سابقا لإنتاج شبكات أنابيب نانوية-حويصلة، ودراسة التفاعل غشاء البوليمر، ومحاكاة المراحل المتأخرة من الرقابة29،30، 31،،من3233.

تستخدم البروتوكولات السابقة فول الصويا استخراج الدهن القطبي (SPE) لإعداد ملف جيوف مجمعات28. جمعية مهندسي البترول يتكون من خليط فوسفوليبيدات التي تتضمن أجهزة الكمبيوتر (45.7%)، PE (22.1%)، فوسفاتيديلينوسيتول (PI، 18.4 في المائة)، حمض فوسفاتيديك (السلطة الفلسطينية، ونسبة 6.9 في المائة)، وهي مزيج من الدهون الأخرى (6.9%). في بروتوكولنا هنا، هي يخدر الخليط جمعية مهندسي البترول بنسبة 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ملح الصوديوم) (DOPS) لتقليد النشرة الداخلية لغشاء بلازما الخلية. % 1 إضافية أتو 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-منشطات) يستخدم لوصمة عار بلير الدهن لتمكين الرصد من الغشاء يعيد البناء باستخدام مجهر الأسفار. جوفس تكوين الدهن متماثل عبر بلير ويتعرض محلياً لتركيزات 5 مم من كلوريد الكالسيوم (كاكل2). أيضا تقليد هذه الظروف التجريبية، مع تركيز أيون كالسيوم مرتفعة، النشرة الغشاء الخارجي للخلايا أبوبتوتيك، حيث تكون الجزيئات PS أعرب34. تشكيل المجمعات جيوف-ملف يتطلب استخدام أسلوب الجفاف باﻹماهة معدلة وضعت في البداية من قبل كثيرين وكيلر35. ويتضمن بروتوكول إعداد حويصلة تشكيل طبقة الدهن الجاف، الذي ثم يستخدم بشكل حويصلات صغيرة في الحل. هذا الحل هو المجففة ثم امهاء لتشكيل المجمعات جيوف-ملف النهائي. الشكل 2 ألف د- يوضح الخطوات الأساسية لإعداد مجمع جيوف-ملف نموذجي.

بعد الانتهاء من إعداد حويصلة وهو المعطل تداولها حويصلة المعقدة في الركيزة الزجاج، يستخدم تقنية microinjection بتسليم كميات صغيرة من أيونات الكالسيوم إلى النشرة الخارجي من جوف من خلال ميكروبيبيتي زجاج تلميح مفتوحة. تدفق حل الكالسيوم من الطرف يولد تدرج أيون كالسيوم مترجمة على سطح الغشاء جيوف، مما يؤدي إلى إعادة عرض الغشاء وتوليد الخطط المتوسطة الأجل. تتجه بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم الخطط المتوسطة الأجل وتنمو داخل جيوف. هذا تشكيل الخطة المتوسطة الأجل يمكن رصدها مباشرة باستخدام مجهر الأسفار وتسجيلها باستخدام كاميرا رقمية. ويبين الشكل 3 الإعداد التجريبية المستخدمة لإنتاج الأغشية إعادة عرض. تشكيل الخطط المتوسطة الأجل (2E الشكل و الشكل 4) في هذا البروتوكول يوضح نتيجة متناقضة لايون الكالسيوم التعرض التجارب تجري في ظروف التخزين الأكبر. تحت معظم الظروف، تمزق جوفس وتشكل بقع الأغشية التي يمكن ملاحظتها على التمسك بسطح الزجاج25.

مزيد من التفاصيل حول تشكيل المجمعات جيوف-ملف، فضلا عن إجراءات لتنفيذ microinjection أيونات الكالسيوم، وهي الموضحة في هذه المقالة. البروتوكولات وتركز إلى حد كبير على microinjection أيون الكالسيوم؛ ومع ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذا النهج لاستخدامها في دراسة الردود الغشاء بسبب التعرض المحلي إلى أيونات أو البروتينات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبطها تكوين الحويصلات لعزل أدوار المكون الدهني عملية إعادة عرض الغشاء. لا يتطلب أي معدات متطورة لإنتاج مجمعات جيوف-ملف البروتوكول قدم وتتميز بدرجة عالية من إمكانية تكرار نتائج.

Protocol

1-إعداد الحويصلات الدهنية الصغيرة

  1. إعداد حل الدهون جمعية مهندسي البترول/DOPS/ATTO488--المخدر في كلوروفورم مع كتلة خلط نسبة 79/20/1.The النهائي تركيز الدهون في كلوروفورم 1 ملغ/مل، وكتلة النهائي 0.6 ملغ (عادة أقل من 1 ملغ). استخدام المتاح جولة قنينة الزجاج السفلي (جولة أسفل أنابيب زجاجية، 10 × 75 مم) عند إعداد الحل الدهن دون خطوة ما قبل تنظيف.
    1. ملء وشطف المحاقن الزجاجية (25 ميليلتر) مع كلوروفورم 5 مرات على الأقل قبل الاستخدام. لتعبئة وشطف المحاقن الزجاجية 5 مرات على الأقل، 3-4 مل كلوروفورم كافية.
      تنبيه: عند التعامل مع كلوروفورم، استخدام المحاقن الزجاجية، وتنفيذ جميع الإجراءات في غطاء دخان أثناء ارتداء القفازات المناسبة والنظارات الواقية في جميع الأوقات. لا تستخدم أي قوارير بلاستيكية، والمحاقن، أو الممصات عند التعامل مع كلوروفورم.
  2. لف القنينة الزجاجية التي تحتوي على خليط الدهن مع رقائق معدنية لحماية المحتويات من الضوء المحيط وتتبخر المذيبات في مبخر روتاري ح 3 لإزالة كلوروفورم، مع الضغوط التي وصلت إلى 7 الجيش الشعبي الكوري فراغ 80 لفة في الدقيقة. فيلم الدهنية جافة يتكون في أسفل القنينة الزجاج بعد التبخر (الشكل 2A).
    ملاحظة: رفع مستوى عدة مرات واستخدام كميات أكبر من الدهون قد تتطلب وقتاً أطول من تبخر دوارة لضمان التخلص التام من كلوروفورم.
  3. ببطء بإضافة 600 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المحلول الملحي (PBS) في المخزن المؤقت (pH 7.8، دون تمييع) على رأس الفيلم الدهن المجففة. وبعد إضافة المخزن المؤقت، بلطف إضافة 6 ميليلتر من الجلسرين لحماية العينة من الجفاف الكامل خلال الخطوات (تحقيق تركيز نهائي والغليسيرول 1% بالوزن) تشكيل ملف جيوف36. ختم القنينة الزجاجية باستخدام بارافيلم، وتغطي برقائق معدنية لحماية من الضوء المحيط. تخزن في الثلاجة عند درجة 4 مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: الحل المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني يتكون من ز 0.151 من قاعدة تريزما ز 1.592 ك3ص4، 1.021 ز خ2ص4، ز 0.062 مجسو4 ·7H2س وز 0.0465 يدتا في 250 مل الماء النقي. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية، والحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال. ويمكن استخدام مبلغ يعادل 10 ملم حبيس المخزن المؤقت بدلاً من حل برنامج تلفزيوني. تعد الحل المخزن المؤقت حبيس تمييع حل أسهم حبيس م 1 مع تنقية المياه.
  4. وفي اليوم التالي sonicate القنينة الزجاجية التي تحتوي على الحل بالنسبة 1 دقيقة باستخدام حمام ultrasonication في درجة حرارة الغرفة. إزالة بارافيلم و "الماصة؛" حتى يتم تشكيل حل موحد بصريا من الحويصلات الدهنية الصغيرة (الشكل 2). الكوة 30 ميليلتر من الحل حويصلة الدهن الصغيرة التي تم الحصول عليها في أنابيب بلاستيكية الفردية 0.5 مل. إبقاء هذه مختبرين الأسهم عند-18 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر.
    ملاحظة: إذا كان الحل حويصلة صغيرة من الدهن لا بصريا الموحدة، دوامة الحل 4 مرات ل s 1-2 باستخدام خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة.

2-إعداد مجمعات جيوف-ملف

  1. ذوبان الجليد أنبوب بلاستيك تحتوي على قاسمة تعليق المجمدة من الحويصلات الدهنية الصغيرة إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة الأنبوب 4 مرات ل s 1-2 باستخدام خلاط دوامة بأقصى سرعة ممكنة.
  2. جولة ميليلتر 5 مكان تعليق حويصلة الدهن الصغيرة على سطح كشف الغطاء الزجاج (24 × 60 مم) لتشكيل صغيرة الحبرية. استخدام زلة غطاء زجاج دون أي خطوات ما قبل التنظيف.
  3. ضع بكشف غطاء الزجاج في مجفف فراغ (< 100 كيلوباسكال الفراغ) لمدة 20 دقيقة.
  4. تخزين الفيلم الدهن المجففة في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 دقائق، ثم ببطء "الماصة؛" 50 ميليلتر من 10 ملم حبيس العازلة فوق الفيلم الدهن الجاف الإماهة. انتظر 5 دقائق قبل تشكيل المجمعات جيوف-ملف (الشكل 2).
  5. مركز زلة غطاء زجاج في مرحلة مجهر، ثم "الماصة؛" 300 ميليلتر من المخزن المؤقت حبيس عليه وموقف مركز الحبرية أعلاه (الشكل 3B) والهدف.
  6. نقل 50 ميليلتر جيوف-ملف الحل قبل المشكلة إلى الحل حبيس (300 ميليلتر). انتظر 25 دقيقة قليلة شكلت مجمعات جيوف-ملف التمسك بشدة في سطح بكشف غطاء الزجاج (الشكل 2D).
    ملاحظة: في بعض الأحيان، مجمعات جيوف-ملف لا تشكل في كشف غطاء الزجاج وبدلاً من ذلك لوحظت بقع الدهن أو ملفس فقط. وهذا يمكن تفسيره بعرضي هز العينة أثناء خطوات 2.4 أو 2.6 أو العديد من دورات تجميد أذاب تعليق حويصلة صغيرة. كرر الخطوات من 2.1-2.6 أو استخدام حل مخزون الدهن الطازجة (الخطوة 1، 1) للحصول على مجمعات جيوف-ملف.

3-ميكروبيبيتي إعداد و Microinjection

  1. الجولة حواف زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية بوضع بلطف شعري ينتهي إلى شعلة شمعة للحيلولة دون كسر حين إرفاقها لصاحب ميكروبيبيتي في ميكروبيبيتي.
  2. سحب الشعيرات الزجاج على الأقل 3 استخدام ساحبة ليزر تلقائي استخدام مجموعة البرنامج: الحرارة = 400، سن الفيل = 4، حطي = 50، Del = 225، بول =؛ الحرارة = 400، سن الفيل = 4، حطي = 60، Del = 150، بول = 120. يجب أن يتم إدخال مجموعة برنامج مع القيمة الأولى لبول ترك فارغاً. استخدام زجاج البورسليكات الشعيرات الدموية للقطر الداخلي (معرف) 1.00 مم والقطر الخارجي (نقلت) ملم 0.78 النتائج في ميكروبيبيتي مع فتح نصيحة من حوالي 0.3 ميكرومتر في القطر.
  3. مرة أخرى--تعبئة كل ميكروبيبيتي مع ميليلتر 8 5 مم كاكل2 الحل في حبيس المخزن المؤقت (10 ملم) باستخدام ميكرولوادير. تصفية الحل2 كاكل باستخدام 0.2-0.5 ميكرومتر محقن تصفية قبل الاستخدام لتجنب انسداد من طرف ماصة.
    ملاحظة: تأكد من أن كاكل2 هو حل تماما في الحل حبيس المخزن المؤقت، الذي يستخدم أيضا للخطوات 2.4-2.6.
  4. قم بتوصيل حامل ميكروبيبيتي ميكرومانيبولاتور. جبل في ميكروبيبيتي في ميكروبيبيتي حامل محكم. قم بتوصيل مضخة حقن وحامل الشعرية استخدام أنابيب الإمداد.
  5. بدء تشغيل مضخة حقن. قم بضبط الإعدادات على مضخة حقن إلى 20 hPa (ضغط الحقن) وتعيين ضغط تعويض hPa 5، في الوضع التلقائي. إيقاف مضخة حقن حتى ميكروبيبيتي جاهز microinjection.
  6. تعيين المجهر لوضع برايتفيلد. تكوينه للتدخل التفاضلية التباين (DIC). استخدم 63 X أو X ارتفاع 100 غ (1.3) الأهداف لتحقيق القرار حافة الغشاء الأمثل.
  7. استخدم ميكرومانيبولاتور الخشنة لوضع ميكروبيبيتي فوق الحبرية التي تحتوي على مجمعات جيوف-ملف. قم بتحديد موقع غيض ميكروبيبيتي فوق الهدف.
  8. تركز المجهر على نقطة الوسط للمجمع جيوف-ملف وثم إعادة تركيز حوالي 50 ميكرومتر أعلاه جيوف. استخدام وضع الخشنة ميكرومانيبولاتور لإحضار ميكروبيبيتي لطف إلى التركيز.
  9. التبديل ميكرومانيبولاتور لوضع جيد. إعادة تركيز ببطء على السطح جيوف أثناء ترجمة نصيحة ميكروبيبيتي إلى أسفل والحفاظ نصيحة في التركيز. ضع ميكرومتر نصيحة ما يقرب من 20 ميكروبيبيتي من السطح جيوف. إذا كان التلميح ميكروبيبيتي مقطوعة بسبب الاتصال العرضي مع كشف الغطاء الزجاج (على سبيل المثال في الشكل 5B)، استبداله فورا لتجنب إطلاق أيون الكالسيوم لا لزوم لها في حل معظم العينة.

4-تشكيل والترجمة MTPs استخدام "مصدر أيون الكالسيوم"

  1. تعيين المجهر إلى وضع الأسفار. تعيين ديتشرويكس إلى إثارة في 488 نانومتر والكشف عن الانبعاثات في 505-550 نانومتر.
  2. التبديل على مضخة حقن وبدء ضخ أيونات الكالسيوم. استخدام وضع غرامة ميكرومانيبولاتور، ونهج جيوف مع نصيحة ميكروبيبيتي ببطء. ضع نصيحة ميكروبيبيتي على مسافة 3 ميكرومتر من سطح الغشاء بينما الحقن الحل2 كاكل من ميكروبيبيتي للسماح بالخطط المتوسطة الأجل للنموذج (الشكل 4).
  3. لترجمة الخطط المتوسطة الأجل على طول السطح جيوف، تتحرك ببطء نصيحة ماصة (مع سرعة 0.1-0.3 ميكرومتر/s) حول جيوف السطحي باستخدام ميكرومانيبولاتور غرامة (الشكل 6). صيانة تقريبا نفس المسافة (3 ميكرومتر) بين سطح جيوف ونصيحة ميكروبيبيتي مع استمرار الحقن أيون الكالسيوم.
    ملاحظة: أسعار الترجمة عالية من طرف ميكروبيبيتي (أعلاه 0.7 ميكرومتر/s)، الخطط المتوسطة الأجل لن يرتحل في تزامن مع ميكروبيبيتي. بدلاً من ذلك، أنهم سوف مبعثر وتقصير، في حين سيتم تشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (الشكل 7).
  4. لإيقاف microinjection، إيقاف مضخة حقن ونقل ميكروبيبيتي بعيداً عن السطح جيوف.

النتائج

في هذا العمل، ونظهر إنشاء مجمعات جيوف-ملف وكيف يمكن استخدامها لتوضيح تأثير التدرجات أيون الكالسيوم على ديناميات غشاء الخلية. المجمعات جيوف-ملف مرفق بسطح مطلوبة لهذه التجارب للسماح تقليد ثابت الحجم الخلية أثناء تأسيس تدرج أيون من خلال microinjection. الغشاء جيوف الذي يستجيب لتركيز الكالسيوم المترجمة من خلال تشكيل MTPs موجها بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يترجم الخطط المتوسطة الأجل حول جيوف بطريقة الاتصال بتحريك طرف ميكروبيبيتي حول سطح الغشاء.

ويرد على توضيح إجراءات إعداد ملف جيوف تخطيطي في الشكل 2. على الرغم من أن الفعل مسبقاً في البروتوكول المقدم، ويتم تشكيل المجمعات جيوف-ملف أثناء الخطوة 2، 4 (الشكل 2)، نقل الحل حويصلة إلى آخر قطره ميليلتر 300 من المخزن المؤقت (الخطوة 2، 6 من البروتوكول) يسمح مجمعات جيوف-ملف المشكلة قليلة إلى تلتزم بما فيه الكفاية بالركيزة الزجاج. وبهذه الطريقة، يتم تأسيس مجمع مناسبة ميكرومانيبوليشن و microinjection (الشكل 2D). في بعض الأحيان، جوفس تحتوي على واحد أو عدة حويصلات الدهن فخ، التي لا تؤثر في تشكيل الخطة المتوسطة الأجل، كما هو مبين في الشكل 4A. تنتج هذه جوفس الخطط المتوسطة الأجل؛ ومع ذلك، قد أعاقت التصوير إذا كانت الحويصلات فخ كبير. غالبية جوفس استعداد (تصل إلى 75 ٪) تظهر الكرة وإرفاقها ملفس، كما هو مبين في الشكل 1 ألف. هذه الحويصلات هي المحور الرئيسي لهذا البروتوكول، وهي مناسبة للإجراء microinjection. حوالي 25% جوفس المتبقية تظهر متموجة (الشكل 1B)، وهو يدل على نظام التوتر الغشاء السفلي. كما تسمح هذه الحويصلات المتموجة لتشكيل نتوءات أنبوبي؛ ومع ذلك، أنها تظهر حركية مختلفة ومن مورفولوجية مختلفة MTPs المشكلة، التي خارج نطاق هذا بروتوكول25. القطر نموذجية من الحويصلات استعداد يتفاوت بين 2 إلى 15 ميكرون ملفس وبين 2 إلى 40 ميكرومتر جوفس. جيوف الأمثل حجم التعرض لأيونات الكالسيوم هو 5 ميكرون أو أكبر.

وقد استخدمت ميكروبيبيتيس في الخلية أحرق الاستجواب مخططات كذلك كما هو الحال في الإجراءات التي تتطلب التلاعب جوفس الاصطناعية لعدة عقود37،38. وتشارك معظم هذه التطبيقات الاتصال المادي المباشر بين ميكروبيبيتي والسطح من الخلايا أو حويصلات. وتشمل الأمثلة تقنية التصحيح-المشبك أو سحب الحبال غشاء من الغشاء جيوف، بالإضافة إلى بناء أنبوب نانوي-حويصلة شبكات23،،من2839. في الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا لإنشاء التدرجات مترجمة من الأيونات والجزيئات حول جوفس لإعادة بناء الخلية غير المتجانسة ميكرونفيرونمينتس24،25ميكروبيبيتيس. في البروتوكول المقدم، وميكروبيبيتي يعمل بشكل سليم (الشكل 5A) عاملاً حاسما لإنشاء تدرج أيون كالسيوم على السطح جيوف عن طريق الإفراج عن الحل الوارد ضمن. وضعية ميكروبيبيتي في السطح جيوف السليم وتجنب الاتصال مع الغشاء الدهني ضرورية لنجاح microinjection. نصيحة ميكروبيبيتي يقام على مسافة حوالي 3 ميكرومتر من السطح جيوف، وعلى مسافة أمثل لتوليد MTPs بينما يقلد تباينات كالسيوم قرب غشاء الخلية. إذا كان التلميح ميكروبيبيتي كسر الصدفة (الشكل 5B)، مطلوب بديل. مجموعة كاكل تركيز سبق اختبارها2 داخل ميكروبيبيتي، الذي يسمح بتشكيل الخطة المتوسطة الأجل، بين 2 و 5 ملم25، الذي يتوافق مع تركيزات الكالسيوم خارج الخلية. ولوحظت في تركيزات أقل من2 كاكل، أي، 1 مم، لا MTPs.

تشكيل MTPs عند microinjection الكالسيوم يبدأ مع تشكيل إينفاجينيشنز الغشاء الصغيرة، التي تنمو في الخطط المتوسطة الأجل في موقع التعرض (الشكل 4 باء). الخطط المتوسطة الأجل تستمر في النمو ما دامت بقايا الغشاء جيوف تتعرض لأيونات الكالسيوم. أنها تتقلب وأشر بعيداً عن مصدر أيون الكالسيوم (الشكل 4، 1 فيلم التكميلية). عندما يتم إنهاء العرض أيون الكالسيوم الخطط المتوسطة الأجل مبعثر فوق سطح جيوف، مما يجعل من الصعب على اختتام سواء الخطط المتوسطة الأجل البقاء أو تختفي في نهاية المطاف.

تشكيل MTPs يمكن تفسيره بايون الكالسيوم المترجمة ملزمة للنشرة الخارجي يتعرض الغشاء جيوف وتسبب انحناء عفوية (m)، الذي يرتبط مباشرة مع تشكيل عفوية التوتر σ = 2κm2 (وهو صلابة الانحناءκ )، التي تؤدي إلى الانحناء للغشاء وتشكيل MTPs إلى الداخل. وقد أظهرت التقارير السابقة يمكن أن تشوه الغشاء أوضح بالتكثيف و/أو تجميع الدهون مشحونة سلبا على ربط أيونات الكالسيوم للغشاء، أدى إلى انحناء العفوية السلبية40. بدلاً من ذلك، ملزمة قوية من Ca2 + إلى سطح بلير مشحونة سلبا على تحييد كثافة الدهن يتعرض بلير النشرة تهمة السطحية. وهذا يؤدي إلى اختلاف الكثافة تهمة عبر بلير، أدى إلى انحناء عفوية غير صفرية، كافية لثني غشاء25.

لاحظ تشكيل MTPs يوضح حساسية الأغشية الدهنية إلى أيونات الكالسيوم ويقدم نهجاً جديداً يمكن الاتصال بها لإنتاج هياكل أنبوبية الغشاء. توضيح المنشأ لهذا توبوليشن الغشاء يمكن أن تكون هامة لفهم ديناميات الغشاء شكل الانتقال خلال مختلف وظائف الخلية وإعادة تشكيل الخلية ويمكن أن تكون مفيدة لاكتساب رؤى في تنظيم الدهون داخل الخلية الأغشية.

دائماً يتم إنشاؤها MTPs الملحوظ في الموقع على الغشاء تمر التعرض أيون الكالسيوم. وهكذا، عن طريق اختيار موقع طرف ميكروبيبيتي، فمن الممكن لتحديد منطقة سطح جيوف لنمو نتوء. المقبل، إذا كان ميكروبيبيتي ببطء (0.1-0.3 ميكرومتر/s) يتنقلون على السطح جيوف، مع المحافظة على المسافة الفاصلة من الغشاء، تترجم الخطط المتوسطة الأجل جنبا إلى جنب مع ميكروبيبيتي. الرقم 6 و التكميلية المقابلة 2 الفيلم تثبت هذه الهجرة للخطط المتوسطة الأجل حول سطح جيوف. هذه العملية من المحتمل أن تكون مصحوبة بتشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة على حقن أيون الكالسيوم المستمر25. أسعار الترجمة عالية (أعلاه 0.7 ميكرومتر/s)، الخطط المتوسطة الأجل ليست قادرة على اتباع نصيحة ميكروبيبيتي. بدلاً من ذلك، يتم تشكيل نتوءات الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (الشكل 7).

الكالسيوم تلامس الملاحظة الموجهة بايون ترجمة MTPs حول جيوف السطحية يمكن زيادة فهمنا للقيادة القوات وراء ديناميات هياكل أنبوبية غشاء داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يقدم هذا النهج وضع تلامس رواية لمراقبة نقل المواد في نظم هذه المسألة لينة باستخدام التدرجات الكيميائية.

figure-results-6614
الشكل 1 : صور الممثل مجهر فلوري مجمعات جيوف-ملف معطلة على السطح من زلة غطاء الزجاج. (أ)-مثال جيوف كروية. جوف يظهر في شكل نصف الكرة إرفاقه ملف. (ب)-مثال جيوف المتموجة. السهام السوداء تشير إلى المناطق المشوهة للغشاء. تعزيز الصور ومقلوب لتحسين تصور الأغشية جيوف المسمى فلوريسسينتلي. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-7257
الشكل 2 : الرسوم التوضيحية التخطيطي لإعداد ملف جيوف ومخططات microinjection. (أ)-تشكيل طبقة دهن جاف في أسفل القنينة الزجاج نتيجة التبخر الروتاري كلوروفورم من الحل الدهن. (ب)-هو سونيكاتيد في طبقة الدهن امهاء، وتتشكل الحويصلات الدهنية الصغيرة. (ج)-المعالجة تجميعية صغيرة الحل حويصلة (5 ميليلتر) وضعها على السطح من زلة غطاء الزجاج وتحويله إلى مجفف لمدة 20 دقيقة يذوي الحل الدهن وتشكيل فيلم دهن جاف (لا تظهر هذه الخطوة). ريهيدراتينج الفيلم الدهن الجاف مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت الحل تنتج مجمعات جيوف-ملف سابق التشكيل. (د)-نقل المجمعات سابق التشكيل إلى حجم أكبر من نتائج المخزن المؤقت في تشكيل ملفس جيوف المنفصلة قليلة تعلق على سطح بكشف غطاء الزجاج. (ه)-تحديد المواقع ميكروبيبيتي القرب من السطح جيوف وإطلاق أيونات الكالسيوم يؤدي تشكيل الخطط المتوسطة الأجل. لا يتم رسمها في الرسوم التوضيحية للجدول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-8387
الشكل 3 : برنامج الإعداد التجريبية ل microinjection أيونات الكالسيوم. (أ)-مكونات الإعداد التجريبية اللازمة لتوليد الخطط المتوسطة الأجل في جوفس. (ب)-تفاصيل إعداد microinjection. ساترة زجاجية مع حل المجمعات جيوف-ملف توضع في مرحلة المجهر. هو الزاوية بين ميكروبيبيتي وسطح بكشف غطاء الزجاج 30° (ملحوظ في الأبيض). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-9028
الشكل 4 : تكوين MTPs عند microinjection أيونات الكالسيوم على السطح جيوف. (أ)-ملف جيوف المجمع قبل التعرض لتدرج أيون كالسيوم. يشير السهم إلى حويصلة دهن الشرك داخل جوف، والتي لا تعرقل مراقبة MTPs. (ب). وتتشكل MTPs الصغيرة عند microinjection أيونات الكالسيوم (تركيز كاكل2 في ميكروبيبيتي 5 ملم). (ج)-النمو في الخطط المتوسطة الأجل عند التعرض المستمر لأيونات الكالسيوم. تعزيز الصور الفلورية ومقلوب لأغراض التصور. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-9808
الشكل 5 : زجاج ميكروبيبيتيس المستخدمة للكالسيوم أيون microinjection. (أ)-مثال ميكروبيبيتي يعمل بشكل سليم. (ب)-مثال ميكروبيبيتي يحتوي تلميح كسر (يشار إلى المنطقة المتضررة مع سهم أسود). كل الصور المحسن ومقلوب لرؤية أفضل. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-10390
الرقم 6 : ترجمة تسترشد أيون الكالسيوم MTPs حول سطح جيوف. (أ)-"الخطط المتوسطة الأجل" تتشكل على سطح جيوف عند microinjection 5 مم كاكل2 الحل. (ب-ج). ترجمة طرف ميكروبيبيتي (0.2-0.3 ميكرومتر/s) حول الغشاء مشغلات سطح حركة الخطط المتوسطة الأجل في اتجاه مصدر أيون الكالسيوم. السهام السوداء تسليط الضوء على اتجاه حركة ميكروبيبيتي. تعزيز الصور ومقلوب لتحسين التصور الغشاء. يمثل الشريط مقياس 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-11127
الشكل 7 : MTPs معدل الترجمة عالية من طرف ميكروبيبيتي- (أ)-"الخطط المتوسطة الأجل" تتشكل على سطح جيوف عند microinjection مم 5 كاكل2 الحل (الخط الأبيض). (ب-ج). النتائج بمعدل ترجمة عالية ميكروبيبيتي حول سطح جيوف (1 ميكرومتر/s) في تشكيل الخطط المتوسطة الأجل الجديدة في الموقع الجديد من طرف ميكروبيبيتي (خط أرجواني)، فضلا عن تشتت MTPs شكلت سابقا (الخط الأبيض). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-11826
فيلم التكميلي 1: تشكيل الخطط المتوسطة الأجل في جيوف عند التعرض المترجمة إلى المرجع المصدق 2 + التدرج. اضغط هنا لتحميل هذا الفيلم- 

figure-results-12260
فيلم تكميلي 2: الكالسيوم أيون الاسترشاد الهجرة الخطة المتوسطة الأجل حول سطح جيوف.   اضغط هنا لتحميل هذا الفيلم- 

Discussion

تسمح أنظمة المحاكاة البيولوجية الخلية لدراسة سلوك الغشاء عند التعرض للمؤثرات الخارجية مثل البروتينات، أيونات أو جسيمات نانوية. جوفس، يجري هذا نموذج، يمكن الاستجابة للتغييرات في البيئة الكيميائية عن طريق تعديل شكلها، الذي غالباً ما ينطوي على تشكيل أنبوبي الهياكل وإينفاجينيشنز24،،من4142،43 .

تقدم هذه المقالة نهج لتوليد الخطط المتوسطة الأجل بطريقة الاتصال عن طريق إعادة عرض سطح جيوف عند حقن مترجمة من أيونات الكالسيوم على السطح جيوف. ويصف البروتوكول إعداد المجمع جيوف-ملف الذي يحاكي غشاء بلازما خلية، وكذلك كيفية توظيف تقنية microinjection لتوليد الكالسيوم التدرجات أيون قريبة من جيوف السطحية لنموذج الخطط المتوسطة الأجل. تعرض معظم الدراسات التجريبية السابقة التي تناولت التفاعلات غشاء أيون الكالسيوم الحويصلات الدهنية لمعظم الكالسيوم تركيز أيون14،17. تبعاً لظروف تجريبية، قد يؤدي هذا التعرض الأكبر استجابة غشاء مختلفة مع لا نتوءات أنبوبي شكلت25.

تشكيل المجمعات جيوف-ملف مباشرة بدلاً من ذلك ولا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية، مثل مبخر دوراني، وحمام الموجات فوق الصوتية، وفراغ مجففة. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الهامة للنظر أثناء إعداد حويصلة. من المهم التأكد من أن جفاف الحويصلات كاملة (خلال الخطوة 2، 3 من البروتوكول) ويتكون فيلم دهن دائرية جافة التي تحتوي على كمية صغيرة فقط من بلورات الملح على سطح بكشف غطاء الزجاج. أثناء التجربة، حذراً في التعامل مع الحل حويصلة، استخدام الحل مخزون الدهن الطازج في كلوروفورم، فضلا عن الطازجة حبيس العازلة، أمر أساسي للإعداد الناجح للمجمعات جيوف-ملف. وعلاوة على ذلك، المهم مرفق أمن المجمع جيوف-ملف على سطح الزجاج كشف الغطاء ميكرومانيبوليشن و microinjection. للتأكد من مناسبة انضمام جيوف-ملف المعقدة، ميكروبيبيتي (بدون حقن التدفق) يمكن استخدامها لدفع بلطف على السطح جيوف. سوف لا الشريحة حويصلة التقيد بها بشدة على طول السطح عند الاتصال الجسدي المباشر. لأنه يتم تنفيذ التجارب في الحبرية فتح المخزن مؤقت، الذي قد يكون استجوابه لعدة ساعات، تبخر يجب أن تؤخذ في الاعتبار. التبخر من الحبرية المخزن المؤقت سوف تغير الظروف ناضح، التي يمكن أن تؤثر على وزعزعة استقرار الحويصلات. لاستعادة الأحوال ناضح، إرجاع إضافة دورية من المياه النقية إلى عينة لاستعادة وحدة التخزين الأصلية النظام إلى التوازن.

عند تعديل تكوين غشاء الدهن، من الأهمية بمكان أن الحويصلات يتم إنتاجها في شكل مجمع جيوف-ملف لأنه يسمح ملف لنقل المواد الدهنية جيوف أثناء إعادة الغشاء. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن استبدال مكونات المخلوط جمعية مهندسي البترول بالدهون نقية، أو إضافة 5-30 في المائة من نسبة الكولسترول في الدم، كما يسمح لملف جيوف تشكيل معقدة28،44. غالبيتهم من جوفس استعداد أونيلاميلار45.

وعلاوة على ذلك، عند اختبار الكاتيونات divalent الأخرى، مثل أيونات المغنيسيوم، تشكيل الخطط المتوسطة الأجل يتوقف إلى حد بعيد على وجود DOPS مشحونة سلبا في خليط الدهن. دون DOPS، لا تشكل الخطط المتوسطة الأجل في الحويصلات الموصوفة في هذا البروتوكول. أيضا، والكاتيونات الفموي الأحادي التكافؤ، مثل البوتاسيوم والصوديوم، لم تسفر عن تشكيل الخطط المتوسطة الأجل، حتى في الحويصلات المحتوية على DOPS25.

بالإضافة إلى خطوات حاسمة فيما يتعلق بإعداد والتلاعب جوفس، هناك عدة عوامل هامة للنظر أثناء إجراء microinjection. Microinjection الناجح من أيونات الكالسيوم تعتمد بشكل كبير على الأداء بشكل صحيح الزجاج ميكروبيبيتيس، التي تعد اليوم من التجربة. وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب ميكروبيبيتي لعطل. أن سبب شائعة افتتاح نصيحة انسداد. جزيئات الدهن الصغيرة، التي مشتقات إعداد حويصلة، موزعة في الحل، وتميل إلى التمسك بنصيحة ميكروبيبيتي، مما يولد من انسداد. ويتم تنظيف تلميح ماصة أفضل حتى رفع من الحل حويصلة ووضعه مرة أخرى قريبة من السطح جوف. ويجب تجنب استخدام الدالة التفجرات مضخة microinjection نظراً لأنه يؤدي إلى ضخ أيونات الكالسيوم الضخمة في حل الجزء الأكبر. وعلاوة على ذلك، منع فقاعات الهواء الصغيرة الشرك داخل ميكروبيبيتي microinjection السليم، التي يستعاض عن القضية ميكروبيبيتي مع واحدة جديدة. يمكن تصغير الكسر تلميح إلى حد كبير عن طريق وضع برنامج الإعداد التجريبية على طاولة الاهتزاز الملطف للتقليل من التذبذبات تلميح.

وعلاوة على ذلك، يحتاج الرعاية الواجب اتخاذها عند اختيار نظام مراقبة، للتقليل من فوتوبليتشينج حين الحصول على الصور مرة حل أفضل. واستخدمت مجهرية fluorescence المستحثة بالليزر واسع المجال في هذا البروتوكول لأنه يسمح لمعدل الحصول على صورة عالية نسبيا في عمق موضوعية تحقيق محدودة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام المجهر المقلوب microinjection المتزامنة والمراقبة للحويصلات الدهنية والخطط المتوسطة الأجل.

أحد القيود الرئيسية لأسلوب عرض هو شرط العمل اليدوي واسعة وكافية ميكرومانيبوليشن المهارات. لأن المجمعات التي تتشكل من خلال عملية تورم عفوية ولا يمكن التحكم في حجم جوفس وملفس. بالإضافة إلى ذلك، لا يسمح هذا البروتوكول للسيطرة على التوتر الغشاء من المجمعات جيوف-ملف المعدة، التي قد تكون ضرورية لجمع تفاصيل إضافية فيما يتعلق بإعادة عرض الغشاء. متصلة جوفس ملفس مع المواد الدهنية الموردة الأخير للنمو الكبير في الخطط المتوسطة الأجل إلى حد أنه سيكون من المستحيل تحقيق فقط استخدام الغشاء متاحة من جوفس. ملفس يسهم أيضا في تخفيض أي تغيرات التوتر السطحي الأفقي داخل ملف جيوف معقدة44، الذي من شأنه أن يعقد محاولات للسيطرة على التوتر من حويصلة باستخدام الشفط ميكروبيبيتي. يوفر هذا النموذج جيوف-المستندة إلى ملف خفض حدة توتر الذي يحاكي أفضل النظم التوتر التي وجدت في هياكل غشاء خلوي متصل بغشاء الخزانات، مثل الغشاء طيات وإينفاجينيشنز46. في الوقت نفسه، يمكن تطبيق تقنية الشفط ميكروبيبيتي بنجاح للتحكم في التوتر الغشاء جوفس واحد. على سبيل المثال، تقدم العمل الذي يقوم به غرابر et al. تفاصيل عن تكوين غشاء إينفاجينيشنز أنبوبي في جوفس واحدة عند ربط أيونات الكالسيوم للغشاء في معظم الظروف من التوتر المتنوعة نظم40. وأخيراً، يتطلب مقارنة سلوك الغشاء في التعرض المحلي والسائبة للكالسيوم تحسين الرقابة على التصاق الغشاء إلى السطح، والتي خارج نطاق هذا البروتوكول.

لتلخيص، يسمح الأسلوب المقترح لإعادة عرض تلامس الغشاء وتشكيل الخطط المتوسطة الأجل على تحفيز المترجمة مع أيونات الكالسيوم. التطبيقات المستقبلية لمركز هذا الأسلوب على الترجمة من نظم حويصلة الاصطناعية للأغشية البيولوجية الأصلية، مثل بليبس الخلية. الطريقة المقترحة يمكن إدماجها مع مخططات الاستجواب خلية واحدة أخرى، مثل أمبيروميتري التصحيح-المشبك أو ميكرويليكترودي، أو جنبا إلى جنب مع المترجمة تدفئة استراتيجيات31،،من4748. اختبار تأثير أيونات أو جزيئات أخرى واضحة، وينطوي على مجرد استبدال أيونات الكالسيوم مع جزيئات ذات الفائدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تنتج الحويصلات الدهنية التركيبية المعقدة من خلال غشاء الروغان مع البروتينات ترانسميمبراني، والذي يمكن توسيع فهمنا للفيزياء الحيوية لديناميات تشكيل وغشاء الخلية الخلية المرتبطة بالاستشعار المحلية تدرجات الكيميائية. أخيرا وليس آخراً، يمكن أيضا ترجمة التحفيز تلامس الغشاء الدهني لنظم البوليمرية المسألة لينة، توفر أساسا لمنصة تلاعب تلامس رواية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Soy bean polar lipid extractAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		541602C100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPSAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		840035C1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)ATTO-TEC (Germany)AD 488-311 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)Sigma Aldrich (Missouri, USA)20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/packCorning Incorporated (Corning, NY 14831)99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizerSigma Aldrich (Missouri, USA)650498-1L-D
Rotary evaporatorBüchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mmKEBO lab (Sweden)MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISOSharlau Chemie S.A. (Spain)P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%Sigma Aldrich (Missouri, USA)S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%Sigma Aldrich (Missouri, USA)G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%Sigma Aldrich (Missouri, USA)T-1503 2050 g
Trizma baseSigma Aldrich (Missouri, USA)P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)5886
MgSO4Merck (USA)34549-100 g
EDTASigma Aldrich (Missouri, USA)H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell cultureSigma Aldrich (Missouri, USA)Z260282-1PAK24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μmSigma Aldrich (Missouri, USA)631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slipVWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccatorVacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bathBandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixerLabnet International (USA)
488 nm laser line Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopesLeica (Germany)12847995 
Inverted fluorescence microscopy system Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)Technologies GmbH (Thuringia, Germany)300038
PatchStar MicromanipulatorScientifica (Uckfield, UK)612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf FemtojetEppendorf (Germany)

References

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?. Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137 microinjection

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved