Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Resumo

Apresentamos uma técnica para micromanipulação sem contacto das vesículas, usando gradientes de íons cálcio localizadas. Microinjeção de uma solução de íons cálcio, nas proximidades de uma vesícula lipídica gigante, é utilizada para remodelar a membrana lipídica, resultando na produção de saliências de membrana tubular.

Resumo

Em uma ampla variedade de processos celulares fundamentais, tais como tráfico de membrana e apoptose, transições de forma membrana celular ocorrem concomitantemente com variações locais na concentração de íons de cálcio. Os principais componentes moleculares envolvidas nesses processos foram identificados; no entanto, a interação específica entre gradientes de íons de cálcio e os lipídios dentro da membrana celular é muito menos conhecida, principalmente devido à natureza complexa de células biológicas e o difìcil de esquemas de observação. Para colmatar esta lacuna, uma abordagem sintética é implementada com sucesso para revelar o efeito localizado de íons cálcio na membrana celular imita. Estabelecer uma mímica para assemelhar-se as condições dentro de uma célula é um problema severalfold. Primeiro, um modelo adequado biomimetic com dimensões adequadas e composição da membrana é necessário para capturar as propriedades físicas das células. Em segundo lugar, uma instalação de micromanipulação é necessário entregar uma pequena quantidade de íons cálcio para um local específico da membrana. Finalmente, um regime de observação é necessária para detectar e registar a resposta da membrana lipídica para a estimulação externa. Este artigo oferece uma abordagem detalhada biomimético para estudar a interação íon-membrana de cálcio, onde um sistema de vesículas lipídicas, consistindo de uma vesícula unilamellar gigante (GUV) ligada a uma vesícula multilamellar (MLV), é exposto a um cálcio localizado gradiente formado usando um sistema de microinjeção. A dinâmica da influência iônica na membrana foram observada usando microscopia de fluorescência e gravada em vídeo frame taxas. Como resultado da estimulação de membrana, altamente curvado membrana tubular as saliências (MTPs) formadas dentro do chefe, orientada para longe da membrana. A abordagem descrita induz a remodelação da membrana lipídica e produção de MTP, de uma forma inteiramente sem contacto e controlada. Esta abordagem introduz um meio para resolver os detalhes das interações íon-membrana de cálcio, fornecendo novas vias para estudar os mecanismos de remodelagem de membrana celular.

Introdução

O papel dos íons cálcio dentro de processos biológicos, especificamente, sua participação na sinalização, divisão celular e a fusão da membrana, é o foco de muitos estudos mecanicistas¹. A concentração de íons cálcio intracelular citoplasmática é da ordem de 100 nM, enquanto o cálcio em organelas, tais como o retículo endoplasmático e vesículas secretoras mitocôndrias, atingir níveis de até dezenas de millimolars em concentração. Isso cria o cálcio acentuado gradiente de concentração de íon ordens de magnitude através de membranas intracelulares,^{2,3,4,5,6,7,8 ,9}. O nível de íons cálcio extracelulares é cerca de 2 mM e, portanto, as variações da concentração de íons de cálcio ocorrem em ambos os níveis extracelulares e intracelulares. Além disso, recentes estudos fornecem evidências que íon do cálcio intracelular sinalizando eventos e atividade neuronal pode ocorrer sob as condições das flutuações locais de concentrações de íons cálcio extracelular, indicando a importância do sincronizado intrae extracelulares de cálcio íon variações¹⁰.

Com o objetivo de compreender a interação entre os íons de cálcio e membranas biológicas, uma abordagem sintética, em que o nativo as membranas celulares são substituídas com vesículas de bicamada lipídica tem sido implementado com sucesso. Expondo as vesículas para soluções de íons de cálcio leva a mudanças em grupos de cabeça de lipídios e embalagem de cadeia de hidrocarbonetos, membrana maior tensão e agregação de vesículas, bem como a segregação de lípidos e membrana fase transição^{11,12 ,13,14,15,16}. As propriedades das membranas lipídicas após a exposição aos íons de cálcio foram investigadas usando tais técnicas experimentais como raio-x, ¹H-NMR e estudos espectroscópicos ou termodinâmico^{11,16, 17 , 18}. nesses estudos, a composição da membrana é ajustada frequentemente para assemelhar-se nativo das membranas celulares e contém tais lipídios fisiológicos como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) e fosfatidilserina (PS). PS é especialmente importante na preparação de vesícula artificial porque é um componente essencial em muitos processos celulares, incluindo tráfico de membrana intracelular, exocitose e apoptose^19,20.

O tamanho das vesículas de lipídios sintetizados, muitas vezes, varia de nanômetros para vários micrômetros. Entre as preparações diferentes vesículas, vesículas gigante unilamellar (GUVs), que são várias dezenas de micrômetros de diâmetro, são de particular importância devido ao seu tamanho relativamente grande, muito parecidas com as dimensões do indivíduo células^{21 , 22 , 23}. a área de superfície disponível dos GUVs permite que o efeito de gradientes químicos locais em Propriedades biofísicas de membrana a ser estudado. Expondo-se apenas uma parte da superfície da membrana para as estímulos externos, a dinâmica de membrana pode ser investigada mais de perto. Por exemplo, ficou demonstrado que o aplicativo localizado de gradientes químicos ou pH na superfície do GUVs leva à formação de saliências tubulares, que não foram observadas em maior exposição^24,25. As diferenças observadas no comportamento de membrana chamam para o desenvolvimento de esquemas de single-vesicle interrogatório para ganhar alguns insights sobre os mecanismos da membrana celular remodelação método.

Baseando-se os métodos de microinjeção e micromanipulação desde o início dos anos 1900^26,27, em conexão com os mais recentes avanços dos regimes de single-vesicle manipulação desde a década de 2000,^23,28 , este artigo apresenta uma abordagem na qual membrana remodelação e formação de membrana tubular as saliências (MTPs) na membrana chefe são gerados em resposta a aplicação local de íons cálcio.

Nossa abordagem utiliza uma vesícula complexa constituído por um chefe que está conectado a uma vesícula multilamellar (MLV) como um sistema de modelo de membrana de biomimetic (figura 1A). O MLV é necessário como um reservatório de lipídios para o complexo fornecer material de lipídios para o chefe durante a exposição a um gradiente de íons de cálcio. Esta conexão permite que o complexo compensar o aumento da tensão de membrana durante a remodelação induzido e forma de fazer a transição da membrana GUV e fornecem lipídios para crescimento de MTP. Além disso, o MLV facilita a imobilização de superfície porque sua massa é maior comparada com a do chefe. Os complexos de chefe-MLV, quando imobilizados sobre um substrato sólido, tem sido usados anteriormente para produzir redes de nanotubo vesículas, estudando a interação polímero-membrana e imitando os estágios finais da exocitose^{29,30, 31,32,33}.

Anteriores protocolos utilizaram extrato de lipídios polares de soja (SPE) para preparar o GUV-MLV complexos²⁸. A SPE consiste de uma mistura de fosfolipídios que incluem PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatidilinositol (PI, 18,4%), o ácido fosfatídico (PA, 6,9%) e uma mistura de outros lipídios (6,9%). Em nosso protocolo neste documento, a mistura SPE está dopada com 20% de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sal de sódio) (DOPS) para imitar o folheto interno da membrana plasmática celular. Um adicional 1% da ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) é usado para manchar a bicamada lipídica para habilitar o monitoramento da membrana remodelação usando microscopia de fluorescência. Os GUVs têm composição lipídica simétrica através da bicamada e localmente são expostos a concentrações de 5 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂). Tais condições experimentais, com uma concentração de íons de cálcio elevado, também imitam o folheto da membrana externa das células apoptóticas, onde as moléculas de PS são expressas³⁴. A formação dos complexos GUV-MLV requer o uso de um método de hidratação-desidratação modificado inicialmente desenvolvido por Criado e Keller³⁵. O protocolo de preparação de vesículas inclui a formação de uma camada lipídica seco, que é usada para formar pequenas vesículas na solução. Esta solução é, em seguida, desidratada e reidratada para formar os complexos de MLV-chefe finais. Figura 2A -D ilustra as principais etapas para a preparação de um típico complexo de chefe-MLV.

Após a preparação de vesículas é concluída e a complexo de vesículas é imobilizada sobre o substrato de vidro, a técnica de microinjeção é usada para entregar o folheto exterior do chefe através de uma micropipeta de vidro aberto-dica-pequenas quantidades de íons cálcio. O fluxo de cálcio solução fora a ponta gera um gradiente de íon cálcio localizadas na superfície da membrana GUV, levando a membrana remodelação e geração dos MTPs. Os MTPs são orientados longe da fonte de íons de cálcio e crescem dentro do chefe. Esta formação de MTP pode ser monitorizada diretamente usando microscopia de fluorescência e gravado usando uma câmera digital. A Figura 3 mostra a instalação experimental utilizada para produzir o remodelamento de membrana. A formação dos MTPs (Figura 2E e Figura 4) neste protocolo demonstra um resultado contrastante de cálcio íon exposição experimentos realizados em condições de volume em massa. Sob condições de granel, os GUVs se romper e formam manchas de membrana que podem ser observadas a aderir à superfície de vidro²⁵.

Mais detalhes sobre a formação de complexos o GUV-MLV, bem como o procedimento para realizar a microinjeção de íons cálcio, são explicados neste artigo. Os protocolos são mais focados em microinjeção de íons cálcio; no entanto, esta abordagem pode ser facilmente modificada para uso em estudar as respostas de membrana devido à exposição local a outros íons ou proteínas. Além disso, a composição das vesículas pode ser ajustada para isolar as funções do componente lipídico no processo de remodelação da membrana. O protocolo apresentado não exige qualquer equipamento sofisticado para produzir os complexos GUV-MLV e é caracterizado por um alto grau de reprodutibilidade.

Protocolo

1. preparação das vesículas lipídicas pequenas

1. Prepare uma solução de lipídios SPE/DOPS/ATTO488-DOPE no clorofórmio com uma relação de 79/20/1.The final, concentração de lipídios no clorofórmio é de 1 mg/mL e a massa final é de 0,6 mg (normalmente menos de 1 mg) de mistura de massa. Uso descartável redondo fundo frascos de vidro (redondo, tubos de vidro de fundo, 10 x 75 mm) ao preparar a solução de lipídios sem uma etapa de pré-limpeza.
   1. Preencher e enxágue as seringas de vidro (25 µ l) com clorofórmio pelo menos 5 vezes antes do uso. Para preencher e enxágue a seringa de vidro pelo menos 5 vezes, 3-4 mL de clorofórmio é suficiente.
      Cuidado: Quando Manipulação o clorofórmio, utilize seringas de vidro e executar todos os procedimentos em uma coifa usando luvas apropriadas e óculos de proteção em todos os momentos. Não utilize qualquer plásticos frascos, seringas ou pipetas ao manusear o clorofórmio.
2. Envolva o frasco de vidro contendo a mistura de lipídios com folha de metal para proteger o conteúdo de luz ambiente e evaporar o solvente em evaporador rotativo para 3h para remover o clorofórmio, com a pressão atingindo 7 kPa vácuo a 80 rpm. Um filme lipídico seco é formado na parte inferior do frasco de vidro após a evaporação (Figura 2A).
   Nota: Escala várias vezes e usando grandes quantidades de lipídios podem exigir mais tempo de evaporação rotativa para assegurar a remoção completa de clorofórmio.
3. Lentamente, adicione 600 µ l de fosfato tamponado solução-tampão salina (PBS) (pH 7.8, sem diluição) em cima do filme lipídico secas. Após a adição do buffer, delicadamente adicione 6 µ l de glicerol para proteger a amostra completa desidratação durante o GUV-MLV formação passos (atingir uma concentração final de glicerol de 1% em peso)³⁶. Feche o frasco de vidro usando parafilm e cubra com uma folha de metal para proteger da luz ambiente. Guarde na geladeira a 4 ° C durante a noite.
   Nota: A solução de tampão PBS consiste em 0,151 g de Trizma base, 1,592 g de K₃PO₄, 1,021 g de KH₂PO₄, 0,062 g de MgSO₄ ·7H₂O e 0,0465 g de EDTA em 250 mL de água purificada. Armazenar a solução a 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente antes do uso. A quantidade equivalente de 10 mM de tampão HEPES pode ser usada em vez de solução de PBS. A solução-tampão HEPES é preparada diluindo uma solução estoque de HEPES 1 M com água purificada.
4. No dia seguinte, proceda à sonicação o frasco de vidro contendo a solução por 1 min, utilizando um banho de ultrasonication à temperatura ambiente. Remova o parafilm e pipetar até uma solução visualmente uniforme das vesículas lipídicas pequenas é formada (Figura 2B). Alíquota de 30 µ l da solução obtidos lipídico pequenas vesículas para tubos de plástico individual 0,5 mL. Manter estas ações alíquotas a-18 ° C por um período máximo de 6 meses.
   Nota: Se a solução de vesículas lipídicas pequenas não é visualmente uniforme, vórtice a solução 4 vezes para 1-2 s usando um misturador do vortex na velocidade máxima.

2. preparação dos complexos GUV-MLV

1. Descongele à temperatura ambiente em um tubo de plástico contendo uma parte alíquota da suspensão congelada de vesículas lipídicas pequenas. Vórtice o tubo 4 vezes para 1-2 s usando um misturador do vortex na velocidade máxima.
2. Lugar 5 µ l da suspensão lipídico pequenas vesículas na superfície de uma lamela de vidro (24 x 60 mm) para formar uma pequena rodada da gota. Use uma lamela de vidro sem quaisquer etapas de pré-limpeza.
3. Colocar a lamela de vidro num exsicador de vácuo (< 100 kPa de vácuo) por 20 min.
4. Armazenar o filme lipídico seco à temperatura ambiente durante 4 minutos e, em seguida, lentamente, pipete 50 µ l de tampão HEPES de 10 mM em cima do filme lipídico seco para reidratação. Espere 5 min para pré-forma os complexos GUV-MLV (Figura 2).
5. Uma lamela de vidro no centro do palco do microscópio, em seguida, pipete 300 µ l de tampão HEPES nele e posicionar o centro da gota acima o objetivo (Figura 3B).
6. Transferi a 50 µ l da solução GUV-MLV pré-formado para a solução HEPES (300 µ l). Espere 25 min para permitir que escassamente formado GUV-MLV complexos aderir firmemente à superfície do deslizamento da tampa do vidro (Figura 2D).
   Nota: Ocasionalmente, os complexos de chefe-MLV não fazem sobre a lamela de vidro e em vez disso, patches de lipídios ou apenas MLVs são observados. Isto pode ser explicado por acidental agitação da amostra durante etapas 2.4 ou 2.6 ou numerosos ciclos de congelamento e descongelamento de suspensão de pequenas vesículas. Repita os passos 2.1-2.6 ou usar solução recentemente preparada de lipídios (etapa 1.1) para obter os complexos GUV-MLV.

3. microinjection e preparação de micropipeta

1. Volta das bordas dos capilares de vidro de borosilicato, suavemente, colocando o capilar termina na chama de uma vela para impedir que a micropipeta sendo quebrado enquanto anexá-lo ao titular da micropipeta.
2. Puxe pelo menos 3 capilares de vidro usando um extrator automático do laser usando o conjunto de programa: calor = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Calor = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. O conjunto do programa deve ser inserido com o primeiro valor do Pul deixado em branco. Usando o vidro de borosilicato capilares de diâmetro interno (ID) 1,00 mm e resultados de 0,78 mm diâmetro externo (OD) em uma micropipeta com uma abertura de ponta de cerca de 0,3 µm de diâmetro.
3. Costas-Encha cada micropipeta com 8 µ l de solução de CaCl₂ no tampão HEPES (10 mM) usando um microloader de 5 mM. Filtrar a solução de CaCl₂ usando um 0.2-0.5 µm filtro de seringa antes do uso para evitar entupimento da ponta da pipeta.
   Nota: Certifique-se que o CaCl₂ é completamente dissolvido em tampão HEPES, que também é usado para etapas 2.4-2.6.
4. Conecte um micromanipulador, titular de uma micropipeta. Monte a micropipeta no suporte da micropipeta firmemente. Ligue a bomba injetora e titular capilar usando o tubo de alimentação.
5. Ligue a bomba de injeção. Ajustar as configurações da bomba de injeção de 20 hPa (pressão de injeção) e uma pressão de compensação 5 hPa, no modo automático. Pause a bomba de injeção até a micropipeta está pronta para o microinjection.
6. Coloque o microscópio brightfield modo. Configurá-lo para o contraste de interferência diferencial (DIC). Objectivos de utilização 63 X ou 100 X at alta (1.3) para alcançar a resolução de borda de membrana ideal.
7. Use o micromanipulador grosseiro para posicionar a micropipeta acima da gota contendo os complexos GUV-MLV. Localize a ponta da micropipeta acima do objectivo.
8. Focar o microscópio o ponto médio do complexo GUV-MLV e recentrar então aproximadamente 50 µm acima o chefe. Use o modo grosseiro do micromanipulador para colocar suavemente a micropipeta em foco.
9. Alterne o micromanipulador para o modo de ajuste fino. Recentrar lentamente à superfície chefe enquanto traduzindo a ponta da micropipeta para baixo e mantendo a ponta em foco. Posicione a micropipeta ponta aproximadamente 20 µm da superfície GUV. Se a ponta da micropipeta é interrompida devido a um contacto acidental com a lamela de vidro (exemplo na Figura 5B), substituí-lo imediatamente para evitar a introdução de íon cálcio desnecessários em solução em massa da amostra.

4. formação e tradução de MTPs usando a fonte de íons de cálcio

1. Defina o microscópio em modo de fluorescência. Conjunto dichroics para excitar em 488 nm e detectar a emissão em 505-550 nm.
2. Ligar a bomba de injeção e iniciar a injeção de íons de cálcio. Use o modo de ajuste fino do micromanipulador e aproximar-se lentamente o chefe com a ponta da micropipeta. Posicione a ponta da micropipeta a uma distância de 3 µm da superfície da membrana enquanto injetando a CaCl₂ solução da micropipeta para permitir MTPs a forma (Figura 4).
3. Para traduzir os MTPs ao longo da superfície de chefe, mova lentamente a ponta da pipeta (com velocidade de 0,1-0,3 µm/s) em torno do chefe de superfície usando o micromanipulador fina (Figura 6). Manter aproximadamente a mesma distância (3 µm) entre a superfície do chefe e da ponta da micropipeta, continuando a injeção de íons de cálcio.
   Nota: Para os preços de tradução de alta da ponta da micropipeta (acima de 0,7 µm/s), os MTPs não migrará em sincronia com a micropipeta. Em vez disso, eles vão espalhar e encurtar, enquanto novas MTPs serão formadas no novo local da ponta da micropipeta (Figura 7).
4. Para parar a microinjeção, desligue a bomba de injeção e mover a micropipeta longe da superfície do chefe.

Resultados

Neste trabalho, vamos demonstrar a criação de complexos de chefe-MLV e como eles podem ser usados para elucidar o efeito dos gradientes de íons cálcio na membrana celular dinâmica. Conectados à superfície GUV-MLV complexos são necessários para estas experiências permitir uma mímica de células de tamanho fixa ao estabelecer um gradiente de íon através de microinjeção. A membrana do chefe responde à concentração de cálcio localizadas através da formação de MTPs dirigido longe da fonte de íons de cálcio. Além disso, os MTPs podem ser traduzidos em torno do chefe de uma forma sem contacto, movendo a ponta da micropipeta em torno da superfície da membrana.

Uma ilustração esquemática do processo de preparação do chefe-MLV é mostrada na Figura 2. Embora o protocolo apresentado, os complexos GUV-MLV são já pre-formados durante a etapa 2.4 (Figura 2), transferir a solução de vesículas para outro 300 da gota µ l de tampão (passo 2.6 do protocolo) permite que os complexos de chefe-MLV escassamente formados para suficientemente aderem ao substrato de vidro. Desta forma, é estabelecido um complexo adequado para micromanipulação e microinjeção (Figura 2D). Ocasionalmente, os GUVs contenham uma ou várias vesículas lipídicas aprisionado, que não afetam a formação de MTP, como indicado na Figura 4A. Estes GUVs produzem MTPs; no entanto, a imagem pode ser obstruída se as vesículas aprisionadas são grandes. A maioria dos GUVs preparados (até 75%) aparecem hemisférica e estão conectados para os MLVs, conforme mostrado na figura 1A. Essas vesículas são o foco principal do presente protocolo e são adequadas para o procedimento de microinjeção. Cerca de 25% de GUVs os restantes aparecem ondulantes (figura 1B), que é indicativo de um regime de tensão de membrana inferior. Essas vesículas ondulantes também permitem a formação de saliências as tubulares; no entanto, eles apresentam cinética diferente e uma morfologia diferente do formado do MSDN, que está além do escopo deste protocolo²⁵. O diâmetro típico das vesículas preparadas varia entre 2 a 15 µm para os MLVs e entre 2 a 40 µm para os GUVs. O chefe ideal tamanho para a exposição aos íons cálcio é 5 µm ou maior.

Micropipetas têm sido usadas em esquemas de interrogatório singe-célula, bem como em procedimentos que requerem manipulação de GUVs sintéticas por várias décadas^37,38. A maioria destas aplicações envolve contato físico direto entre a micropipeta e a superfície de células ou vesículas. Exemplos incluem a técnica patch-clamp ou puxando baraços de membrana de membrana GUV, além da construção de redes de nanotubo vesículas^23,28,39. Recentemente, micropipetas também tem sido usadas para gerar localizadas gradientes de íons e moléculas em torno de GUVs para reconstruir o heterogêneos célula microambiente^24,25. O protocolo apresentado, uma micropipeta funcione correctamente (Figura 5A) é um fator crucial para o estabelecimento de um gradiente de íons cálcio na superfície GUV, liberando a solução contida dentro. Adequado posicionamento da micropipeta na superfície de chefe e evitando o contato com a membrana de lipídios são essenciais para o sucesso microinjection. A ponta da micropipeta é mantida a uma distância de aproximadamente 3 µm, a partir da superfície do chefe, que é uma distância ideal para gerar MTPs enquanto imitando variações de cálcio perto da membrana celular. Se a ponta da micropipeta é acidentalmente quebrado (Figura 5B), um substituto é necessário. As concentrações testadas anteriormente gama de CaCl₂ dentro da micropipeta, que permite a formação de MTP, é entre 2 e 5 mM²⁵, que corresponde às concentrações de cálcio extracelular. Em concentrações de CaCl₂ , ou seja, 1 mM, são observados não MTPs.

A formação do MTPs em cima da microinjeção de cálcio começa com a formação de invaginações da membrana pequena, que crescem em MTPs no local da exposição (Figura 4B). Os MTPs continuam a crescer contanto que os restos de membrana GUV expostos para os íons de cálcio. Eles flutuam e apontam longe da fonte de íons de cálcio (Figura 4, complementar 1 filme). Quando o fornecimento de íons cálcio é finalizado, os MTPs espalham sobre a superfície do chefe, tornando-se difícil concluir se o MTPs permanecem ou eventualmente desaparecem.

A formação do MTPs pode ser explicada por íon cálcio localizadas vinculativa para o folheto exterior exposto da membrana GUV e provocando a curvatura espontânea (m), que está diretamente associado com a formação de espontânea da tensão σ = 2κm² (Κ é a rigidez de flexão), que induzem a dobra da membrana e formando para dentro do MSDN. Relatórios anteriores têm demonstrado que a deformação da membrana pode ser explicado pela condensação e/ou agrupamento dos lipídeos carregados negativamente sobre a ligação dos íons cálcio na membrana, resultando em curvatura negativa espontânea⁴⁰. Alternativamente, a forte ligação do Ca^{2 +} para a superfície da bicamada carregada negativamente neutraliza a densidade de carga superficial de folheto da bicamada lipídica exposta. Isto leva à diferença de densidade de carga através da bicamada, resultando em curvatura espontânea diferente de zero, suficiente para dobrar a membrana²⁵.

Observada formação de MTPs demonstra uma sensibilidade de íons de cálcio das membranas lipídicas e oferece uma nova abordagem sem contacto para a produção de estruturas tubulares da membrana. Elucidar a origem de tubulation Esta membrana pode ser importante para a compreensão da dinâmica da membrana forma fazer a transição durante várias funções da célula e remodelagem de célula e pode ser útil para obter insights sobre organização de lipídios dentro da célula membranas.

Os MTPs observados sempre são gerados no local da membrana submetidos à exposição de íons de cálcio. Assim, ao escolher a localização da ponta da micropipeta, é possível definir a área da superfície do chefe para o crescimento de protrusão. Em seguida, se a micropipeta é lentamente (0.1-0.3 µm/s) mudou-se em torno da superfície de chefe, mantendo a distância de separação da membrana, os MTPs traduzem-se em conjunto com a micropipeta. Figura 6 e a correspondente complementar Movie 2 demonstram tal migração dos MTPs em torno da superfície do chefe. Este processo é susceptível de ser acompanhada pela formação de novos MTPs em cima de injeção contínua de cálcio íon²⁵. Para os preços de tradução de alta (acima de 0,7 µm/s), os MTPs não são capazes de seguir a ponta da micropipeta. Em vez disso, formam-se novas saliências no novo local da ponta da micropipeta (Figura 7).

Cálcio sem contacto observados guiada por íon tradução do MTPs em torno da lata de superfície chefe ainda mais nosso entendimento sobre a condução das forças por trás da dinâmica de estruturas tubulares da membrana no interior das células. Além disso, essa abordagem oferece um modo romance sem contacto para controlar o transporte de material em matéria mole sistemas usando gradientes químicos.

Figura 1 : Imagens de microscopia fluorescente representativa dos complexos GUV-MLV imobilizadas na superfície de uma lamela de vidro. (A). exemplo de um chefe esférico. O chefe aparece sob a forma de um hemisfério anexado para o MLV. B. exemplo de um chefe ondulante. As setas pretas indicam as áreas deformadas da membrana. As imagens são reforçadas e invertidas para melhorar a visualização das membranas GUV fluorescente etiquetadas. A barra de escala representa 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Ilustrações esquemáticas da preparação GUV-MLV e os esquemas de microinjeção. (A). uma camada lipídica seco é formada na parte inferior do frasco de vidro como resultado da evaporação rotativa de clorofórmio da solução lipídica. (B). A camada lipídica re-hidratado é lisada, e formam-se vesículas lipídicas pequenas. C. uma gota pequena da solução de vesículas (5 µ l) é colocada na superfície de uma lamela de vidro e transferida para um dessecador por 20 min para desidratar a solução lipídica e formam um filme seco lipídico (este passo não é mostrado). Reidratar o filme lipídico seco com 50 µ l de solução-tampão produz os complexos GUV-MLV pré-formado. (D). A transferência dos complexos pré-formado para um maior volume de resultados de reserva na formação do chefe-MLVs escassamente separados anexado à superfície do deslizamento da tampa de vidro. (E). posicionamento da micropipeta perto da superfície do chefe e liberando os íons de cálcio desencadeia a formação do MTPs. As ilustrações não são desenhadas em escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Instalação experimental para a microinjeção de íons cálcio. (A). os componentes da instalação experimental necessário para gerar os MTPs nos GUVs. B. detalhes da instalação do microinjeção. A lamela de vidro com a solução dos complexos GUV-MLV colocado na fase de microscópio. O ângulo entre a micropipeta e a superfície de deslizamento da tampa do vidro é 30° (marcado em branco). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Formação de MTPs mediante a microinjeção dos íons cálcio na superfície do GUV. (A). The GUV-MLV complexo antes da exposição a um gradiente de íons de cálcio. A seta indica uma vesícula lipídica aprisionada dentro do chefe, e que não constitua a observação do MTPs. (B). MTPs pequenos são formados após a microinjeção de íons cálcio (concentração de 5 mM de CaCl₂ na micropipeta). C. crescimento dos MTPs após exposição contínua aos íons de cálcio. As imagens de fluorescência são reforçadas e invertidas para fins de visualização. A barra de escala representa 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Vidro micropipetas usadas para microinjeção de iões cálcio. (A). um exemplo de uma micropipeta funcione correctamente. B. um exemplo de uma micropipeta que tem uma ponta quebrada (área danificada é indicada com uma seta preta). As duas imagens são reforçadas e invertidas para melhor visualização. A barra de escala representa 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6 : Tradução de guiada por iões de cálcio dos MTPs em torno da superfície do chefe. (A). O MTPs são formadas na superfície após microinjeção de 5 mM CaCl₂ solução de chefe. (B-C). Tradução da ponta da micropipeta (0.2-0.3 μm/s) em torno da membrana superfície desencadeia o movimento dos MTPs na direção da fonte de íons cálcio. As setas pretas destacam-se a direção do movimento da micropipeta. As imagens são reforçadas e invertidas para melhorar a visualização da membrana. A barra de escala representa 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7 : MTPs a taxa elevada de tradução da ponta da micropipeta. (A). O MTPs são formadas na superfície de chefe em cima da microinjeção de 5 milímetros CaCl₂ solução (linha branca). (B-C). Uma taxa alta de tradução da micropipeta em torno da superfície do chefe (1 μm/s) resulta na formação de novos MTPs no novo local da ponta da micropipeta (linha magenta), bem como a dispersão dos MTPs anteriormente formados (linha branca). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Movie 1: Formação do MTPs em chefe após a exposição localizada à autoridade de certificação ^{2 +} gradiente. Clique aqui para baixar este filme. 

Complementar filme 2: Migração de MTP cálcio íon-guiada em torno da superfície GUV.   Por favor clique aqui para baixar este filme. 

Discussão

Sistemas de células de Biomimetic permitem o estudo do comportamento de membrana após a exposição a estímulos externos, tais como íons, proteínas ou nanopartículas. GUVs, sendo tal modelo, podem responder a alterações no ambiente químico ajustando sua forma, que muitas vezes envolve a formação de tubular estruturas e invaginações^24,41,42,43 .

Este artigo oferece uma abordagem para gerar MTPs, de uma forma sem contacto através de remodelação da superfície GUV mediante injeção localizada de íons cálcio na superfície do chefe. O protocolo descreve a preparação do complexo GUV-MLV, que imita uma plasma da membrana celular, bem como empregar uma técnica de microinjeção de cálcio de gerar gradientes de íon perto do chefe de superfície ao formulário do MSDN. A maioria dos estudos experimentais anteriores que abordou as interações íon-membrana de cálcio expostos vesículas lipídicas em massa^1714,concentração do íon cálcio. Dependendo das condições experimentais, tal exposição em massa pode resultar em uma resposta diferente da membrana com sem saliências tubular formadas²⁵.

A formação dos complexos GUV-MLV é bastante simples e só requer equipamentos de laboratório padrão, tais como um evaporador rotativo e banho ultra-sônico exsicador de vácuo. Ainda assim, existem vários passos críticos a considerar durante a preparação da vesícula. É importante assegurar que a desidratação das vesículas é completa (durante a etapa 2.3 do protocolo) e um filme seco lipídico circular que contém apenas uma pequena quantidade de cristais de sal é formado na superfície de deslizamento da tampa de vidro. Durante o experimento, cuidado de manipulação da solução de vesículas, usando solução de reserva lipídica fresco em clorofórmio, bem como fresco tampão HEPES, é essencial para a preparação bem sucedida dos complexos GUV-MLV. Além disso, a fixação segura do complexo MLV-chefe para a superfície de deslizamento da tampa de vidro é crucial para micromanipulação e microinjeção. Para confirmar a aderência adequada do chefe-MLV complexo, a micropipeta (sem fluxo de injeção) pode ser usada para empurrar suavemente contra a superfície do chefe. Uma vesícula firmemente aderida não irá deslizar ao longo da superfície em contato físico direto. Porque as experiências são executadas em uma gota de tampão aberto, que pode ser interrogada durante várias horas, evaporação deve ser tomada em consideração. Evaporação de gota buffer vai mudar as condições osmóticos, o que poderiam afetar e desestabilizar as vesículas. Para restaurar as condições osmóticos, adição periódica de água pura para a amostra para restaurar o volume original retorna o sistema para a homeostase.

Ao modificar a composição da membrana lipídica, é crucial que as vesículas são produzidas na forma de um complexo de chefe-MLV porque o MLV permite transferir o material lipídico para o chefe durante a remodelagem de membrana. Estudos anteriores mostraram que substituir os componentes da mistura SPE com lipídios puros, ou adição de 5-30% de colesterol, também permite a chefe-MLV complexante^28,44. A maioria dos GUVs preparados são unilamellar⁴⁵.

Além disso, ao testar outros cátions divalentes, tais como íons de magnésio, a formação dos MTPs fortemente depende da presença do DOPS carregados negativamente na mistura lipídica. Sem DOPS, os MTPs não formam em vesículas descritas neste protocolo. Além disso, cátions monovalentes, como potássio e sódio, não resultam na formação do MTPs, mesmo no DOPS-contendo vesículas²⁵.

Para além dos passos críticos no que diz respeito a preparação e manipulação das GUVs, existem vários factores importantes a considerar durante o procedimento de microinjeção. A bem sucedida microinjeção de íons cálcio depende fortemente funcionando corretamente micropipetas, que são preparadas no dia do experimento de vidro. Existem vários fatores que poderiam causar a micropipeta a avaria. Uma razão comum é uma abertura de ponta entupidos. Partículas de lipídios pequenos, que são subprodutos da preparação vesículas, estão dispersos na solução e tendem a aderir à ponta da micropipeta, gerando assim um entupimento. Limpar a ponta da pipeta é o melhor feito levantando-a partir da solução de vesículas e colocando-o atrás perto da superfície do chefe. O uso da função da bomba microinjeção de sopro deve ser evitado porque resulta em injeção maciça de íons cálcio na solução em massa. Além disso, as bolhas de ar pequeno aprisionadas no interior da micropipeta impedem microinjection adequada, em que caso a micropipeta deve ser substituído por um novo. Ruptura de ponta pode ser minimizada significativamente, colocando a configuração experimental em uma tabela de amortecimento de vibração para minimizar as oscilações de ponta.

Além disso, cuidado deve ser tomado ao escolher um regime de observação, para minimizar o fotobranqueamento enquanto obtendo as melhores imagens de tempo-resolvido. Microscopia de fluorescência induzida por laser de campo amplo foi utilizada no presente protocolo, porque permite uma taxa de aquisição de imagem relativamente elevado a uma profundidade de sonda limitada objetiva. Além disso, uso da microscopia invertida permite microinjeção simultânea e observação das vesículas lipídicas e do MSDN.

Uma das principais limitações do método apresentado é a exigência do extenso trabalho manual e habilidades suficientes de micromanipulação. Porque os complexos são formados por um processo de inchaço espontâneo, o tamanho do GUVs e MLVs não pode ser controlado. Além disso, este protocolo não permite controle da tensão da membrana dos complexos GUV-MLV preparados, que pode ser necessário recolher detalhes adicionais no que respeita à remodelação de membrana. Os GUVs estão ligados as MLVs com o último material lipídico fornecimento pelo crescimento substancial do MTPs, de forma que seria impossível conseguir utilizando unicamente a membrana disponível a partir do GUVs. Os MLVs também contribuem para reduzir quaisquer variações de tensão de superfície lateral dentro do chefe-MLV complexo⁴⁴, que complicaria as tentativas de controlar a tensão da vesícula usando aspiração micropipeta. Este chefe MLV-modelo fornece uma tensão mais baixa que melhor imita os regimes de tensão encontrados em estruturas de membrana celular conectadas ao reservatório de membrana, tais como membrana dobras e invaginações⁴⁶. Ao mesmo tempo, a técnica de aspiração micropipeta pode ser aplicada com sucesso para controlar a tensão de membrana em GUVs único. Por exemplo, o trabalho de Graber et al forneceu detalhes sobre a formação de invaginações tubulares da membrana no único GUVs a ligação de íons cálcio para a membrana em condições da maior parte da tensão variados regimes⁴⁰. Finalmente, a comparação entre o comportamento de membrana em exposição local e do volume de cálcio requer controle melhorado da adesão da membrana para a superfície, o que está além do escopo do presente protocolo.

Para resumir, a proposta técnica permite a membrana sem contacto remodelação e formação do MTPs após estimulação localizada com íons de cálcio. Aplicações futuras deste centro de método da tradução de sistemas sintéticos de vesículas para nativas membranas biológicas, tais como bolhas de célula. O método proposto pode ser incorporado com outros sistemas de interrogatório de célula única, tais como remendo-braçadeira ou microeletrodos amperometry, ou combinado com localizadas estratégias^31,,^47,48de aquecimento. Testar o efeito de outros íons ou moléculas é simples e envolve simplesmente substituir os íons de cálcio com as moléculas de interesse. Além disso, vesículas do complexo lipídico sintético podem ser produzidas através de functionalization membrana com proteínas transmembranares, que pode expandir nosso entendimento sobre a biofísica da dinâmica de remodelagem e a membrana celular de célula associada com detecção de local gradientes químicos. Último mas não menos importante, sem contacto estimulação da membrana lipídica também pode ser traduzida para sistemas poliméricos matéria mole, oferecendo uma base para uma plataforma nova manipulação sem contacto.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soy bean polar lipid extract	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	541602C	100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	840035C	1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	ATTO-TEC (Germany)	AD 488-31	1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack	Corning Incorporated (Corning, NY 14831)	99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	650498-1L-D
Rotary evaporator	Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm	KEBO lab (Sweden)	MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO	Sharlau Chemie S.A. (Spain)	P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	T-1503 2050 g
Trizma base	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	5886
MgSO4	Merck (USA)	34549-100 g
EDTA	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	H0887 Sigma
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	Z260282-1PAK	24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	631-1339
Menzel Gläzer #1, glass cover slip	VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator	Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath	Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer	Labnet International (USA)
488 nm laser line	Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes	Leica (Germany)	12847995
Inverted fluorescence microscopy system	Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)	Technologies GmbH (Thuringia, Germany)	300038
PatchStar Micromanipulator	Scientifica (Uckfield, UK)	612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.	Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)	VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller	Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet	Eppendorf (Germany)