Membran Umbau des riesigen Vesikel in Reaktion auf lokalisierte Kalzium Ionen-Gradienten

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Technik zur kontaktlosen Mikromanipulation von Vesikeln, mit lokalisierten Kalzium Ionen Steigungen. Mikroinjektion einer Kalzium-Ionen-Lösung, in der Nähe einer riesigen Lipid-Bläschen, wird genutzt, um die Lipidmembran, wodurch die Produktion der Membran röhrenförmige Ausstülpungen umzugestalten.

Zusammenfassung

In einer Vielzahl von grundlegenden Zellprozesse wie Membran Menschenhandel und Apoptose auftreten Zellmembran Form Übergänge gleichzeitig mit lokalen Variationen in Calcium-Ionen-Konzentration. Die wichtigsten molekularen Bestandteile in diese Prozesse eingebunden wurden identifiziert; aber das besondere Zusammenspiel von Kalzium Ionen-Gradienten und die Lipide innerhalb der Zellmembran ist weit weniger bekannt, vor allem aufgrund der Komplexität biologischer Zellen und der Schwierigkeit der Beobachtung Regelungen. Um diese Lücke zu schließen, wird ein synthetischen Ansatz erfolgreich umgesetzt, um die lokalisierte Wirkung von Calcium-Ionen auf Zellmembran Mimik zu offenbaren. Zur Gründung einer Mimik, die Bedingungen innerhalb einer Zelle ähnelt, ist ein severalfold Problem. Erstens ist eine angemessene biomimetische Modell mit entsprechenden Dimensionen und Membran Zusammensetzung erforderlich, um die physikalischen Eigenschaften der Zellen zu erfassen. Zweitens ist eine Mikromanipulation Setup erforderlich, eine kleine Menge von Calcium-Ionen zu einem bestimmten Membran Ort zu liefern. Schließlich ist eine Beobachtung Schema erforderlich, die Reaktion der Lipidmembran auf die externe Stimulation zu erkennen. Dieser Artikel bietet einen detaillierten Biomimetischer Ansatz für das Studium der Kalzium Ionen-Membran Interaktion, wo ein Lipid Vesikel System, bestehend aus einer giant Unilamellar Vesicle (GUV) verbunden mit einer multilamellar Vesikel (MLV), eine lokalisierte Kalzium ausgesetzt ist Farbverlauf gebildet mit einem Mikroinjektion System. Die Dynamik der Ionischen Einfluss auf die Membran mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet und aufgenommen im video Frame-Raten. Durch die Membran Stimulation gebogene hoch Membran röhrenförmige Ausstülpungen (MTP) innerhalb der GUV, ausgerichtet von der Membran gebildet. Die beschriebene Vorgehensweise induziert die Umgestaltung der Lipidmembran und MTP-Produktion in einer völlig Kontaktlos und kontrollierte Art und Weise. Dieser Ansatz stellt ein Mittel an die Details des Kalzium Ionen-Membran Interaktionen, bietet neue Wege, um die Mechanismen der Zellmembran Umformung zu studieren.

Einleitung

Die Rolle von Calcium-Ionen in biologischen Prozessen, insbesondere ihre Teilnahme signalisiert, Zellteilung und Membranfusion, steht im Mittelpunkt von vielen mechanistische Studien¹. Die intrazellulären zytoplasmatischen Kalzium Ionen-Konzentration ist in der Größenordnung von 100 nM, während das Kalzium in Organellen wie das endoplasmatische Retikulum, sekretorischen Vesikel und Mitochondrien, erreichen bis zu zehn Millimolars in Konzentration. Dies schafft steile Kalzium-Ionen-Konzentration Steigung Größenordnungen über intrazelluläre Membranen^{2,3,4,5,6,7,8 ,9}. Der extrazellulären Kalziumspiegel Ion ist ca. 2 mM und damit, die Variationen der Calcium-Ionen-Konzentration auf die extrazellulären und intrazellulären Ebene auftreten. Darüber hinaus synchronisiert den letzten Studien belegen, dass intrazellulären Calcium-Ion Signalisierung Ereignisse und neuronaler Aktivität kann auftreten, unter den Bedingungen des lokalen Schwankungen der extrazelluläre Kalzium Ionen-Konzentrationen, was die Bedeutung von Intra- und extrazellulären Calcium Ionen-Variationen¹⁰.

Mit dem Ziel zu verstehen, das Zusammenspiel von Calcium-Ionen und biologischen Membranen, einen synthetischen Ansatz in dem native Zellmembranen mit Lipid Bilayer Vesikel ersetzt werden ist erfolgreich umgesetzt worden. Verfügbarmachen von Vesikeln zu Kalzium Ionen-Lösungen führt zu Veränderungen in Lipid Kopfgruppen und Kohlenwasserstoff-Kette-Verpackung, erhöhte Membran Spannung und Vesikel Aggregation sowie die Trennung von Lipiden und Membran Phase Übergang^{11,12 ,13,14,15,16}. Die Eigenschaften der Lipidmembranen auf Einwirkung von Kalzium-Ionen wurden untersucht mit solchen experimentelle Techniken wie x-ray, ¹H-NMR und spektroskopische oder thermodynamische Studien^{11,16, 17 , 18}. in diesen Studien, die Zusammensetzung der Membran ist oft um native Zellmembranen ähneln abgestimmt und enthält solche physiologische Lipide als Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamine (PE) und Phosphatidylserin (PS). PS ist besonders wichtig in künstliche Vesikel Vorbereitung, denn das ist ein wesentlicher Bestandteil in vielen zellulären Prozessen einschließlich Menschenhandel intrazellulären Membran, Exozytose und Apoptose^19,20.

Die Größe der synthetisierten Lipid Vesicles reicht oft von Nanometer bis mehrere Mikrometer. Unter den verschiedenen Vesikel Vorbereitungen, giant Unilamellar Vesikeln (GUVs), die sind mehrere bis zu zehn Mikrometer im Durchmesser, sind von besonderer Bedeutung aufgrund ihrer relativ großen Größe stark ähnelten die Abmessungen der einzelnen Zellen^{21 , 22 , 23}. die verfügbare Fläche des die GUVs ermöglicht den Effekt von lokalen chemischen Gradienten auf Membran biophysikalische Eigenschaften untersucht werden. Indem man nur ein Teil der Membranoberfläche auf äußere Reize, können die Membran Dynamik genauer untersucht werden. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass lokalisierte Anwendung von chemischen oder pH-Gradienten an der Oberfläche der GUVs führt zur Bildung von röhrenförmigen Vorsprünge, die Masse Exposition^24,25nicht eingehalten wurden. Die beobachteten Unterschiede im Verhalten der Membran fordern weitere Methodenentwicklung Single-Vesikel Verhör Regelungen einige Einblicke in die Mechanismen der Zellmembran Umgestaltung.

Aufbauend auf den Methoden der Mikroinjektion und Mikromanipulation aus den frühen 1900er Jahren^26,27, im Zusammenhang mit neueren Entwicklungen von Single-Vesikel Manipulation Aktionen in den 2000er Jahren^23,28 , dieser Artikel stellt einen Ansatz in die Membran umgestaltet und die Bildung von Membran röhrenförmige Ausstülpungen (MTP) in der GUV-Membran als Reaktion auf lokale Anwendung von Calcium-Ionen entstehen.

Unser Ansatz nutzt eine Vesikel Komplex bestehend aus einer GUV, verbunden mit einem multilamellar Vesikel (MLV) als Modellsystem biomimetische Membran (Abbildung 1A). Der MLV wird als ein Lipid-Reservoir für den Komplex, Lipid-Material für die GUV während der Exposition gegenüber einer Kalzium-Ionen Steigung zu liefern. Diese Verbindung ermöglicht die Anlage zum Ausgleich für die Erhöhung der Membran Spannung während induzierte Umbau und gestalten den Übergang von der GUV-Membran und Lipide für MTP Wachstum. Darüber hinaus ermöglicht der MLV Oberfläche Immobilisierung, weil seine Masse größer ist im Vergleich zu derjenigen der GUV. Die GUV-MLV-komplexe, wenn auf ein festes Substrat immobilisiert haben früher für die Herstellung Nanotube-Vesikel Netzwerke, Studium Polymermembran Interaktion und imitiert die späten Stadien der Exozytose^{29,30, 31,32,33}.

Frühere Protokolle verwendet Sojabohnen polare Lipid-Extrakt (SPE), GUV-MLV komplexe²⁸vorzubereiten. Die SPE besteht aus einer Mischung von Phospholipiden, die umfassen PC (45,7 %), PE (22,1 %), Phosphatidylinositol (PI, 18,4 %), phosphatidic Säure (PA, 6,9 %) und eine Mischung aus anderen Lipiden (6,9 %). In unserem Protokoll hierin ist die SPE-Mischung mit 20 % des 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (Natriumsalz) dotiert (DOPS) um die innere Broschüre der Plasmamembran der Zelle zu imitieren. Zusätzliche 1 % von ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-SCHMIERE) wird verwendet, um Lipid Bilayer zu ermöglichen eine Überwachung der Membran Umbau mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu beflecken. Die GUVs haben symmetrische lipidzusammensetzung über die Bilayer und lokal 5 mM Konzentrationen von Kalzium-Chlorid (CaCl₂) ausgesetzt sind. Diese experimentellen Bedingungen, mit einer erhöhten Kalzium-Ionen-Konzentration auch imitieren die Außenmembran Broschüre der Apoptotic Zellen, wo die PS-Moleküle ausgedrückt³⁴sind. Die Bildung der GUV-MLV komplexe erfordert die Verwendung einer modifizierten Rehydration-Dehydratisierung-Methode ursprünglich entwickelt von Criado und Keller³⁵. Die Vesikel Vorbereitung Protokoll beinhaltet die Bildung von einem trockenen Lipidschicht, die dann verwendet wird, um kleine Bläschen in Lösung zu bilden. Diese Lösung ist dann dehydriert und rehydriert um die endgültige GUV-MLV-komplexe bilden. Abbildung 2A -D zeigt die wichtigsten Schritte für die Vorbereitung eines typischen GUV-MLV-Komplexes.

Nachdem die Vesikel Vorbereitung abgeschlossen ist und die Vesikel Komplex auf dem Glassubstrat immobilisiert ist, wird die Mikroinjektion Technik verwendet, um kleine Mengen von Calcium-Ionen an der äußeren Broschüre GUV durch eine offene Spitze Glas Mikropipette liefern. Der Fluss der Kalzium-Lösung aus der Spitze erzeugt eine lokalisierte Kalzium Ionen-Gradient an der GUV Membranoberfläche, Membran umgestaltet und die MTP-Generation führt. Die MTP orientieren sich weg von der Kalzium-Ionen-Quelle und wachsen innerhalb der GUV. Diese MTP-Formation kann direkt mit Fluoreszenz-Mikroskopie überwacht werden und mit einer Digitalkamera aufgenommen. Abbildung 3 zeigt den Versuchsaufbau zur Herstellung der Membran Umbau verwendet. Die Bildung von MTP (Abb. 2E und Abbildung 4) in diesem Protokoll zeigt ein kontrastierendes Ergebnis Kalzium Ion Belichtung Experimente in loser Schüttung Volumen Bedingungen durchgeführt. Bedingungen der Masse die GUVs Bruch und Membran-Patches, die beobachtet werden können, zur Einhaltung der Glas Oberfläche²⁵bilden.

Weitere Einzelheiten über die Bildung der GUV-MLV-komplexe, sowie das Verfahren der Mikroinjektion von Calcium-Ionen durchführen, werden in diesem Artikel erläutert. Die Protokolle sind weitgehend auf Kalzium-Ionen Mikroinjektion konzentriert; Dieser Ansatz kann jedoch leicht für den Einsatz im Studium der Membran Reaktionen aufgrund der lokalen Exposition gegenüber anderen Ionen oder Proteine geändert werden. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung der Vesikel abgestimmt werden, um die Lipid-Komponente-Rollen bei der Umgestaltung der Membran zu isolieren. Die vorgestellte Protokoll erfordert keiner hoch entwickelten Geräten, die GUV-MLV-komplexe zu produzieren und zeichnet sich durch ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit.

Protokoll

1. Vorbereitung des kleinen Lipid Vesicles

1. Bereiten Sie eine Lösung von Lipiden SPE/DOP/ATTO488-SCHMIERE in Chloroform mit einer Masse Mischungsverhältnis von 79/20/1.The endgültige Konzentration von Lipiden in Chloroform ist 1 mg/mL, und die endgültige Masse beträgt 0,6 mg (in der Regel weniger als 1 mg). Verwenden Sie Einweg-Runde Unterseite Glasfläschchen (Rundrohre unten Glas, 10 x 75 mm), wenn die Lipid-Lösung ohne Vorreinigung Schritt vorbereiten.
   1. Füllen Sie und spülen Sie die Glas Spritzen (25 µL) mit Chloroform mindestens 5 Mal vor Gebrauch. Zu füllen und spülen die Glasspritze mindestens 5 mal 3-4 mL Chloroform ist ausreichend.
      Achtung: Wenn Umgang mit Chloroform, verwenden Glas Spritzen und führen Sie die Verfahren in einer Abzugshaube mit entsprechenden Handschuhen und Schutzbrille zu allen Zeiten. Verwenden Sie Kunststoff Flaschen, Spritzen, Pipetten oder nicht, beim Umgang mit Chloroform.
2. Wickeln Sie die Glasfläschchen mit der Lipid-Mischung mit Metallfolie schützen den Inhalt vor Licht und Verdampfen des Lösungsmittels in einen drehverdampfer für 3 h, Chloroform, mit dem Druck erreichen 7 kPa Vakuum bei 80 u/min zu entfernen. Ein trockene Lipid-Film wird am unteren Rand des Glases nach Verdampfung (Abbildung 2A) gebildet.
   Hinweis: Skalierung mehrmals und mit größerer Mengen von Lipiden möglicherweise länger rotary Verdunstung zur vollständigen Entfernung von Chloroform zu gewährleisten.
3. Fügen Sie langsam 600 µL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Pufferlösung (pH 7,8, ohne Verdünnung) auf die getrockneten Lipid-Film. Fügen Sie nach der Zugabe des Puffers sanft 6 µL des Glycerins, die Probe von kompletten Austrocknung während der GUV-MLV Bildung Schritte (erreichen eine Endkonzentration von Glycerin von 1 Gew.-%)³⁶zu schützen hinzu. Versiegeln Sie die Glasfläschchen mit Parafilm und Abdeckung mit Metallfolie vor Licht zu schützen. Über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C aufbewahren.
   Hinweis: Die PBS-Puffer-Lösung besteht aus 0,151 g der Trizma Basis, 1,592 g K₃PO₄1,021 g KH₂PO₄, 0,062 g MgSO₄ ·7H₂O und 0,0465 g EDTA in 250 mL gereinigtes Wasser. Die Lösung bei 4 ° C zu speichern, und warm auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch. Der Gegenwert von 10 mM HEPES Buffer kann anstelle von PBS-Lösung verwendet werden. Die HEPES-Puffer-Lösung wird durch eine 1 M HEPES Stammlösung mit gereinigtem Wasser verdünnen vorbereitet.
4. Beschallen Sie am nächsten Tag die Glasfläschchen mit Lösung für 1 min mit einem Ultraschall-Bad bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Parafilm und pipette bis eine optisch einheitliche Lösung von kleinen Lipid Vesikel gebildet wird (Abb. 2 b). Aliquoten 30 µL der erhaltenen kleinen Lipid Vesikel Lösung in einzelnen 0,5 mL Kunststoffrohre. Halten Sie diese Lager Aliquote bei-18 ° C für maximal 6 Monate.
   Hinweis: Wenn die kleine Lipid Vesikel Lösung nicht optisch einheitliche, Wirbel die Lösung 4 Mal für 1-2 s mit einem Vortex-Mixer mit maximaler Geschwindigkeit.

2. Vorbereitung des GUV-MLV-komplexe

1. Tauen Sie auf Raumtemperatur ein Kunststoffrohr mit einer Teilprobe der gefrorenen Aussetzung der kleinen Lipid Vesicles. Wirbel der Röhre 4 Mal für 1-2 s mit einem Vortex-Mixer mit maximaler Geschwindigkeit.
2. Platz 5 µL der kleinen Lipid Vesikel Suspension auf die Oberfläche von einem Glas Deckglas (24 x 60 mm), bilden eine kleine Runde Tropfen. Verwenden Sie ein Glas Deckglas ohne Vorreinigung Schritte.
3. Legen Sie das Glas Deckglas in ein Vakuum Exsikkator (< 100 kPa Vakuum) für 20 Minuten.
4. Speichern Sie die getrockneten Lipid-Film bei Raumtemperatur für 4 min, dann langsam pipette 50 µL 10 mM HEPES-Puffer auf die trockenen Lipid-Film für Rehydrierung. Warten Sie 5 min um die GUV-MLV-komplexe (Abbildung 2) Praegen.
5. Zentrieren Sie eine Glas-Deckglas auf den Mikroskoptisch dann pipette 300 µL HEPES-Puffer auf und positionieren Sie das Zentrum der Tropfen über das Ziel (Abb. 3 b).
6. Die 50 µL der vorgeformten GUV-MLV-Lösung in die HEPES-Lösung (300 µL) übertragen. Warten Sie 25 min zu dünn gebildeten GUV-MLV komplexe fest an der Oberfläche des Deckglases Glas (Bild 2D) halten zu lassen.
   Hinweis: Gelegentlich die GUV-MLV-komplexe bilden nicht auf das Glas-Deckglas und stattdessen Lipid-Patches oder nur MLV beobachtet. Dies lässt sich durch versehentliche Schütteln der Probe während der Schritte 2.4 oder 2.6 oder zahlreiche Gefrier-tau-Zyklen der kleine Vesikel Suspension. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.6 oder verwenden Sie frisch zubereitete Lipid-Stammlösung (Schritt 1.1), um die GUV-MLV-komplexe zu erhalten.

(3) Mikropipette Vorbereitung und Mikroinjektion

1. Rund um die Kanten der Borosilikatglas Kapillaren durch sanftes Auflegen der Kapillare endet in die Flamme einer Kerze zu verhindern, dass die Mikropipette beim Anhängen an die Mikropipette Halter gebrochen.
2. Ziehen Sie mindestens 3 Glaskapillaren mit eine automatische Laser-Abzieher mit dem Programm-Set: Wärme = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Hitze = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Die Programm-Set ist mit dem ersten Wert des Pul leer gelassen einzutragen. Borosilikatglas Kapillaren der Innendurchmesser (ID) mit 1,00 mm und Außendurchmesser (O.D) 0,78 mm führt zu einer Mikropipette mit einer Tipp-Öffnung von etwa 0,3 µm im Durchmesser.
3. Rücken-Füllung jedes Mikropipette mit 8 µL 5 mM CaCl₂ -Lösung in HEPES-Puffer (10 mM) mit einem Microloader. Filtern Sie die CaCl₂ -Lösung mit einer 0,2-0,5 µm Spritze Filter vor der Verwendung zur Vermeidung von Verstopfungen der Pipettenspitze.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass CaCl₂ vollständig in der Pufferlösung HEPES gelöst ist, die auch für Schritte 2.4-2.6 verwendet wird.
4. Verbinden eines Mikropipette Halters mit einem Mikromanipulator. Montieren Sie die Mikropipette in die Mikropipette Halterung fest. Anschließen Sie Einspritzpumpe und Kapillare Halter mit der Zuleitung.
5. Starten Sie die Einspritzpumpe. Passen Sie die Einstellungen auf der Einspritzpumpe bis 20 hPa (Einspritzdruck) und einem 5 hPa Entschädigung Druck auf Automatikbetrieb. Halten Sie die Einspritzpumpe, bis die Mikropipette für die Mikroinjektion bereit ist.
6. Legen Sie das Mikroskop auf Hellfeld-Modus. Konfigurieren Sie es für differential Interferenz-Kontrast (DIC). Verwenden Sie 63 X oder 100 X hohe NA (1.3) Ziele, um die optimale Membran Rand Auflösung zu erreichen.
7. Verwenden Sie die groben Mikromanipulator, um Mikropipette oberhalb des tröpfchens mit den GUV-MLV-komplexe zu positionieren. Suchen Sie die Spitze des Mikropipette über das Ziel.
8. Das Mikroskop auf dem Mittelpunkt des GUV-MLV-Komplexes zu konzentrieren und dann ca. 50 µm über die GUV zu konzentrieren. Verwenden Sie den groben Modus von der Mikromanipulator, sanft die Mikropipette in den Fokus bringen.
9. Wechseln Sie der Mikromanipulator in den feinen Modus. Langsam an die GUV-Oberfläche beim Übersetzen der Mikropipette Spitze nach unten und halten die Spitze im Fokus zu konzentrieren. Positionieren Sie die Mikropipette Spitze ca. 20 µm von der GUV-Oberfläche. Tauschen sie die Mikropipette Spitze gebrochen durch versehentlichen Kontakt mit dem Glas-Deckglas (Beispiel in Abb. 5 b) ist, sofort um unnötige Kalzium Ionen-Freisetzung in loser Schüttung Beispiellösung zu vermeiden.

4. Bildung und Übersetzung von MTP mit Calcium-Ionen-Quelle

1. Das Mikroskop in Fluoreszenz-Modus gesetzt. Setzen Dichroics auf 488 begeistern nm und die Emission bei 505-550 nm zu erkennen.
2. Einschalten der Einspritzpumpe und die Kalzium-Ionen-Injektion. Verwenden Sie den feinen Modus der Mikromanipulator, und nähern Sie sich langsam der GUV mit der Mikropipette Spitze. Positionieren Sie die Mikropipette Spitze in einer Entfernung von 3 µm von der Membranoberfläche während der Injektion der CaCl₂ -Lösung aus der Mikropipette MTP zu bilden (Abbildung 4) zu ermöglichen.
3. Um die MTP entlang der GUV-Oberfläche zu übersetzen, bewegen Sie langsam die PIPETTENSPITZE (mit einer Geschwindigkeit von 0,1-0,3 µm/s) rund um die GUV Oberfläche mit feinen Mikromanipulator (Abbildung 6). Pflegen Sie ungefähr im gleichen Abstand (3 µm) zwischen der GUV-Oberfläche und die Mikropipette Spitze gleichzeitig die Kalzium-Ionen-Injektion.
   Hinweis: Bei hohen Umrechnungskurse der Mikropipette Spitze (über 0,7 µm/s), werden die MTP nicht synchron mit der Mikropipette migriert. Stattdessen werden sie zerstreuen und zu verkürzen, während neue MTP am neuen Standort der Mikropipette Spitze (Abbildung 7) gebildet werden.
4. Um die Mikroinjektion zu stoppen, schalten Sie die Einspritzpumpe und bewegen Sie die Mikropipette Weg von der GUV-Oberfläche zu.

Ergebnisse

In dieser Arbeit zeigen wir Ihnen die Erstellung von GUV-MLV-komplexe und wie sie verwendet werden, um die Wirkung von Kalzium-Ionen Gradienten auf Zellmembran Dynamik zu erhellen. GUV-MLV-komplexe Oberfläche befestigt werden benötigt für diese Experimente, um eine feste Zelle Größe Mimik beim Aufbau einer Ionen-Steigung durch Mikroinjektion zu ermöglichen. Die GUV-Membran reagiert auf lokalisierte Calcium-Konzentration durch Bildung von MTP unter der Regie von Kalzium-Ionen-Quelle. Darüber hinaus können die MTP um die GUV berührungslos übersetzt werden durch Verschieben der Mikropipette Spitze auf der Membranoberfläche.

Eine schematische Darstellung des Verfahrens GUV-MLV Vorbereitung ist in Abbildung 2dargestellt. Obwohl in dem vorgestellten Protokoll die GUV-MLV komplexe bereits während Schritt 2.4 (Abbildung 2) vorab gebildet werden, ermöglicht dünn gebildeten GUV-MLV-komplexe, die Vesikel-Lösung auf einem anderen 300 µL Tröpfchen des Puffers (Schritt 2.6 des Protokolls) übertragen halten Sie ausreichend auf dem Glassubstrat. Auf diese Weise entsteht eine geeignete Anlage für Mikromanipulation und Mikroinjektion (Abb. 2D). Gelegentlich enthalten die GUVs einem oder mehreren eingeschlossenen Lipid Vesikel, welche nicht die MTP-Formation, wie in Abbildung 4Adargestellt. Diese GUVs produzieren MTP; die Bildgebung kann jedoch behindert werden, wenn die eingeschlossenen Bläschen groß sind. Der Großteil der vorbereiteten GUVs (bis zu 75 %) erscheinen halbkugelförmigen und sind an die MLV, wie in Figur 1Adargestellt. Diese Bläschen bilden den Schwerpunkt dieses Protokolls und eignen sich für die Mikroinjektion Verfahren. Etwa 25 % der verbleibenden GUVs erscheinen wellige (Abbildung 1 b), das ist bezeichnend für eine untere Membran Spannung Regelung. Diese hügelige Vesikel ermöglichen auch die Bildung von den röhrenförmigen Vorsprünge; Sie weisen jedoch unterschiedliche Kinetik und ein unterschiedlicher Morphologie der gebildeten MTP, die außerhalb des Rahmens dieses Protokoll²⁵ist. Der typische Durchmesser der vorbereiteten Vesikel variiert zwischen 2 bis 15 µm für die MLV und zwischen 2 bis 40 µm für die GUVs. Die optimale GUV Größe für die Exposition gegenüber Kalzium-Ionen 5 µm ist oder größer.

Mikropipetten wurden in Einzel-Zelle Verhör Schemata sowie in Verfahren, die Manipulation von synthetischen GUVs für mehrere Jahrzehnte^37,38verwendet. Die meisten dieser Anwendungen beteiligt direkten physischen Kontakt zwischen der Mikropipette und der Oberfläche von Zellen oder Bläschen. Beispiele sind die Patch-Clamp-Technik oder Membran Leinen aus der GUV-Membran, neben dem Bau Nanotube-Vesikel Netzwerke^23,28,39ziehen. Vor kurzem wurden Mikropipetten auch zur lokalisierte Gradienten von Ionen und Moleküle um GUVs, heterogene Zelle Mikroumgebungen^24,25rekonstruieren zu generieren. Im vorliegenden Protokoll ist eine gut funktionierende Mikropipette (Abb. 5A) ein entscheidender Faktor für den Aufbau einer Kalzium Ionen Steigung an der GUV-Oberfläche durch die Freigabe der Lösung enthaltenen. Korrekte Positionierung der Mikropipette an der GUV-Oberfläche und Vermeidung des Kontakts mit der Lipidmembran sind unerlässlich für die erfolgreiche Mikroinjektion. Die Mikropipette Spitze gehalten wird in einem Abstand von ca. 3 µm aus der GUV-Oberfläche, das eine optimale Entfernung zum MTP generieren und Variationen von Kalzium in der Nähe der Zellmembran imitiert wird. Wenn die Mikropipette Spitze versehentlich unterbrochen (Abb. 5 b), ist ein Ersatz erforderlich. Das zuvor getestete Konzentration Palette von CaCl₂ innerhalb der Mikropipette, die die MTP-Bildung ermöglicht, ist zwischen 2 und 5 mM²⁵, das extrazelluläre Kalzium-Konzentration entspricht. Bei niedrigeren CaCl₂ Konzentrationen, d. h., 1 mM sind keine MTP beobachtet.

Die Bildung von MTP auf Kalzium-Mikroinjektion beginnt mit der Bildung von kleinen Membrane Invaginations, die MTP auf dem Gelände der Ausstellung (Abbildung 4 b) hineinwachsen. Die MTP weiter wachsen, solange bleibt die GUV-Membran, die Kalzium-Ionen ausgesetzt. Sie schwanken und Weg von der Kalzium-Ionen-Quelle (Abbildung 4, ergänzende Film 1) zeigen. Nach Beendigung die Kalzium-Ionen Versorgung streuen die MTP über die GUV-Oberfläche macht es schwierig, fest, ob die MTP bleiben oder verschwinden.

Die Bildung von MTP lässt sich durch lokalisierte Calcium-Ion Bindung an die exponierten äußeren Broschüre GUV-Membran und Auslösung spontane Krümmung (m), die direkt zugeordnet ist die Bildung von spontanen Spannung σ = 2κm² (Κ ist die Biegesteifigkeit), induzieren, die Biegung der Membran und bilden nach innen MTP. Frühere Berichten haben gezeigt, dass die Verformung der Membran erklärt durch Kondensation und/oder clustering der negativ geladenen Lipide bei der Bindung von Calcium-Ionen die Membran, was zu negativen spontane Krümmung⁴⁰sein kann. Alternativ neutralisiert die starke Bindung von Ca^{2 +} auf die Oberfläche des negativ geladenen Bilayer die oberflächenladungsdichte exponierten Lipid Bilayer-Merkblatt. Dies führt zu der Ladungsdichte Unterschied über Bilayer, wodurch ungleich NULL spontane Krümmung, ausreichen, um die Membran²⁵biegen.

Die beobachteten Bildung von MTP zeigt eine Empfindlichkeit der Lipidmembranen, Calcium-Ionen und bietet einen neuartigen kontaktlosen Ansatz zur Herstellung von röhrenförmigen membranstrukturen. Aufklärung der Herkunft kann von dieser Membran Schlauchbildung wichtig für das Verständnis der Dynamik der Membran Form Umstellung bei verschiedenen Zellfunktionen und Neugestaltung der Zelle und kann hilfreich sein für Einblicke in Lipid-Organisation innerhalb der Zelle Membranen.

Die beobachteten MTP entstehen immer an der Stelle auf der Membran, die Kalzium-Ionen Exposition unterziehen. Durch die Wahl des Standortes der Mikropipette Spitze, ist es so möglich, den Bereich der GUV-Oberfläche für das Wachstum des Vorsprungs zu definieren. Weiter, wenn die Mikropipette langsam ist (0,1-0,3 µm/s) bewegt die GUV-Oberfläche, unter Beibehaltung der Trennungsabstand aus der Membran der MTP im Tandem mit der Mikropipette übersetzt sind. Abbildung 6 und das entsprechende ergänzende Movie 2 zeigen eine solche Migration von MTP um die GUV-Oberfläche. Dieser Prozess wird voraussichtlich durch die Bildung von neuen MTP auf kontinuierliche Kalzium Ionen-Injektion²⁵begleitet werden. Bei hohen Übersetzungskosten (über 0,7 µm/s) können die MTP nicht Mikropipette Spitze folgen. Stattdessen bilden sich neue Vorsprünge am neuen Standort der Mikropipette Spitze (Abbildung 7).

Die beobachteten kontaktlose Kalzium Ionen-geführte Übersetzung von MTP um die GUV Oberfläche Dose weiter unser Verständnis der treibenden hinter der Dynamik der Membran röhrenförmigen Strukturen innerhalb der Zellen Kräfte. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz einen neuartige kontaktlosen Modus für den Transport von Material in weicher Materie Systeme mithilfe von chemischen Gradienten zu kontrollieren.

Abbildung 1 : Repräsentative Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder der GUV-MLV-komplexe, die auf der Oberfläche von einem Glas Deckglas immobilisiert. (A). Beispiel für eine kugelförmige GUV. Die GUV erscheint in Form einer Halbkugel an der MLV befestigt. (B). Beispiel für eine wellige GUV. Die schwarzen Pfeile zeigen die verformten Bereiche der Membran. Die Bilder sind erweitert und umgekehrt um die Visualisierung der Gewebekulturen beschrifteten GUV Membranen zu verbessern. Der Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Schematische Abbildungen von der GUV-MLV-Vorbereitung und die Mikroinjektion. (A). eine trockene Lipidschicht entsteht an der Unterseite des Glases durch den rotierenden Verdampfung von Chloroform aus der Lipid-Lösung. (B). eingeweichtes Lipidschicht beschallt und kleine Lipid Bläschen gebildet werden. (C). ein kleines Tröpfchen der Vesikel-Lösung (5 µL) wird auf der Oberfläche von einem Glas Deckglas gelegt und übertragen in den Exsikkator gestellt für 20 min die Lipid-Lösung zu entwässern und bilden einen trockenen Lipid-Film (dieser Schritt wird nicht angezeigt). Rehydration der trockenen Lipid-Film mit 50 µL Pufferlösung produziert die vorgeformten GUV-MLV-komplexe. (D). die Übertragung der vorgeformten komplexe auf ein größeres Volumen des Puffers führt zur Bildung von dünn getrennt GUV-MLV an der Oberfläche des Deckglases Glas befestigt. (E). die Mikropipette nahe der Oberfläche der GUV Positionierung und Freigabe der Calcium-Ionen löst die Bildung von MTP. Die Illustrationen stammen nicht maßstabsgetreu. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Versuchsaufbau für die Mikroinjektion von Kalziumionen. (A). die Komponenten des experimentellen Aufbaus benötigt, um die MTP in die GUVs generieren. (B). Details der Mikroinjektion Setup. Die Glas-Deckglas mit der Lösung der GUV-MLV komplexe auf den Mikroskoptisch gelegt. Der Winkel zwischen der Mikropipette und die Oberfläche des Deckglases Glas beträgt 30° (weiß markiert). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Bildung von MTP bei der Mikroinjektion von Calcium-Ionen an der Oberfläche der GUV. (A). die GUV-MLV Komplex vor der Exposition gegenüber einem Kalzium Ionen-Gradient. Der Pfeil zeigt eine Lipid-Vesikel eingeschlossen innerhalb der GUV und die Beobachtung des MTP. (B) nicht behindert. Bei der Mikroinjektion von Calcium-Ionen (5 mM Konzentration von CaCl₂ in die Mikropipette) sind kleine MTP gebildet. (C). Wachstum der MTP bei kontinuierlichen Kontakt mit Calcium-Ionen. Die Fluoreszenzbilder sind verstärkt und invertiert für Visualisierung. Der Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Glas Mikropipetten für Calcium-Ionen Mikroinjektion verwendet. (A). ein Beispiel für eine gut funktionierende Mikropipette. (B). ein Beispiel für eine mikropipette, die einen gebrochenen Tipp hat (der beschädigte Bereich ist mit einem schwarzen Pfeil gekennzeichnet). Beide Bilder sind verstärkt und zur besseren Visualisierung invertiert. Der Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Calcium Ionen-geführte Übersetzung von MTP um die Oberfläche der GUV. (A). die MTP bilden sich an der Oberfläche der GUV nach Mikroinjektion von 5 mM CaCl₂ -Lösung. (B-C). Übersetzung der Mikropipette Spitze (0,2-0,3 µm/s) rund um die Membran Oberfläche löst die Bewegung der MTP in die Richtung der Kalzium-Ionen-Quelle. Die schwarzen Pfeile markieren die Bewegungsrichtung der Mikropipette. Die Bilder sind verstärkt und zur Verbesserung der Membran Visualisierung invertiert. Der Maßstabsbalken entspricht 5 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 : MTP bei hohen Umrechnungskurs der Mikropipette Spitze. (A). die MTP bilden sich an der GUV-Oberfläche auf der Mikroinjektion von 5 mM CaCl₂ -Lösung (weiße Linie). (B-C). Einen hohen Umrechnungskurs der Mikropipette um die GUV-Oberfläche (1 μm/s) führt zur Bildung von neuen MTP am neuen Standort der Mikropipette Spitze (magentafarbene Linie), sowie Streuung von der zuvor gebildeten MTP (weiße Linie). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1: Bildung von MTP in GUV auf lokalisierte Exposition gegenüber der Zertifizierungsstelle ^{2 +} Farbverlauf. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterladen. 

Ergänzende Film 2: Kalzium Ionen-geführte MTP Migration um die GUV Oberfläche.   Klicken Sie bitte hier, um diesen Film downloaden. 

Diskussion

Biomimetische Zellsysteme ermöglichen das Studium der Membran Verhalten nach der Exposition auf äußere Reize wie Ionen, Proteine oder Nanopartikel. GUVs, wird ein solches Modell können auf Veränderungen in der chemischen Umgebung reagieren, durch die Anpassung ihrer Form, die oft mit der Bildung von röhrenförmigen Strukturen und Invaginations^24,41,42,43 .

Dieser Artikel bietet einen Ansatz zur MTP berührungslos über Umgestaltung der GUV Oberfläche nach lokalisierte Einspritzung von Calcium-Ionen an der GUV-Oberfläche zu erzeugen. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung des GUV-MLV-komplexes, die eine Zelle Plasmamembran sowie imitiert, wie eine Mikroinjektion Technik, Kalzium zu generieren beschäftigen Ionen-Gradienten in der Nähe der GUV Form MTP Oberfläche. Die Mehrheit der bisherigen experimentellen Studien, die Kalzium-Ionen-Membran Interaktionen adressiert ausgesetzt Lipid Vesicles, bulk-Kalzium-Ionen-Konzentration^14,17. Abhängig von den experimentellen Bedingungen führen solche Massen-Exposition eine andere Membran Antwort mit röhrenförmigen Vorsprünge gebildet²⁵.

Die Bildung der GUV-MLV komplexe ist relativ einfach und erfordert nur standard Laborgeräten, z. B. einen drehverdampfer Ultraschallbad und Vakuum Exsikkator. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte zu prüfen, während der Vesikel-Vorbereitung. Es ist wichtig, damit die Austrocknung der Vesikel ist abgeschlossen (während Schritt 2.3 des Protokolls) und ein trockene Runde Lipid-Film, enthält nur eine kleine Menge von Salzkristallen wird auf der Oberfläche des Deckglases Glas gebildet. Während des Experiments sorgfältige Handhabung der Vesikel-Lösung mit frischen Lipid-Stammlösung in Chloroform sowie frische HEPES-Puffer ist entscheidend für erfolgreiche Vorbereitung der GUV-MLV komplexe. Darüber hinaus ist die sichere Befestigung des GUV-MLV Komplexes auf der Glasoberfläche Deckglas entscheidend für Mikromanipulation und Mikroinjektion. Um ausreichende Haftung der GUV-MLV bestätigen Komplex, mikropipette (ohne Injektion Strömung) lässt sich sanft gegen die GUV-Oberfläche drücken. Eine fest haftende Vesikel wird nicht entlang der Oberfläche bei direktem Körperkontakt gleiten. Da die Experimente in einem offenen Puffer Tropfen durchgeführt werden, die mehrere Stunden lang verhört werden kann, muss Verdunstung berücksichtigt werden. Verdunstung aus den Puffer Tropfen ändert die osmotischen Verhältnisse beeinflussen und die Vesikel zu destabilisieren könnte. Um die osmotischen Verhältnisse wiederherzustellen, zurückgegeben periodische Zugabe von reinem Wasser der Probe zur Wiederherstellung des ursprünglichen Volumens an Homöostase.

Wenn Sie die Lipid-Membran-Zusammensetzung zu ändern, ist es entscheidend, dass die Vesikel in Form einer GUV-MLV-Anlage produziert werden, weil die MLV das Lipid-Material auf die GUV übertragen ermöglicht, während die Membran Umgestaltung. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bestandteile der SPE-Mischung mit reinen Lipiden ersetzen oder Zugabe von 5-30 % des Cholesterins, auch für GUV-MLV Komplexbildung^{28,44 ermöglicht}. Der Großteil der vorbereiteten GUVs sind Unilamellar⁴⁵.

Darüber hinaus hängt beim Testen von anderen zweiwertigen kationen wie Magnesium-Ionen, die Bildung der MTP das Vorhandensein von negativ geladenen DOPS in der Lipid-Mischung. Ohne DOPS bilden die MTP nicht in den Vesikeln, die in diesem Protokoll beschrieben. Monovalente kationen, wie Kalium und Natrium, auch führen nicht bei der Bildung von MTP, sogar in DOPS-haltige Vesikel²⁵.

Neben der kritischen Schritte im Hinblick auf die Erstellung und Manipulation von der GUVs gibt es mehrere wichtige Faktoren zu berücksichtigen bei der Mikroinjektion. Die erfolgreiche Mikroinjektion von Calcium-Ionen stützt sich stark auf einwandfrei Glas Mikropipetten, die am Tag des Experiments zubereitet werden. Es gibt mehrere Faktoren, die die Mikropipette zu Fehlfunktionen führen können. Eine häufige Ursache ist eine verstopfte Tipp-Öffnung. Kleinen Lipid Partikel, die Nebenprodukte der Vesikel-Vorbereitung sind, sind in der Lösung verteilt und zur Einhaltung der Mikropipette Spitze, dadurch erzeugt eine Verstopfung neigen. Die PIPETTENSPITZE Reinigung erfolgt am besten durch Anheben der Vesikel-Lösung und stellen Sie es wieder in der Nähe der GUV-Oberfläche. Die Nutzung der Blow-Out-Funktion der Mikroinjektion Pumpe muss vermieden werden, da es zu massiven Einspritzung von Calcium-Ionen in die Masse Lösung führt. Darüber hinaus zu verhindern, dass kleine Luftblasen eingeschlossen innerhalb der Mikropipette richtige Mikroinjektion, in dem Fall die Mikropipette durch einen neuen ersetzt werden sollte. Tipp Bruch kann deutlich minimiert werden, indem der Versuchsaufbau auf einer Schwingungsdämpfung Tabelle Tipp Schwingungen zu minimieren.

Darüber hinaus muss sorgfältig getroffen werden, bei der Wahl einer Beobachtung Schema Immunofluoreszenz zu minimieren, während die besten Zeitaufgelöste Bilder zu erhalten. Weitfeld-laserinduzierter Fluoreszenz-Mikroskopie wurde in dieses Protokoll eingesetzt, weil es eine relativ hohe Bild-Erfassungsrate auf einer objektiven begrenzt Sonde Tiefe ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Nutzung der invertierten Mikroskopie für gleichzeitige Mikroinjektion und Beobachtung der Lipid-Vesikeln und MTP.

Eine der wichtigsten Einschränkungen der vorgestellten Methode ist das Erfordernis der umfangreichen Handarbeit und ausreichende Kenntnisse der Mikromanipulation. Da die komplexe durch einen spontanen Schwellung gebildet werden, kann die Größe der GUVs und MLV gesteuert werden. Darüber hinaus erlaubt dieses Protokoll nicht um die Kontrolle über die Membran-Spannung der vorbereiteten GUV-MLV-komplexe, die möglicherweise notwendig, zusätzliche Details in Bezug auf die Membran Umbau zu sammeln. Die GUVs sind die MLV mit dem letzteren liefernden Lipid-Material für das erhebliche Wachstum des MTP in einem Ausmaß, die wäre unmöglich zu erreichen, unter Verwendung ausschließlich die Membran von der GUVs verbunden. Der MLV tragen ebenfalls zur Senkung der seitlichen Oberflächenspannung Abweichungen innerhalb der GUV-MLV komplexe⁴⁴, die die Versuche, die Spannung des vesikels mit Mikropipette Aspiration Steuern erschweren würde. Diese GUV-MLV-basiertes Modell liefert eine niedrigere Spannung, die besser die Spannung Regime in zellulären membranstrukturen verbunden mit Membran Stauseen, wie z. B. Membran Falten und Invaginations⁴⁶gefunden imitiert. Zur gleichen Zeit kann die Mikropipette streben Technik erfolgreich angewendet werden, um Membran Spannung in einzelnen GUVs kontrollieren. Zum Beispiel Angaben die Arbeit von Graber Et Al. auf die Bildung der Membran röhrenförmige Invaginations im einzelnen GUVs bei der Bindung von Calcium-Ionen an der Membran zu Bulk-Konditionen von vielfältigen Spannungen Regime⁴⁰. Schließlich erfordert der Vergleich des Verhaltens sowohl auf lokaler als auch auf Bulk Exposition gegenüber Kalzium Membran verbesserte Kontrolle über die Membran Haftung auf der Oberfläche, die über den Rahmen dieses Protokolls ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, können die vorgeschlagene Technik für kontaktlose Membran Umbau und Bildung von MTP auf lokalisierte Stimulation mit Calcium-Ionen. Zukünftige Anwendungen dieser Methode-Center auf die Übersetzung von synthetischen Vesikel-Systeme zur heimischen biologischen Membranen, wie Zelle Blebs. Die vorgeschlagene Methode kann anderen einzelligen Verhör-Programme, wie z. B. Patch-Clamp oder Mikroelektrode strommesstechnik eingearbeitet oder in Kombination mit Heizung Strategien^31,47,48lokalisiert. Testen die Wirkung anderer Ionen oder Moleküle ist unkompliziert und geht einfach die Kalzium-Ionen durch die Moleküle des Interesses zu ersetzen. Darüber hinaus können komplexe synthetische Lipid Vesicles durch Membran Funktionalisierung mit transmembranen Proteine produziert werden, die unser Verständnis über die Biophysik Zelldynamik Umformen und Zellmembran verbunden mit der lokalen sensing erweitern kann chemischen Gradienten. Nicht zuletzt, kontaktlose Stimulation der Lipidmembran zu Polymeren weicher Materie Systemen, bieten eine Basis für eine neuartige kontaktlose Manipulation Plattform übersetzt werden kann.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soy bean polar lipid extract	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	541602C	100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	840035C	1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	ATTO-TEC (Germany)	AD 488-31	1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack	Corning Incorporated (Corning, NY 14831)	99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	650498-1L-D
Rotary evaporator	Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm	KEBO lab (Sweden)	MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO	Sharlau Chemie S.A. (Spain)	P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	T-1503 2050 g
Trizma base	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	5886
MgSO4	Merck (USA)	34549-100 g
EDTA	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	H0887 Sigma
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	Z260282-1PAK	24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	631-1339
Menzel Gläzer #1, glass cover slip	VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator	Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath	Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer	Labnet International (USA)
488 nm laser line	Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes	Leica (Germany)	12847995
Inverted fluorescence microscopy system	Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)	Technologies GmbH (Thuringia, Germany)	300038
PatchStar Micromanipulator	Scientifica (Uckfield, UK)	612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.	Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)	VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller	Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet	Eppendorf (Germany)