Rimodellamento della membrana di vescicole giganti in risposta a gradienti di ioni calcio localizzata

Riepilogo

Presentiamo una tecnica di micromanipolazione senza contatto delle vescicole, usando le pendenze dello ione calcio localizzata. Microiniezione di una soluzione di ioni di calcio, in prossimità di una vescicola gigante del lipido, è utilizzato per rimodellare la membrana lipidica, con conseguente produzione di tubolari protrusioni di membrana.

Abstract

In un'ampia varietà di processi cellulari fondamentali, come il traffico di membrana e apoptosi, membrana cellulare forma transizioni si verificano in concomitanza con variazioni locali nella concentrazione di ioni calcio. I principali componenti molecolari coinvolti in questi processi sono stati identificati; Tuttavia, l'interazione specifica fra pendenze dello ione del calcio ed i lipidi nelle membrane cellulari è molto meno noto, principalmente a causa della natura complessa delle cellule biologiche e la difficoltà dei regimi di osservazione. Per colmare questa lacuna, un approccio sintetico viene implementato con successo per rivelare l'effetto localizzato di ioni calcio sulla membrana cellulare imita. Che istituisce un mimo per assomigliare le condizioni all'interno di una cella è un problema molteplice. In primo luogo, un modello adeguato biomimetici con adeguate dimensioni e composizione della membrana è necessaria per acquisire le proprietà fisiche delle cellule. In secondo luogo, un programma di installazione di micromanipolazione è necessaria per fornire una piccola quantità di ioni calcio a una posizione di particolare membrana. Infine, un regime di osservazione è necessaria per rilevare e registrare la risposta della membrana del lipido per la stimolazione esterna. Questo articolo offre un approccio biomimetico dettagliate per studiare l'interazione di membrana dello ione del calcio, dove un sistema di vescicola del lipido, costituito da una vescicola unilamellari gigante (GUV) collegata ad delle vescicole multilamellari (MLV), è esposto a un calcio localizzato sfumatura formata utilizzando un sistema di microiniezione. Le dinamiche dell'influenza ionica sulla membrana erano osservate mediante microscopia a fluorescenza e registrate a video frame rate. Come risultato la stimolazione della membrana, altamente curvo protrusioni di membrana tubolare (MTPs) formate dentro il capo, orientato dalla membrana. L'approccio descritto induce il rimodellamento della membrana del lipido e della produzione di MTP in modo interamente senza contatto e controllato. Questo approccio introduce un mezzo per affrontare i dettagli delle interazioni di membrana dello ione calcio, fornendo nuove strade per lo studio dei meccanismi di rimodellamento della membrana cellulare.

Introduzione

Il ruolo degli ioni calcio all'interno di processi biologici, in particolare il loro coinvolgimento nella segnalazione, la divisione cellulare e la fusione della membrana, è al centro di molti studi meccanicistici¹. La concentrazione di ioni di calcio intracellulare citoplasmatica è dell'ordine di 100 nM, mentre il calcio in organelli, come il reticolo endoplasmatico, vescicole secretorie e mitocondri, raggiungere livelli fino a decine di millimolars in concentrazione. Questo crea ioni calcio ripido gradiente di concentrazione ordini di grandezza attraverso le membrane intracellulari^{2,3,4,5,6,7,8 ,9}. Il livello di ioni di calcio extracellulare è di circa 2 mM e, pertanto, le variazioni della concentrazione di ioni calcio generato a livello extracellulare e intracellulare. Inoltre, recenti studi forniscono la prova quello ione calcio intracellulare segnalazione eventi e attività di un neurone può verificarsi nelle condizioni di locali fluttuazioni delle concentrazioni di ioni di calcio extracellulare, che indica l'importanza di sincronizzato intra - ed extracellulari del calcio ioni variazioni¹⁰.

Con l'obiettivo di comprendere l'interazione tra ioni di calcio e membrane biologiche, un approccio sintetico in cui native membrane cellulari vengono sostituite con vescicole bilayer del lipido è stata implementata con successo. Esponendo le vescicole a soluzioni di ioni di calcio conduce ai cambiamenti in gruppi testa del lipido e imballaggio catena dell'idrocarburo, membrana aumentata tensione e l'aggregazione della vescicola, nonché la segregazione dei lipidi e membrana fase transizione^{11,12 ,13,14,15,16}. Le proprietà delle membrane del lipido sopra l'esposizione di ioni di calcio sono state studiate utilizzando tali tecniche sperimentali come raggi x, ¹H-NMR e studi spettroscopici o termodinamica^{11,16, 17 , 18}. in questi studi, la composizione della membrana è spesso sintonizzata per assomigliare nativo delle membrane cellulari e contiene tali lipidi fisiologici come fosfatidilcolina (PC), phosphatidylethanolamine (PE) e fosfatidilserina (PS). PS è particolarmente importante nella preparazione della vescicola artificiale perché è una componente essenziale in molti processi cellulari, tra cui traffico di membrane intracellulari, esocitosi e apoptosi^19,20.

Le dimensioni delle vescicole lipidiche sintetizzato spesso variano da nanometri a parecchi micrometri. Tra le preparazioni differenti della vescicola, vescicole unilamellari gigante (GUV), che sono diverse decine di micrometri di diametro, sono di particolare importanza a causa delle dimensioni relativamente grandi, molto somiglianti le dimensioni dell'individuo cellule^{21 , 22 , 23}. la superficie disponibile del Guv consente l'effetto di gradienti chimici locali sulla proprietà biofisiche della membrana per essere studiato. Esponendo solo una parte della superficie della membrana agli stimoli esterni, è possono analizzare più da vicino le dinamiche di membrana. Ad esempio, è stato indicato che l'applicazione localizzata di gradienti chimici o pH alla superficie del Guv conduce alla formazione di sporgenze tubolari, che non sono stati osservati a massa l'esposizione^24,25. Le differenze osservate nel comportamento di membrana chiamano per ulteriore sviluppo del metodo dei regimi di singolo-vescicola interrogatorio per ottenere alcune comprensioni nei meccanismi di rimodellamento della membrana cellulare.

Basandosi su metodi di microiniezione e micromanipolazione dai primi del 1900^26,27, in relazione più recenti avanzamenti di schemi di manipolazione di singolo-vescicola dal 2000s^23,28 , questo articolo presenta un approccio in cui membrana rimodellamento e formazione di protrusioni di membrana tubolare (MTPs) nella membrana GUV vengono generati in risposta all'applicazione locale di ioni calcio.

Il nostro approccio utilizza una vescicola complessa composto da un GUV collegato ad delle vescicole multilamellari (MLV) come un sistema di modello di membrana biomimetici (Figura 1A). Il MLV è richiesto come un serbatoio di lipidi per il complesso per la fornitura di materiale lipidico per la GUV durante l'esposizione a un gradiente di ioni calcio. Questa connessione consente il complesso compensare l'aumento di tensione della membrana durante il ritocco indotta e forma la transizione della membrana GUV e fornire lipidi per crescita MTP. Inoltre, il MLV facilita l'immobilizzazione superficiale poiché la sua massa è maggiore rispetto a quella del GUV. I complessi GUV-MLV, quando immobilizzati su un substrato solido, precedentemente sono stati usati per produrre reti di nanotube-vescicola, studiando l'interazione polimero-membrana e che imita la fine delle fasi di esocitosi^{29,30, 31,32,33}.

Precedenti protocolli utilizzati Estratto di soia dei lipidi polari (SPE) per preparare GUV-MLV complessi²⁸. SPE è costituito da una miscela di fosfolipidi che includono PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatidilinositolo (PI, 18,4%), acido fosfatidico (PA, 6,9%) e una miscela di altri lipidi (6,9%). Nel nostro protocollo nel presente documento, la miscela SPE è drogata con 20% di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sale di sodio) (DOPS) per simulare l'opuscolo interno della membrana plasmatica delle cellule. Un ulteriore 1% di ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) viene utilizzato per macchiare il doppio strato lipidico per attivare il monitoraggio del rimodellamento della membrana mediante microscopia a fluorescenza. Il GUV hanno composizione lipidica simmetrica attraverso il doppio strato e localmente sono esposti a concentrazioni di 5 mM di cloruro di calcio (CaCl₂). Tali condizioni sperimentali, con una concentrazione di ioni di calcio elevato, anche imitano l'opuscolo della membrana esterna delle cellule apoptotiche, dove le molecole di PS sono espressi³⁴. La formazione dei complessi GUV-MLV richiede l'uso di un metodo di modifica per la reidratazione-disidratazione inizialmente sviluppato da Criado e Keller³⁵. Il protocollo di preparazione della vescicola include la formazione di uno strato di lipidi asciutto, che viene quindi utilizzato per formare piccole vescicole in soluzione. Questa soluzione è poi disidratata e reidratata per formare i complessi GUV-MLV finali. Figura 2A -D illustra i passaggi principali per la preparazione di un tipico complesso di GUV-MLV.

Dopo la preparazione della vescicola è completata e la vescicola complessa è immobilizzata sul substrato di vetro, la tecnica di microiniezione viene usata per fornire piccole quantità di ioni calcio all'opuscolo esterno della GUV attraverso una micropipetta di vetro open-tip. Il flusso della soluzione di calcio dalla punta genera un gradiente di ioni calcio localizzato sulla superficie di membrana GUV, che conduce al rimodellamento della membrana e la generazione del MTPs. Il MTPs sono orientati lontano dalla sorgente di ioni di calcio e crescere all'interno del capo. Questa formazione di MTP può essere monitorata direttamente mediante microscopia a fluorescenza e registrato utilizzando una fotocamera digitale. La figura 3 Mostra l'apparato sperimentale utilizzato per produrre il rimodellamento della membrana. La formazione di MTPs (Figura 2E e Figura 4) in questo protocollo viene illustrato un risultati contrastanti a calcio ione esposizione esperimenti eseguiti in condizioni di traffico di massa. In condizioni di massa, il GUV rompersi e formare le patch di membrana che possono essere osservate ad per aderire al vetro superficie²⁵.

Ulteriori dettagli sulla formazione di complessi GUV-MLV, nonché la procedura per eseguire la microiniezione degli ioni calcio, sono spiegati in questo articolo. I protocolli sono principalmente focalizzati su microiniezione di ioni di calcio; Tuttavia, questo approccio può essere facilmente modificato per uso nello studiare le risposte di membrana dovuto l'esposizione locale ad altri ioni o proteine. Inoltre, la composizione delle vescicole può essere sintonizzata per isolare i ruoli di componente lipidica nel processo di rimodellamento della membrana. Il protocollo presentato non richiede sofisticate attrezzature per produrre i complessi GUV-MLV ed è caratterizzato da un elevato grado di riproducibilità.

Protocollo

1. preparazione di vescicole lipidiche piccolo

1. Preparare una soluzione di lipidi SPE/DOPS/ATTO488-DOPE in cloroformio con una massa rapporto di miscelazione del 79/20/1.The finale concentrazione dei lipidi in cloroformio è 1 mg/mL, e la massa finale è di 0,6 mg (in genere meno di 1 mg). Utilizzo monouso tondo fiale di vetro di fondo (rotondo fondo tubi di vetro, 10 x 75 mm) quando si prepara la soluzione lipidica senza una fase di pre-pulizia.
   1. Riempire e sciacquare le siringhe di vetro (25 µ l) con il cloroformio, almeno 5 volte prima dell'uso. Per riempire e risciacquare la siringa di vetro almeno 5 volte, sono sufficienti 3-4 mL di cloroformio.
      Attenzione: Quando movimentazione cloroformio, utilizzare siringhe in vetro ed eseguire tutte le procedure in una cappa indossando appositi guanti e occhiali protettivi in ogni momento. Non utilizzare qualsiasi plastica flaconi, siringhe o pipette durante la manipolazione di cloroformio.
2. Avvolgere il flaconcino di vetro contenente la miscela di lipidi con lamina metallica per proteggere il contenuto dalla luce ambientale e far evaporare il solvente in un evaporatore rotante per 3 h per rimuovere il cloroformio, con la pressione raggiungendo 7 kPa vuoto a 80 giri/min. Un film asciutto del lipido è formato nella parte inferiore della fiala di vetro dopo l'evaporazione (Figura 2A).
   Nota: Scaling up diverse volte e utilizzando grandi quantità di lipidi possono richiedere più tempo di evaporazione rotativa per assicurare la completa rimozione di cloroformio.
3. Lentamente aggiungere 600 µ l di fosfato (PBS) buffer soluzione (pH 7,8, senza diluizione) tampone in cima il film lipidico secchi. In seguito all'aggiunta del buffer, delicatamente aggiungere 6 µ l di glicerolo per proteggere il campione dalla disidratazione completa durante il GUV-MLV formazione passaggi (raggiungimento di una concentrazione finale di glicerolo del 1% in peso)³⁶. Sigillare la fiala in vetro utilizzando parafilm e coprire con carta stagnola per proteggere dalla luce ambientale. Conservare in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
   Nota: La soluzione tampone PBS è costituito da 0,151 g di Trizma base, 1,592 g di K₃PO₄, 1,021 g di KH₂PO₄, 0,062 g di MgSO₄ ·7H₂O e 0,0465 g di EDTA in 250 mL di acqua purificata. Conservare la soluzione a 4 ° C e temperatura ambiente prima dell'uso. La quantità equivalente di tampone HEPES 10 mM può essere utilizzata invece di soluzione PBS. Soluzione tampone HEPES si prepara diluendo una soluzione stock di HEPES 1 M con acqua purificata.
4. Il giorno seguente, Sonicare il flaconcino di vetro contenente la soluzione per 1 min utilizzando una vasca ultrasuoni a temperatura ambiente. Rimuovere il parafilm e Pipettare fino a formare una soluzione visivamente uniforme di vescicole lipidiche piccolo (Figura 2B). Aliquotare e 30 µ l della soluzione ottenuta del lipido piccolo vescicola in tubi di plastica individuale 0,5 mL. Mantenere questi stock aliquote a-18 ° C per un massimo di 6 mesi.
   Nota: Se la soluzione di vescicola piccolo lipidica non è visivamente uniforme, vortice la soluzione 4 volte per 1-2 e utilizzando un miscelatore vortex alla massima velocità.

2. preparazione di complessi GUV-MLV

1. Scongelare a temperatura ambiente un tubo di plastica contenente un'aliquota della sospensione congelata di vescicole lipidiche piccolo. Vortice del tubo 4 volte per 1-2 e utilizzando un miscelatore vortex alla massima velocità.
2. Posto 5 µ l della sospensione del lipido piccola vescicola sulla superficie di un vetro vetrini coprioggetto (24 x 60 mm) per formare una piccola rotonda della gocciolina. Utilizzare un coprioggetto in vetro senza passaggi pre-pulizie.
3. Posizionare il vetro vetrini coprioggetto in un essiccatore sotto vuoto (< 100 kPa in depressione) per 20 min.
4. Memorizzare il film lipidico essiccati a temperatura ambiente per 4 min, poi lentamente Pipettare 50 µ l di tampone HEPES 10 mM sopra il film lipidico asciutte per la reidratazione. Attendere 5 min per pre-formare i complessi GUV-MLV (Figura 2).
5. Centro di un vetrino coprioggetto vetro sul tavolino del microscopio, poi dispensare 300 µ l di tampone HEPES su di esso e posizionare al centro della goccia sopra l'obiettivo (Figura 3B).
6. Trasferire il 50 µ l della soluzione GUV-MLV pre-formata nella soluzione HEPES (300 µ l). Aspettare 25 min per consentire scarsamente formate GUV-MLV complessi aderire saldamente alla superficie dello slittamento del coperchio di vetro (Figura 2D).
   Nota: In alcuni casi, i complessi GUV-MLV non fanno sullo slittamento del coperchio di vetro e invece si osservano dei lipidi patch o solo MLV. Questo può essere spiegato dall'agitazione accidentale del campione durante le fasi 2.4 o 2.6 o numerosi cicli di congelamento-scongelamento della sospensione piccola vescicola. Ripetere i passaggi da 2.1-2.6 o utilizzare soluzione lipidica preparata al momento (punto 1.1) per ottenere i complessi GUV-MLV.

3. micropipette preparazione e microiniezione

1. Attorno ai bordi dei capillari in vetro borosilicato inserendo delicatamente il capillare finisce nella fiamma di una candela per impedire che la micropipetta essendo rotto mentre allegarlo al titolare della micropipetta.
2. Tirare almeno 3 tubi capillari in vetro utilizzando un estrattore automatico laser utilizzando il set di programma: calore = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Calore = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. Il set di programma dovrà essere immessi con il primo valore di Pul lasciato vuoto. Utilizzando tubi capillari in vetro borosilicato di diametro interno (I.D.) 1,00 mm e risultati di 0.78 mm di diametro esterno (O.D.) in una micropipetta con un'apertura di punta di circa 0,3 µm di diametro.
3. Retro-riempimento ogni micropipetta con 8 µ l di 5 mM CaCl₂ soluzione in tampone HEPES (10 mM) utilizzando un microloader. Filtrare la soluzione di CaCl₂ utilizzando un 0.2-0.5 µm siringa filtro prima dell'uso per evitare l'intasamento della punta della pipetta.
   Nota: Assicurarsi che il CaCl₂ è completamente dissolto nella soluzione tampone HEPES, che serve anche per passaggi 2.4-2.6.
4. Collegare un titolare di una micropipetta un micromanipolatore. Montare saldamente la micropipetta nel supporto della micropipetta. Collegare la pompa di iniezione e capillare supporto utilizzando il tubo di alimentazione.
5. Avviare la pompa di iniezione. Regolare le impostazioni della pompa di iniezione a 20 hPa (pressione di iniezione) e impostare una pressione di compensazione 5 hPa, in modalità automatica. Mettere in pausa la pompa di iniezione fino a quando la micropipetta è pronta per il microinjection.
6. Impostare il microscopio a campo chiaro modalità. Configurarlo per contrasto differenziale di interferenza (DIC). Obiettivi di uso 63 X o 100 X alta NA (1.3) per ottenere la risoluzione del bordo di membrana ottimale.
7. Utilizzare il micromanipolatore grossolana per posizionare la micropipetta sopra la goccia contenente i complessi GUV-MLV. Individuare la punta della micropipetta sopra l'obiettivo.
8. Il microscopio a fuoco sul punto centrale del complesso GUV-MLV e rimettere quindi circa 50 µm sopra il capo. Utilizzare la modalità grossolana del micromanipolatore mettere delicatamente la micropipetta a fuoco.
9. Passare il micromanipolatore per la modalità fine. Refocus lentamente alla superficie GUV traducendo la punta della micropipetta verso il basso e mantenendo la punta a fuoco. Posizionare la micropipetta punta circa 20 µm dalla superficie GUV. Se la punta della micropipetta è rotta a causa di contatto accidentale con il coprioggetto di vetro (esempio in figura 5B), sostituirla immediatamente per evitare inutili calcio rilascio di ioni in soluzione di massa del campione.

4. formazione e traduzione di MTPs utilizzando la sorgente di ioni di calcio

1. Impostare il microscopio in modalità di fluorescenza. Impostare dicroici per eccitare a 488 nm e rilevare l'emissione a 505-550 nm.
2. Accendere la pompa di iniezione e avviare l'iniezione di ioni calcio. Utilizzare la modalità fine del micromanipolatore e avvicina lentamente il capo con la punta della micropipetta. Posizionare la punta della micropipetta ad una distanza di 3 µm dalla superficie della membrana durante l'iniezione della soluzione di CaCl₂ dalla micropipetta per consentire MTPs alla forma (Figura 4).
3. Per tradurre il MTPs lungo la superficie GUV, muovere lentamente la punta della pipetta (con una velocità di 0,1-0,3 µm/s) intorno il GUV in superficie utilizzando il micromanipolatore bene (Figura 6). Mantenere circa la stessa distanza (3 µm) tra la superficie del capo e la punta della micropipetta continuando l'iniezione di ioni calcio.
   Nota: Al prezzo di traduzione alta della punta della micropipetta (superiore a 0,7 µm/s), il MTPs non verranno migrati in sincronia con la micropipetta. Invece, saranno vincenti e accorciare, mentre nuove MTPs si formerà nella nuova posizione della punta della micropipetta (Figura 7).
4. Per interrompere la microiniezione, spegnere la pompa di iniezione e spostare la micropipetta lontano dalla superficie GUV.

Risultati

In questo lavoro, dimostriamo la creazione di complessi GUV-MLV e come possono essere utilizzati per delucidare l'effetto delle pendenze dello ione del calcio sulla membrana cellulare dinamica. Collegata alla superficie GUV-MLV complessi sono richiesti per questi esperimenti consentire un mimo di dimensioni cella fisso durante la creazione di un gradiente di ioni attraverso la microiniezione. La membrana GUV risponde alla concentrazione localizzata calcio attraverso la formazione di MTPs diretto lontano dalla sorgente di ioni calcio. Inoltre, il MTPs può essere tradotto in un modo senza contatto intorno il GUV spostando la punta della micropipetta intorno alla superficie di membrana.

Un'illustrazione schematica della procedura preparazione GUV-MLV è illustrato nella Figura 2. Anche se nel protocollo presentato, i complessi GUV-MLV sono già pre-formati durante passaggio 2.4 (Figura 2), trasferimento della soluzione di vescicola di un'altra goccia di 300 µ l di tampone (passo 2.6 del protocollo) permette i complessi GUV-MLV scarsamente formati a sufficientemente aderire al substrato di vetro. In questo modo, viene stabilito un complesso adatto per micromanipolazione e microiniezione (Figura 2D). Occasionalmente, il GUV contengono uno o più vescicole di lipidi intrappolata, che non influenzano la formazione di MTP, come mostrato in Figura 4A. Questi GUV produrre MTPs; Tuttavia, l'imaging può essere ostruito se le vescicole intrappolate sono grandi. La maggior parte del Guv preparati (fino al 75%) appaiono emisferica e sono attaccati al QGBT, come mostrato in Figura 1A. Queste vescicole sono l'obiettivo principale del presente protocollo e sono adatte per la procedura di microiniezione. Circa il 25% del Guv rimanenti appaiono ondulate (Figura 1B), che è indicativo di un regime di tensione della membrana inferiore. Queste vescicole ondulate consentono anche la formazione delle sporgenze tubolari; Tuttavia, essi presentano cinetiche diverse e una diversa morfologia di MTPs formata, che esula dall'ambito di questo protocollo²⁵. Il diametro tipico delle vescicole preparati varia tra 2 e 15 µm per il MLV e tra 2 a 40 µm per il GUV. Il GUV ottimale dimensione per l'esposizione a ioni calcio è 5 µm o più grandi.

Micropipette sono state utilizzate nei regimi interrogatorio singe-cellula così come nelle procedure che richiedono manipolazione di GUV sintetico per diversi decenni^37,38. La maggior parte di queste applicazioni coinvolte diretto contatto fisico tra la micropipetta e la superficie delle cellule o vescicole. Gli esempi includono la tecnica del patch-clamp o tirando pastoie di membrana dalla membrana GUV, oltre alla costruzione di reti di nanotube-vescicola^23,28,39. Recentemente, micropipette inoltre sono state usate per generare localizzate gradienti di ioni e molecole intorno GUV ricostruire eterogenee delle cellule microambienti^24,25. Nel protocollo presentato, una micropipetta correttamente funziona (Figura 5A) è un fattore cruciale per stabilire un gradiente di ioni di calcio alla superficie GUV rilasciando la soluzione contenuta all'interno. Corretto posizionamento della micropipetta alla superficie GUV ed evitando il contatto con la membrana lipidica sono essenziali per il successo microinjection. La punta della micropipetta è tenuta a una distanza di circa 3 µm dalla superficie del capo, che è una distanza ottimale per generare MTPs mentre che imita variazioni di calcio vicino alla membrana cellulare. Se la punta della micropipetta è accidentalmente rotto (figura 5B), una sostituzione è necessaria. La concentrazione precedentemente sperimentata gamma di CaCl₂ all'interno della micropipetta, che permette la formazione di MTP, è compreso tra 2 e 5 mM²⁵, che corrisponde a concentrazioni di calcio extracellulare. Alle concentrazioni più basse di₂ CaCl, vale a dire, 1 mM, nessun MTPs sono osservate.

La formazione di MTPs sulla microiniezione di calcio comincia con la formazione di invaginations piccola membrana, che crescono in MTPs presso il sito dell'esposizione (Figura 4B). Il MTPs continuano a crescere fintanto che i resti di membrana GUV esposti agli ioni calcio. Essi fluttuano e punto lontano dalla sorgente di ioni calcio (Figura 4, complementare Movie 1). Quando è terminato il rifornimento di ioni di calcio, lo spargimento di MTPs sopra la superficie GUV, rendendolo difficile concludere se il MTPs rimangono o fino a scomparire.

La formazione di MTPs può essere spiegata da ioni calcio localizzata vincolante all'opuscolo esterno esposto della membrana GUV e attivazione spontanea curvatura (m), che sono direttamente associato con la formazione di spontaneo di tensionamento σ = 2κm² (Κ è la rigidità di piegamento), che inducono il piegamento della membrana e formando MTPs verso l'interno. Rapporti precedenti hanno dimostrato che la deformazione della membrana può essere spiegato da condensa e/o clustering dei lipidi negativamente all'associazione degli ioni del calcio della membrana, con conseguente curvatura negativa spontanea⁴⁰. In alternativa, il forte legame di Ca^{2 +} alla superficie del bilayer negativamente neutralizza la densità superficiale di carica dell'opuscolo bilayer del lipido esposta. Questo conduce alla differenza di densità di carica attraverso il doppio strato, con conseguente curvatura spontanea diverso da zero, sufficiente per piegare la membrana²⁵.

La formazione osservata di MTPs dimostra una sensibilità delle membrane lipidiche di ioni calcio e offre un nuovo approccio senza contatto per la produzione di strutture tubolari della membrana. Chiarire l'origine di questa tubulation di membrana può essere importante per comprendere le dinamiche della membrana forma transizione durante varie funzioni cellulari e rimodellamento delle cellule e può essere utile per ottenere approfondimenti organizzazione del lipido all'interno delle cellule membrane.

Il MTPs osservati vengono sempre generati presso il sito sulla membrana in fase di esposizione dello ione calcio. Così, scegliendo la posizione della punta della micropipetta, è possibile definire l'area della superficie del capo per la crescita di protrusione. Successivo, se la micropipetta è lentamente (0.1-0.3 µm/s) spostato intorno alla superficie GUV, mantenendo la distanza di separazione dalla membrana, il MTPs sono tradotti in tandem con la micropipetta. Figura 6 e la corrispondente integrativa Movie 2 dimostrare tale migrazione di MTPs intorno alla superficie GUV. Questo processo è probabile essere accompagnato dalla formazione di nuovi MTPs su continuo calcio ioni iniezione²⁵. Alle tariffe di traduzione alta (superiore a 0,7 µm/s), il MTPs non sono in grado di seguire il suggerimento di una micropipetta. Invece, nuove sporgenze sono formate presso la nuova sede della punta della micropipetta (Figura 7).

Il calcio senza contatto osservati ione-Guida traduzione di MTPs intorno il GUV superficie può ulteriormente la nostra comprensione della Guida forze dietro le dinamiche di strutture tubolari della membrana all'interno delle cellule. Inoltre, questo approccio offre una romanzo modalità contactless per controllare il trasporto di materiale in materia soffice sistemi utilizzando gradienti chimici.

Figura 1 : Immagini di microscopia fluorescente rappresentativo dei complessi GUV-MLV immobilizzati sulla superficie di un vetro vetrini coprioggetto. (A). esempio di un GUV sferica. Il capo viene visualizzato sotto forma di un emisfero attaccato fino al MLV. (B). esempio di un GUV ondulato. Le frecce nere indicano le zone deformate della membrana. Le immagini sono migliorate e invertite per migliorare la visualizzazione delle membrane GUV fluorescente contrassegnate. La barra della scala rappresenta 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Illustrazioni schematiche della preparazione GUV-MLV e i regimi di microiniezione. (A). si forma uno strato lipidico asciutto in fondo la fiala in vetro come risultato l'evaporazione rotativa di cloroformio dalla soluzione lipidica. (B). lo strato lipidico reidratato è sonicato, e si formano vescicole lipidiche piccolo. (C). una piccola goccia della soluzione della vescicola (5 µ l) è collocata sulla superficie di un vetro vetrini coprioggetto e trasferita in un essiccatore per 20 min per disidratare la soluzione lipidica e formano una pellicola asciutta del lipido (questo passaggio non viene mostrato). Reidratare il film lipidico asciutto con 50 µ l di soluzione tampone produce i complessi GUV-MLV pre-formati. (D). il trasferimento dei complessi preformati per un più grande volume di risultati di buffer nella formazione di scarsamente separati GUV-MLV attaccate alla superficie dello slittamento del coperchio di vetro. (E). la micropipetta vicino alla superficie del capo di posizionamento e rilasciando gli ioni di calcio innesca la formazione di MTPs. Le illustrazioni non sono disegnate in scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Messa a punto sperimentale per la microiniezione degli ioni del calcio. (A). I componenti del setup sperimentale necessaria per generare il MTPs nel GUV. (B). dettagli del microiniezione di installazione. Il vetrino coprioggetti con la soluzione dei complessi GUV-MLV disposto sulla fase di microscopio. L'angolo tra la micropipetta e la superficie dello slittamento del coperchio di vetro è di 30° (indicato in bianco). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Formazione di MTPs sulla microiniezione degli ioni del calcio alla superficie del GUV. (A). The GUV-MLV complesso prima dell'esposizione ad un gradiente di ioni calcio. La freccia indica una vescicola del lipido intrappolata dentro il capo, e che non ostacola l'osservazione della MTPs. (B). Piccolo MTPs sono formate sulla microiniezione degli ioni del calcio (concentrazione di 5 mM di CaCl₂ nella micropipetta). (C). crescita di MTPs sopra l'esposizione continua di ioni calcio. Le immagini di fluorescenza sono migliorate e invertite per scopi di visualizzazione. La barra della scala rappresenta 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Vetro Micropipette utilizzate per microiniezione dello ione calcio. (A). un esempio di una micropipetta correttamente funziona. (B). un esempio di una micropipetta che ha una punta rotta (l'area danneggiata è indicato con una freccia nera). Entrambe le immagini sono migliorate e invertite per una migliore visualizzazione. La barra della scala rappresenta 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Traduzione di visite guidate agli ioni calcio di MTPs intorno alla superficie del GUV. (A). The MTPs si formano sulla superficie di GUV su microiniezione di 5 mM CaCl₂ soluzione. (B-C). Traduzione della punta della micropipetta (0.2-0.3 μm/s) intorno alla membrana superficie innesca il movimento di MTPs in direzione della sorgente di ioni di calcio. Le frecce nere evidenziano la direzione del movimento della micropipetta. Le immagini sono migliorate e invertite per migliorare la visualizzazione della membrana. La barra della scala rappresenta 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : MTPs a elevato tasso di traduzione della punta della micropipetta. (A). The MTPs si formano sulla superficie di GUV sulla microiniezione di 5 mM CaCl₂ soluzione (linea bianca). (B-C). Un elevato tasso di traduzione della micropipetta intorno alla superficie GUV (1 μm/s) provoca la formazione di nuovi MTPs presso la nuova sede della punta della micropipetta (linea magenta), così come lo scattering del MTPs precedentemente formato (linea bianca). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare Movie 1: Formazione di MTPs in GUV sopra l'esposizione localizzata alla Ca ^{2 +} gradiente. Per favore clicca qui per scaricare questo film. 

Complementare Movie 2: Migrazione di MTP guidato dello ione calcio intorno alla superficie GUV.   Per favore clicca qui per scaricare questo film. 

Discussione

Sistemi biomimetici cella consentono lo studio del comportamento della membrana dopo l'esposizione agli stimoli esterni quali gli ioni, proteine o nanoparticelle. Guv, essendo tale modello, può rispondere alle alterazioni nell'ambiente chimico regolando la loro forma, che spesso coinvolge la formazione di tubolari strutture e i invaginations^24,41,42,43 .

Questo articolo offre un approccio per generare MTPs in modo statico tramite rimodellamento della superficie GUV sulliniezione localizzata degli ioni di calcio alla superficie GUV. Il protocollo descrive la preparazione del complesso GUV-MLV, che imita una membrana di plasma delle cellule, così come il modo di impiegare una tecnica di microiniezione per generare calcio gradienti ionici vicino il GUV in superficie per formare MTPs. La maggior parte degli studi sperimentali precedenti che affrontate interazioni membrana dello ione calcio esposta vescicole lipidiche di massa calcio ioni concentrazione^14,17. A seconda delle condizioni sperimentali, tale esposizione di massa può provocare una risposta diversa membrana con nessun tubolare protrusioni formate²⁵.

La formazione dei complessi GUV-MLV è piuttosto semplice e richiede solo la normale attrezzatura da laboratorio, come un evaporatore rotante, bagno ad ultrasuoni e un essiccatore sotto vuoto. Ancora, ci sono diversi passaggi critici da considerare durante la preparazione delle vescicole. È importante garantire che la disidratazione delle vescicole è completa (durante passaggio 2.3 del protocollo) e un film asciutto del lipido circolare contenente solo una piccola quantità di cristalli di sale è formato sulla superficie dello slittamento del coperchio di vetro. Durante l'esperimento, un'attenta gestione della soluzione della vescicola, utilizzando la soluzione di riserva fresco del lipido in cloroformio, nonché fresco tampone HEPES, è essenziale per la corretta preparazione dei complessi GUV-MLV. Inoltre, attaccamento sicuro del complesso GUV-MLV alla superficie di slittamento del coperchio di vetro è cruciale per micromanipolazione e microiniezione. Per confermare l'adesione adeguata di GUV-MLV complessi, la micropipetta (senza flusso di iniezione) può essere utilizzata per spingere delicatamente contro la superficie del capo. Una vescicola fermamente aderita non scivolerà lungo la superficie a diretto contatto fisico. Poiché gli esperimenti vengono eseguiti in una goccia di tampone aperto, che può essere interrogata per diverse ore, evaporazione deve essere preso in considerazione. Evaporazione dalla goccia di tampone cambierà le condizioni osmotiche, che potrebbero influenzare e destabilizzare le vescicole. Per ripristinare condizioni di osmotiche periodica aggiunta di acqua pura al campione per ripristinare il volume originale restituisce il sistema all'omeostasi.

Quando si modifica la composizione della membrana lipidica, è fondamentale che le vescicole sono prodotte in forma di un complesso di GUV-MLV perché il MLV permette di trasferire il materiale lipidico per la GUV durante il rimodellamento della membrana. Studi precedenti hanno dimostrato che la sostituzione dei componenti della miscela SPE con lipidi puri, o l'aggiunta di 5-30% di colesterolo, consente inoltre per la formazione del complesso GUV-MLV^28,44. La maggior parte del Guv preparati è unilamellari⁴⁵.

Inoltre, durante il test di altri cationi bivalenti, come gli ioni di magnesio, la formazione del MTPs pesantemente dipende dalla presenza di carica negativa DOPS nella miscela del lipido. Senza DOPS, il MTPs non formano nelle vescicole descritte nel presente protocollo. Inoltre, cationi monovalenti, come potassio e sodio, non provocare la formazione di MTPs, anche in DOPS contenenti vescicole²⁵.

Oltre ai passaggi critici per quanto riguarda la preparazione e la manipolazione del Guv, ci sono diversi fattori importanti da considerare durante la procedura di microiniezione. Il successo microiniezione degli ioni del calcio si basa fortemente sul corretto funzionamento micropipette, che vengono preparate il giorno dell'esperimento di vetro. Ci sono diversi fattori che potrebbero causare la micropipetta malfunzionamento. Un motivo comune è un'apertura di punta intasato. Particelle lipidiche piccole, che sono sottoprodotti della preparazione della vescicola, sono dispersi nella soluzione e tendono ad aderire alla punta della micropipetta, generando così un intasamento. Pulire la punta della pipetta è fatto meglio di sollevarlo dalla soluzione della vescicola e l'immissione torna vicino alla superficie GUV. L'utilizzo della funzione blow-out della pompa microiniezione dovrà essere evitato perché si traduce in una massiccia iniezione di ioni di calcio nella soluzione all'ingrosso. Inoltre, piccole bolle d'aria intrappolate all'interno la micropipetta prevenire microiniezione corretto, nel quale caso la micropipetta deve essere sostituito con uno nuovo. Rottura di punta può essere minimizzato significativamente inserendo la messa a punto sperimentale su un tavolo sistema di smorzamento per ridurre al minimo le oscillazioni di punta.

Inoltre, cura deve essere presa quando si sceglie un regime di osservazione, per ridurre al minimo photobleaching mentre ottenere le migliori immagini risolta nel tempo. Microscopia di fluorescenza indotta da laser grandangolari è stata utilizzata nel presente protocollo perché consente una velocità di acquisizione immagine relativamente elevata ad una profondità di obiettivo limitato sonda. Inoltre, l'utilizzo della microscopia invertita consente simultaneo microiniezione e osservazione delle vescicole lipidiche e MTPs.

Uno dei limiti principali del metodo presentato è il requisito di vasto lavoro manuale e sufficienti competenze di micromanipolazione. Perché i complessi sono formati attraverso un processo spontaneo di gonfiamento, la dimensione del Guv e MLV non può essere controllata. Inoltre, questo protocollo non consente per il controllo della tensione della membrana dei preparati complessi GUV-MLV, che potrebbe essere necessario raccogliere ulteriori dettagli per quanto riguarda il rimodellamento della membrana. Il GUV sono collegati al QGBT con il materiale lipidico fornenti quest'ultima per la crescita sostanza della MTPs in una misura che sarebbe impossibile da realizzare utilizzando esclusivamente la membrana disponibile dal GUV. Il MLV anche contribuire a ridurre eventuali variazioni di tensione di superficie laterale all'interno il GUV-MLV complesso⁴⁴, che complicherebbe i tentativi di controllare la tensione della vescicola mediante aspirazione micropipetta. Questo modello basati su GUV-MLV forniscono una tensione più bassa che imita meglio i regimi di tensione trovati nelle strutture di membrana cellulare connessi a bacini di membrana, come membrana pieghe e i invaginations⁴⁶. Allo stesso tempo, la tecnica di aspirazione micropipetta può applicarsi con successo per controllare la tensione della membrana a singolo GUV. Ad esempio, il lavoro di Graber et al fornito dettagli sulla formazione dei invaginations tubolare di membrana a singolo GUV legandosi degli ioni del calcio alla membrana in condizioni di massa da tensione vari regimi⁴⁰. Infine, il confronto tra il comportamento della membrana in esposizione alla rinfusa e locale di calcio richiede migliorato controllo dell'aderenza membrana alla superficie, che esula dall'ambito del presente protocollo.

Per riassumere, la tecnica proposta consente rimodellamento della membrana senza contatto e formazione di MTPs stimolazione localizzata con gli ioni calcio. Applicazioni future di questo centro di metodo alla traduzione da sistemi sintetici vescicola nativo delle membrane biologiche, come vescichette cella. Il metodo proposto può essere integrato con altri sistemi di singola cellula interrogatorio, come patch clamp o microelettrodo amperometria, o combinato con localizzato riscaldamento strategie^31,47,48. Verificare l'effetto di altri ioni o molecole è semplice e consiste nel sostituire semplicemente gli ioni di calcio con le molecole di interesse. Inoltre, vescicole lipidiche complesse di sintetico possono essere prodotto attraverso funzionalizzazione di membrana con proteine transmembrana, che può espandere la nostra comprensione della biofisica delle dinamiche di rimodellamento e la membrana delle cellule delle cellule connesse con rilevamento del locale gradienti chimici. Ultimo ma non meno importante, la stimolazione senza contatto della membrana del lipido può anche essere tradotto ai sistemi polimerici materia soffice, che offre una base per una piattaforma di romanzo manipolazione senza contatto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soy bean polar lipid extract	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	541602C	100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	840035C	1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	ATTO-TEC (Germany)	AD 488-31	1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack	Corning Incorporated (Corning, NY 14831)	99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	650498-1L-D
Rotary evaporator	Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm	KEBO lab (Sweden)	MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO	Sharlau Chemie S.A. (Spain)	P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	T-1503 2050 g
Trizma base	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	5886
MgSO4	Merck (USA)	34549-100 g
EDTA	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	H0887 Sigma
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	Z260282-1PAK	24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	631-1339
Menzel Gläzer #1, glass cover slip	VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator	Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath	Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer	Labnet International (USA)
488 nm laser line	Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes	Leica (Germany)	12847995
Inverted fluorescence microscopy system	Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)	Technologies GmbH (Thuringia, Germany)	300038
PatchStar Micromanipulator	Scientifica (Uckfield, UK)	612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.	Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)	VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller	Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet	Eppendorf (Germany)