Remodelación de membrana de vesículas gigantes en respuesta a gradientes del Ion de calcio localizada

Resumen

Presentamos una técnica de micromanipulación sin contacto de vesículas, con gradientes del ion de calcio localizada. Microinyección de una solución de iones de calcio, en las cercanías de una vesícula lipídica gigante, se utiliza para remodelar la membrana lipídica, dando como resultado la producción de protuberancias tubulares de membrana.

Resumen

En una amplia variedad de procesos celulares fundamentales, como tráfico de membrana y apoptosis, transiciones de forma de membrana de la célula ocurren simultáneamente con variaciones locales en la concentración de iones de calcio. Se han identificado los principales componentes moleculares implicados en estos procesos; sin embargo, la interacción específica entre gradientes de iones de calcio y lípidos en la membrana celular es mucho menos conocida, principalmente debido a la naturaleza compleja de las células biológicas y la dificultad de los esquemas de observación. Para cerrar esta brecha, un enfoque sintético es aplicado con éxito para revelar el efecto localizado de iones calcio en imitadores de la membrana de la célula. El establecimiento de un imitador para asemejarse a las condiciones dentro de una célula es un problema repetido. En primer lugar, un modelo adecuado biomiméticos con adecuadas dimensiones y composición de la membrana es necesaria para captar las propiedades físicas de las células. En segundo lugar, se necesita una configuración de micromanipulación para entregar una pequeña cantidad de iones de calcio a una ubicación particular de la membrana. Por último, un esquema de observación es necesaria para detectar y registrar la respuesta de la membrana lipídica a la estimulación externa. Este artículo ofrece un enfoque biomimético detallada para el estudio de la interacción de membrana de iones calcio, donde un sistema de vesícula lipídica, formado por una vesícula unilaminar gigante (GUV) conectada a una vesícula multilamellar (MLV), está expuesto a un calcio localizado gradiente formado mediante un sistema de microinyección. La dinámica de la influencia iónica en la membrana se observó mediante microscopía de fluorescencia y registrada en las tasas de fotogramas de vídeo. Como resultado de la estimulación de la membrana, muy curvado salientes tubulares de membrana (MTPs) formadas en el interior el GUV, orientada a la membrana. El enfoque descrito induce la remodelación de la membrana lipídica y la producción de MTP en forma totalmente controlada y sin contacto. Este enfoque introduce un medio para abordar los detalles de las interacciones de membrana de iones calcio, proporcionando nuevas vías para estudiar los mecanismos de remodelación de la membrana de la célula.

Introducción

El papel de los iones de calcio dentro de los procesos biológicos, específicamente su participación en la señalización, la división celular y fusión de la membrana, es el foco de muchos estudios mecanísticos¹. La concentración del ion calcio citoplasmático intracelular es del orden de 100 nM, mientras que el calcio en orgánulos como el retículo endoplasmático, vesículas secretoras y mitocondrias, alcanzar niveles de hasta decenas de millimolars en la concentración. Esto crea iones calcio escarpado gradiente de la concentración órdenes de la magnitud a través de las membranas intracelulares^{2,3,4,5,6,7,8 ,9}. El nivel de iones de calcio extracelular es de alrededor de 2 mM y por lo tanto, las variaciones de concentración de iones de calcio se producen a nivel intracelular y extracelular. Además, recientes estudios proporcionan evidencia que el ion calcio intracelular señalización de eventos y la actividad neuronal puede ocurrir bajo condiciones de fluctuaciones locales de concentraciones del ion de calcio extracelular, lo que indica la importancia de la sincronización intra - y extracelular calcio iones variaciones¹⁰.

Con el objetivo de comprender la interacción entre los iones de calcio y las membranas biológicas, un enfoque sintético en el que nativos de las membranas celulares son reemplazadas con vesículas bicapa de lípidos se ha implementado con éxito. Exponer las vesículas a las soluciones de iones de calcio conduce a cambios en los principales grupos de lípidos y embalaje de cadena de hidrocarburos, membrana mayor tensión y agregación de vesícula, así como la segregación de los lípidos y membrana de fase de la transición^{11,12 ,13,14,15,16}. Se han investigado las propiedades de las membranas de lípidos sobre la exposición a los iones calcio utilizando técnicas experimentales como rayos x, ¹H-RMN y estudios espectroscópicos o termodinámicas^{11,16, 17 , 18}. en estos estudios, la composición de la membrana se templa a menudo para asemejarse a los nativos de las membranas celulares y contiene tales lípidos fisiológicos como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) y fosfatidilserina (PS). PS es especialmente importante en la preparación de vesículas artificiales porque es un componente esencial en muchos procesos celulares, incluyendo tráfico de membrana intracelular, exocitosis y apoptosis^19,20.

El tamaño de las vesículas de lípidos sintetizados a menudo va de nanómetros a varios micrómetros. Entre diferentes vesículas, las vesículas gigantes unilaminar (2.fino), que son varias decenas de micrómetros de diámetro, son de particular importancia debido a su tamaño relativamente grande, muy parecidas a las dimensiones del individuo células^{21 , 22 , 23}. la superficie disponible de la 2.fino permite el efecto de los gradientes químicos locales en propiedades biofísicas de la membrana a estudiar. Por exponer sólo una parte de la superficie de la membrana a los estímulos externos, se puede investigar más de cerca la dinámica de la membrana. Por ejemplo, se ha demostrado que la aplicación localizada de gradientes químicos o pH en la superficie del 2.fino conduce a la formación de protuberancias tubulares, que no se observaron en mayor exposición^24,25. Las diferencias observadas en el comportamiento de la membrana llaman para más desarrollo de esquemas de vesícula simple interrogatorio a ganar algunas penetraciones en los mecanismos de remodelación de la membrana de la célula.

Sobre la base de los métodos de microinyección y micromanipulación del temprano 1900s^26,27, en relación con los avances más recientes de sistemas de manipulación simple vesícula desde el 2000s^23,28 , este artículo presenta un enfoque en que la membrana remodelación y formación de protuberancias tubulares de membrana (MTPs) en la membrana GUV son generados en respuesta a la aplicación local de iones de calcio.

Nuestro enfoque utiliza una vesícula compleja que consta de un GUV conectado a una vesícula multilamellar (MLV) como un sistema biomimético de modelo de membrana (figura 1A). El MLV es requerida como un depósito de lípidos para el complejo suministrar material de lípidos para el GUV durante la exposición a un gradiente de iones de calcio. Esta conexión permite que el complejo compensar el aumento en la tensión de la membrana durante la remodelación inducida y forma la transición de la membrana GUV y proporcionan lípidos para crecimiento de MTP. Además, el MLV facilita la inmovilización superficial porque su masa es mayor en comparación con el GUV. Los complejos de GUV-MLV, cuando inmovilizado sobre un sustrato sólido, se han utilizado previamente para producir redes de nanotubos-vesícula, estudiando la interacción de membrana polimérica y mímico las últimas etapas de exocitosis^{29,30, 31,32,33}.

Protocolos anteriores utilizaron extracto lípido polar de soja (SPE) para preparar complejos de GUV-MLV²⁸. La SPE consiste en una mezcla de fosfolípidos que incluyen PC (45.7%), PE (22,1%), fosfatidilinositol (PI, 18.4%), ácido fosfatídico (PA, 6,9%) y una mezcla de otros lípidos (6.9%). En nuestro protocolo adjunto, la mezcla SPE es dopada con 20% de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sal sódica) (DOPS) para imitar el prospecto interno de la membrana plasmática de la célula. Un 1% de ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-droga) se utiliza para manchar el bilayer del lípido para habilitar la supervisión de la remodelación de la membrana utilizando microscopía de fluorescencia. El 2.fino tiene composición de lípido simétrico a través de la bicapa y localmente está expuesto a concentraciones de 5 mM de cloruro de calcio (CaCl₂). Estas condiciones experimentales, con una concentración de ion calcio elevado, también imitan el folleto de la membrana externa de las células apoptóticas, donde las moléculas PS son expresados³⁴. La formación de los complejos de GUV-MLV requiere el uso de un método de deshidratación de rehidratación modificado inicialmente desarrollado por Criado y Keller³⁵. El protocolo de preparación de vesícula incluye la formación de una capa de lípido seco, que se utiliza para formar pequeñas vesículas en la solución. Esta solución es entonces deshidratada y rehidratada para formar los complejos de GUV-MLV finales. Figura 2A -D muestra los pasos principales para la preparación de un típico complejo de GUV-MLV.

Después de completa la preparación de la vesícula y la vesícula complejo es inmovilizada en el sustrato de vidrio, se utiliza la técnica de microinyección entregar pequeñas cantidades de iones calcio al prospecto externo del GUV a través de una micropipeta de vidrio de punta abierta. El flujo de la solución de calcio fuera de la punta genera un gradiente de iones de calcio localizada en la superficie de la membrana GUV, conduce a la remodelación de la membrana y la generación de las MTPs. El MTPs se orientan de la fuente de iones de calcio y crecen dentro del GUV. Esta formación de MTP puede controlarse directamente mediante microscopía de fluorescencia y grabado con una cámara digital. La figura 3 muestra el montaje experimental utilizado para la producción de la remodelación de la membrana. La formación de las MTPs (Figura 2E y figura 4) en este protocolo muestra un contrastante resultado calcio ion exposición experimentos llevados a cabo en condiciones de volumen a granel. Condiciones a granel, el 2.fino rompen y forma parches de membrana que se observa a adherirse a la superficie de vidrio²⁵.

Más información en la formación de los complejos de GUV-MLV, así como el procedimiento para realizar la microinyección de iones calcio, son explicados en este artículo. Los protocolos se centran en gran parte en microinyección de iones de calcio; sin embargo, este enfoque puede modificarse fácilmente para su uso en el estudio de las respuestas de membrana debido a la exposición local a otros iones o proteínas. Además, la composición de las vesículas puede ser afinada para aislar las funciones de componente lipídico en el proceso de remodelación de la membrana. El protocolo presentado no requiere ningún equipo sofisticado para producir los complejos de GUV-MLV y se caracteriza por un alto grado de reproducibilidad.

Protocolo

1. preparación de vesículas pequeñas de lípidos

1. Preparar una solución de lípidos SPE/DOPS/ATTO488-droga en cloroformo con una masa de proporción de 79/20/1.The final concentración de lípidos en cloroformo es de 1 mg/mL, y la masa final es de 0,6 mg (típicamente menos de 1 mg). Uso desechable redondo viales de vidrio inferior (alrededor de tubos de vidrio de fondo, 10 x 75 mm) al preparar la solución de lípidos sin un paso de limpieza previa.
   1. Llenar y lavar las jeringas de vidrio (25 μl) con cloroformo al menos 5 veces antes de su uso. Para llenar y enjuague la jeringa de vidrio de al menos 5 veces, 3-4 mL de cloroformo, es suficiente.
      PRECAUCIÓN: Cuando manejo cloroformo, usar jeringas de vidrio y realizar todos los procedimientos en una campana de humos usando guantes adecuados y gafas protectoras en todo momento. No use los frascos de plástico, jeringas o pipetas al manipular el cloroformo.
2. Envolver el frasco de cristal que contiene la mezcla de lípidos con papel de aluminio para proteger el contenido de la luz ambiental y evaporar el disolvente en un rotavapor durante 3 horas para eliminar el cloroformo con la presión de llegar a 7 kPa vacío a 80 rpm. Una película seca del lípido está formada en la parte inferior de la cubeta de vidrio después de la evaporación (figura 2A).
   Nota: Escalado varias veces y utilizando grandes cantidades de lípidos pueden requerir más tiempo de evaporación rotatoria, para asegurar el retiro completo de cloroformo.
3. Lentamente añadir 600 μl de fosfato tampón salino (PBS) tampón (pH 7.8, sin dilución) sobre la película lipídica secos. Tras la adición del buffer, suavemente añadir 6 μl de glicerol para proteger la muestra de deshidratación completa durante la formación de GUV-MLV pasos (alcanzar una concentración final de glicerol de 1% en peso)³⁶. Sellar el frasco de cristal con parafilm y cubierta metálica para proteger de la luz ambiental. Almacenar en nevera a 4 ° C durante la noche.
   Nota: La solución de tampón PBS consta de 0,151 g de Trizma base, 1,592 g de K₃PO₄, 1,021 g de KH₂PO₄, 0,062 g de MgSO₄ ·7H₂O y 0,0465 g de EDTA en 250 mL de agua purificada. La solución a 4 ° C y temperatura ambiente antes de usarlos. La cantidad equivalente de 10 mM de tampón HEPES puede utilizarse en lugar de solución de PBS. La solución de tampón HEPES se prepara diluyendo una solución de 1 M HEPES con agua purificada.
4. Al día siguiente, someter a ultrasonidos el frasco de cristal que contiene la solución durante 1 min, utilizando un baño de ultrasonidos a temperatura ambiente. Retire el parafilm y pipeta hasta que se forma una solución visualmente uniforme de vesículas pequeñas de lípidos (figura 2B). Alícuota de 30 μl de la solución de lípidos obtenidos de pequeña vesícula en tubos plásticos individuales de 0,5 mL. Mantenga estas alícuotas stock a-18 ° C durante un máximo de 6 meses.
   Nota: Si la solución de vesícula pequeña de lípidos no es visualmente uniforme, vórtice la solución 4 veces para 1-2 s con un mezclador vortex a máxima velocidad.

2. preparación de complejos de GUV-MLV

1. Descongelar a temperatura ambiente un tubo plástico que contiene una parte alícuota de la suspensión congelada de vesículas pequeñas de lípidos. Vórtice el tubo 4 veces para 1-2 s con un mezclador vortex a máxima velocidad.
2. Lugar 5 μl de la suspensión de vesícula pequeña de lípidos en la superficie de un cubreobjetos de vidrio (24 x 60 mm) para formar un pequeño alrededor de la gotita. Utilizar un cubreobjetos de vidrio sin pasos limpieza previa.
3. Colocar el cubreobjetos de vidrio en un desecador de vacío (< 100 kPa vacío) durante 20 minutos.
4. Almacenar la película lipídica secada a temperatura ambiente durante 4 min, entonces lentamente pipetee 50 μl de tampón HEPES 10 mM encima de la película seca del lípido para la rehidratación. Esperar 5 min para la formar los complejos de GUV-MLV (figura 2).
5. Centro un cubreobjetos de cristal sobre la platina del microscopio, luego pipetear 300 μL de tampón HEPES en él y coloque el centro de la gota sobre el objetivo (figura 3B).
6. Transferir 50 μl de la solución de GUV-MLV preformada en la solución HEPES (300 μL). Espere 25 minutos para que escasamente formados complejos GUV-MLV para adherirse firmemente a la superficie de la hoja de cubierta de vidrio (Figura 2D).
   Nota: En ocasiones, los complejos de GUV-MLV no forman en la hoja de cubierta de vidrio y en su lugar se observan parches de lípidos o sólo proveedores de servicios multilingües. Esto puede explicarse por agitación accidental de la muestra durante los pasos de 2.4 o 2.6 o numerosos ciclos de congelación y descongelación de la suspensión de vesícula pequeña. Repita los pasos 2.1-2.6 o utilizar solución recién preparada de lípidos (paso 1.1) para obtener los complejos GUV-MLV.

3. micropipeta preparación y microinyección

1. Los cantos de los capilares de vidrio de borosilicato colocando suavemente el tubo capilar termina en la llama de una vela para impedir que se rompa al introducirlo en el soporte de Micropipetas las Micropipetas.
2. Tire de Capillares de vidrio de al menos 3 utilizando un tirador láser automático usando el programa: calor = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Calor = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. El conjunto del programa se debe ingresar con el primer valor de Pul en blanco. Con Capillares de vidrio de borosilicato de diámetro interno (I.D.) 1.00 mm y diámetro externo (O.D.) 0,78 mm resulta en una micropipeta con una abertura de la punta de aproximadamente 0,3 μm de diámetro.
3. Back-fill cada micropipeta con 8 μl de solución de CaCl₂ en tampón HEPES (10 mM) utilizando un microloader de 5 mM. Filtrar la solución de CaCl₂ utilizando un 0.2-0.5 μm filtro de la jeringuilla antes de usarlos para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta.
   Nota: Asegúrese de que el CaCl₂ se haya disuelto completamente en la solución de tampón HEPES, que también se utiliza para pasos 2.4-2.6.
4. Conecte un soporte de la micropipeta a un micromanipulador. Monte firmemente la micropipeta en el soporte de Micropipetas. Conecte la bomba de inyección y porta capilar con el tubo de suministro.
5. Arrancar la bomba de inyección. Ajustar la configuración de la bomba de inyección a 20 hPa (presión de inyección) y una presión de compensación 5 hPa, en modo automático. Detener la bomba de inyección hasta que la micropipeta está lista para la microinyección.
6. Ponga el microscopio a brightfield. Configuración de contraste de interferencia diferencial (DIC). Objetivos de uso 63 X o 100 X alta NA (1.3) para lograr el óptimo de la membrana borde de resolución.
7. Utilice el micromanipulador grueso para colocar la micropipeta sobre la gota que contiene los complejos GUV-MLV. Coloque la punta de la micropipeta sobre el objetivo.
8. Enfocar el microscopio sobre el punto medio del complejo GUV-MLV y luego reorientar aproximadamente 50 μm sobre el GUV. Utilice el modo grueso de las amalgamas dentales llevar suavemente la micropipeta en foco.
9. Cambiar las amalgamas dentales al modo fino. Lentamente vuelva a enfocar a la superficie GUV traduciendo la punta de la micropipeta abajo y manteniendo la punta en foco. Colocar la micropipeta punta aproximadamente 20 μm de la superficie GUV. Si la punta de la micropipeta se rompe debido al contacto accidental con la hoja de cubierta de vidrio (ejemplo en la figura 5B), cámbiela inmediatamente para evitar la liberación de iones calcio innecesario en la solución a granel.

4. formación y traducción del MTPs con la fuente de iones de calcio

1. Colocar el microscopio en el modo de fluorescencia. Set dicroicos que excitan a 488 nm y detectan la emisión en el 505-550 nm.
2. Encienda la bomba de inyección y comenzar la inyección de iones de calcio. Utilice el modo fino de las amalgamas dentales y acercarse poco a poco el GUV con la punta de la micropipeta. Coloque la punta de la micropipeta a una distancia de 3 μm de la superficie de la membrana mientras inyecta la solución de CaCl₂ de la micropipeta para permitir que el MTPs a forma (figura 4).
3. Para traducir el MTPs a lo largo de la superficie GUV, mueva lentamente la punta de la pipeta (con una velocidad de 0,1 a 0,3 μm/s) alrededor del GUV superficie usando el fino instrumental quirúrgico (figura 6). Mantener aproximadamente la misma distancia (μm 3) entre la superficie GUV y la punta de la micropipeta mientras continúa la inyección de iones de calcio.
   Nota: En las tasas de traducción alta de la punta de la micropipeta (por encima de 0,7 μm/s), el MTPs no emigrará en sincronía con la micropipeta. En cambio, se dispersan y se acortan, mientras que el MTPs nuevo se formará en la nueva ubicación de la punta de la micropipeta (figura 7).
4. Para detener la microinyección, apague la bomba de inyección y mueva la micropipeta lejos de la superficie GUV.

Resultados

En este trabajo demostramos la creación de complejos de GUV-MLV y cómo pueden ser utilizados para aclarar el efecto de los gradientes de iones de calcio en la membrana de la célula dinámica. Complejos de GUV-MLV conectado en superficie son necesarios para estos experimentos permitir que un imitador de tamaño celular fijo estableciendo un gradiente de iones a través de microinyección. La membrana GUV responde a la concentración del calcio localizada a través de la formación del MTPs dirigido lejos de la fuente de iones de calcio. Además, el MTPs se pueden traducir en el GUV en una manera sin contacto moviendo la punta de la micropipeta en la superficie de la membrana.

En la figura 2se muestra una ilustración esquemática del procedimiento de preparación de GUV-MLV. Aunque en el protocolo presentado, los complejos GUV-MLV están ya preformados en el paso 2.4 (figura 2), transferencia de la solución de vesícula a otra gota 300 de μl de tampón (paso 2.6 del Protocolo) permite que los complejos de GUV-MLV escasamente formados a suficientemente se adhieren al sustrato de vidrio. De esta manera, se establece un complejo adecuado para micromanipulación y microinyección (Figura 2D). En ocasiones, el 2.fino contiene una o varias vesículas de lípidos atrapados, que no afectan a la formación de MTP, como se muestra en la Figura 4A. Estos 2.fino produce MTPs; sin embargo, la proyección de imagen puede quedar obstruida si las vesículas atrapadas son grandes. La mayoría de lo preparado 2.fino (hasta un 75%) aparecen hemisférico y se unen a los proveedores de servicios multilingües, como se muestra en la figura 1A. Estas vesículas son el foco principal de este protocolo y son aptos para el procedimiento de microinyección. Aproximadamente el 25% de la restante 2.fino aparecer ondulado (figura 1B), que es indicativa de un régimen de tensión inferior de la membrana. Estas vesículas ondulantes también permiten la formación de las protuberancias tubulares; sin embargo, exhiben cinética diferente y una diferente morfología de las MTPs formados, que está fuera del alcance de este protocolo²⁵. El diámetro típico de las vesículas preparados varía entre 2 a 15 μm para los proveedores de servicios multilingües y entre 2 a 40 μm para el 2.fino. El GUV óptimo tamaño de la exposición a los iones del calcio es de 5 μm o más grande.

Micropipetas han sido utilizados en esquemas de interrogatorio chamuscar-célula, así como en procedimientos que requieren manipulación de 2.fino sintético por varias décadas^37,38. La mayoría de estas aplicaciones involucraron contacto físico directo entre la micropipeta y la superficie de las células o vesículas. Los ejemplos incluyen la técnica de patch-clamp o tirar de amarres de la membrana de la membrana GUV, además de construir redes de nanotubos-vesícula^23,28,39. Recientemente, micropipetas también se han utilizado para generar gradientes localizados de iones y moléculas alrededor 2.fino reconstruir células heterogéneas microambientes^24,25. En el protocolo presentado, una micropipeta funciona correctamente (figura 5A) es un factor crucial para el establecimiento de un gradiente de iones de calcio en la superficie GUV lanzando la solución contenida dentro. Adecuado posicionamiento de la micropipeta en la superficie GUV y evitando el contacto con la membrana de lípidos son esenciales para la exitosa microinyección. La punta de la micropipeta se lleva a cabo a una distancia de unos 3 μm de la superficie GUV, que es una distancia óptima para generar MTPs mientras que mímico las variaciones de calcio cerca de la membrana celular. Si la punta de la micropipeta es accidentalmente roto (figura 5B), un reemplazo es necesario. La concentración previamente probada gama de CaCl₂ dentro de la micropipeta, que permite la formación de MTP, es entre 2 y 5 mM²⁵, que corresponde a las concentraciones de calcio extracelular. CaCl₂ concentraciones más bajas, es decir, 1 mM, no se observan MTPs.

La formación del MTPs en la microinyección de calcio comienza con la formación de invaginaciones de la membrana pequeña, que crecen en el MTPs en el sitio de la exposición (Figura 4B). El MTPs continúan creciendo mientras los restos de membrana GUV expuestos a los iones de calcio. Fluctuar y apunte hacia la fuente de iones de calcio (figura 4, adicional 1 de la película). Cuando se termina la fuente de iones de calcio, el MTPs esparcir sobre la superficie GUV, lo que dificulta concluir si el MTPs permanecen o desaparecerán eventualmente.

La formación del MTPs puede explicarse por el ion calcio localizado enlace al prospecto externo expuesto de la membrana GUV y accionar espontáneo curvatura (m), que esté directamente relacionado con la formación de espontánea tensión σ = 2κm² (Κ es la rigidez de flexión), que inducen flexión de la membrana y la formación internas MTPs. Informes anteriores han demostrado que la deformación de la membrana puede ser explicada por condensación o agrupamiento de los lípidos cargados negativamente sobre la Unión de los iones de calcio a la membrana, dando como resultado negativo curvatura espontánea⁴⁰. Por otra parte, la fuerte unión del Ca^{2 +} en la superficie de la bicapa cargada negativamente neutraliza la densidad superficial de carga del folleto de la bicapa de lípidos expuestos. Esto conduce a la diferencia de densidad de la carga a través de la bicapa, dando por resultado la curvatura espontánea distinto de cero, suficiente para doblar la membrana²⁵.

La formación observada del MTPs demuestra una sensibilidad de membranas lipídicas a los iones calcio y ofrece un nuevo enfoque sin contacto para la producción de estructuras tubulares de membrana. Dilucidar el origen de este tubulation de la membrana puede ser importante para la comprensión de la dinámica de la membrana forma transición durante varias funciones de la célula y remodelación celular y puede ser útil para obtener ideas sobre organización de lípidos dentro de la célula membranas.

El MTPs observados se generan siempre en el sitio de la membrana sometidos a exposición de iones de calcio. Así, al elegir la ubicación de la punta de la micropipeta, es posible definir el área de la superficie GUV para el crecimiento de la saliente. Siguiente, si la micropipeta es lentamente (0.1-0.3 μm/s) se movió alrededor de la superficie GUV, manteniendo la distancia de separación de la membrana, el MTPs se traducen en tándem con la micropipeta. Figura 6 y el complementario correspondiente Movie 2 demuestran estas migraciones de las MTPs alrededor de la superficie GUV. Este proceso es probable ser acompañado por la formación de nuevo MTPs a iones de calcio continua inyección²⁵. Precios de traducción alta (por encima de 0,7 μm/s), el MTPs no son capaces de seguir la punta de la micropipeta. En cambio, se forman nuevas protuberancias en la nueva ubicación de la punta de la micropipeta (figura 7).

El calcio sin contacto observado guiada por ion traducción de MTPs alrededor el GUV superficial aún más nuestra comprensión de la conducción de las fuerzas detrás de la dinámica de estructuras tubulares de la membrana interior de las células. Por otra parte, este enfoque ofrece un nuevo modo sin contacto para controlar el transporte de material en sistemas de materia blanda usando gradientes químicos.

Figura 1 : Imágenes de microscopia fluorescente representante de complejos GUV-MLV inmovilizadas en la superficie de un cubreobjetos de cristal. (A). ejemplo de un GUV esférico. El GUV aparece en forma de un hemisferio unido a la MLV. (B). ejemplo de un GUV ondulante. Las flechas negras indican las zonas deformadas de la membrana. Las imágenes son mejoradas e invertidas para mejorar la visualización de las membranas GUV fluorescencia marcadas. La barra de escala representa 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Ilustraciones esquemáticas de la preparación de GUV-MLV y los sistemas de microinyección. (A). se forma una capa de lípido seco en la parte inferior del frasco de vidrio como consecuencia de la evaporación rotatoria de cloroformo de la solución de lípidos. (B). la capa de lípidos rehidratado se sonicó, y se forman vesículas pequeñas de lípidos. (C). una pequeña gota de la solución (5 μl) de la vesícula se coloca en la superficie de un cubreobjetos de vidrio y transferida en un desecador por 20 minutos para deshidratar la solución de lípidos y forman una película lipídica seco (este paso no se muestra). Rehidratación de la película lipídica seco con 50 μl de solución amortiguadora produce los formados complejos GUV-MLV. (D). la transferencia de los complejos de la formadas a un mayor volumen de resultados de búfer en la formación de GUV-MLV escasamente separado unido a la superficie de la hoja de cubierta de vidrio. E. posicionamiento de la micropipeta cerca de la superficie de la GUV y liberando los iones de calcio desencadena la formación del MTPs. Las ilustraciones no se dibujan a escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Montaje experimental para la microinyección de los iones del calcio. (A). los componentes de la instalación experimental necesaria para generar el MTPs en la 2.fino. (B). los datos de la configuración de microinyección. Cubreobjetos de vidrio con la solución de los complejos de GUV-MLV colocado sobre la platina del microscopio. El ángulo entre la micropipeta y la superficie de la hoja de cubierta de vidrio es de 30° (marcado en blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Formación del MTPs en la microinyección de los iones de calcio en la superficie de la GUV. (A). el GUV-MLV complejo antes de la exposición a un gradiente de iones de calcio. La flecha indica una vesícula lipídica atrapada dentro del GUV, y que no obstruya la observación de las MTPs (B). MTPs pequeños se forman en la microinyección de los iones del calcio (concentración de 5 mM de CaCl₂ en la micropipeta). (C). crecimiento del MTPs con la continua exposición a los iones calcio. Las imágenes de fluorescencia mejoradas e invertidas para fines de visualización. La barra de escala representa 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Micropipetas utilizados para microinyección de ion calcio de cristal. (A). un ejemplo de una micropipeta funcione correctamente. (B). un ejemplo de una micropipeta que tiene una punta rota (la zona dañada se indica con una flecha negra). Ambas imágenes son mejoradas e invertidas para mejor visualización. La barra de escala representa 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Traducción de guiada por el ion calcio de las MTPs alrededor de la superficie de la GUV. (A). el MTPs se forman en la superficie GUV a microinyección de 5 mM CaCl₂ solución. (B-C). Traducción de la punta de la micropipeta (0.2-0.3 μm/s) alrededor de la membrana superficie provoca el movimiento de las MTPs en la dirección de la fuente de iones de calcio. Las flechas negras destacan la dirección del movimiento de una micropipeta. Las imágenes son mejoradas e invertidas para mejorar la visualización de la membrana. La barra de escala representa 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : MTPs a ritmo de traducción en alto de la punta de la micropipeta. (A). el MTPs se forman en la superficie GUV a la microinyección de la solución de CaCl₂ (línea blanca) de 5 mM. (B-C). Una tasa alta de traducción de la micropipeta alrededor de la superficie GUV (1 μm/s) resultados en la formación de nuevos MTPs en la nueva ubicación de la punta de la micropipeta (línea magenta), así como la dispersión de las MTPs previamente formados (línea blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Película adicional 1: Formación del MTPs en GUV con la exposición localizada a la Ca ^{2 +} degradado. Haga clic aquí para descargar esta peli. 

Película adicional 2: Migración de MTP guiada por el ion de calcio alrededor de la superficie GUV.   Haga clic aquí para descargar esta peli. 

Discusión

Biomiméticos celular sistemas permiten el estudio del comportamiento de la membrana sobre la exposición a los estímulos externos tales como los iones, proteínas o nanopartículas. 2.fino, siendo un modelo, puede responder a alteraciones en el ambiente químico ajustando su forma, que a menudo involucra la formación de tubulares estructuras e invaginaciones^24,41,42,43 .

Este artículo ofrece un acercamiento para generar MTPs de una manera sin contacto a través de la remodelación de la superficie GUV a inyección localizada de iones de calcio en la superficie GUV. El protocolo describe la preparación del complejo GUV-MLV, que imita una membrana de células plasmáticas, así como emplear una técnica de microinyección para generar calcio gradientes del ion cerca el GUV superficial para formar MTPs. La mayoría de los estudios experimentales previos que aborda las interacciones membrana-iones de calcio expuesto vesículas de lípidos a granel calcio iónico concentración^14,17. Dependiendo de las condiciones experimentales, tal exposición a granel puede resultar en una respuesta diferente de la membrana sin protuberancias tubulares formadas²⁵.

La formación de los complejos de GUV-MLV es bastante sencilla y sólo requiere equipo normal de laboratorio, como un evaporador rotatorio, baño ultrasónico, desecador de vacío. Sin embargo, existen varios pasos críticos a tener en cuenta durante la preparación de la vesícula. Es importante asegurarse de que la deshidratación de las vesículas es completada (durante el paso 2.3 del Protocolo) y se forma una película seca lípidos circular que contiene sólo una pequeña cantidad de cristales de sal en la superficie de la hoja de cubierta de vidrio. Durante el experimento, cuidadoso manejo de la solución de la vesícula, usando solución fresca del lípido en cloroformo así como fresco tampón HEPES, es esencial para la exitosa preparación de los complejos de GUV-MLV. Además, una fijación segura del GUV-MLV complejo a la superficie del cubreobjetos de vidrio es crucial para la micromanipulación y microinyección. Para confirmar la adecuada adherencia del GUV-MLV complejo, la micropipeta (sin flujo de inyección) puede utilizarse para empujar suavemente contra la superficie GUV. Una vesícula firmemente adherida no se deslizará a lo largo de la superficie en contacto físico directo. Porque los experimentos se realizan en una gota de tampón abierto, que puede ser interrogado durante varias horas, evaporación debe tenerse en cuenta. Evaporación de la gota del buffer cambia las condiciones osmóticas, que podrían afectar y desestabilizar las vesículas. Para restaurar las condiciones osmóticas, adición periódica de agua pura a la muestra para restaurar el volumen original devuelve el sistema a la homeostasis.

Cuando se modifica la composición lipídica de la membrana, es crucial que las vesículas se producen en la forma de un complejo de GUV-MLV porque el MLV permite transferir el material lipídico al GUV durante la remodelación de la membrana. Estudios anteriores han demostrado que SOSTITUCIÓN de los componentes de la mezcla SPE con lípidos puros o adición de 5-30% de colesterol, también permite la formación de complejos de GUV-MLV^28,44. La mayoría de lo preparado 2.fino son propiedades⁴⁵.

Además, al probar otros cationes divalentes, como los iones de magnesio, la formación de las MTPs mucho depende de la presencia de DOPS negativamente cargada en la mezcla de lípidos. Sin DOPS, el MTPs no forman en las vesículas que se describe en este protocolo. También, los cationes monovalentes, como el potasio y sodio, no dan lugar en la formación del MTPs, incluso en las vesículas que contienen DOPS²⁵.

Además de los pasos críticos en cuanto a la preparación y manipulación de la 2.fino, hay varios factores importantes a considerar durante el proceso de microinyección. La exitosa microinyección de los iones del calcio depende pesadamente funcionamiento correctamente cristal micropipetas, que se preparan en el día del experimento. Hay varios factores que podrían causar la micropipeta al mal funcionamiento. Una razón común es una abertura de la punta tapada. Las partículas pequeñas de lípidos, que son subproductos de la preparación de la vesícula, se dispersan en la solución y tienden a adherirse a la punta de la micropipeta, generando una obstrucción. Limpieza de la punta se hace mejor levantando de la solución de la vesícula y colocando nuevamente cerca de la superficie GUV. El uso de la función de expulsión de la bomba de microinyección debe evitarse debido a la inyección masiva de iones calcio en la solución a granel. Además, pequeñas burbujas de aire atrapadas dentro de la micropipeta previenen microinyección adecuado, en el cual caso la micropipeta debe reemplazarse por uno nuevo. Rotura de la punta puede minimizarse significativamente colocando el montaje experimental en una tabla de amortiguación de la vibración para reducir al mínimo las oscilaciones de la punta.

Además, cuidado debe ser tomado al elegir un esquema de observación, para minimizar el fotoblanqueo y obtener las mejores imágenes de tiempo resuelto. Microscopía de fluorescencia inducida por láser de gran campo fue utilizado en este protocolo porque permite una tasa de adquisición de imagen relativamente altas a una profundidad de sonda limitada objetiva. Además, el uso de microscopía invertida permite simultánea microinyección y observación de las vesículas de lípidos y MTPs.

Una de las principales limitaciones del método presentado es el requerimiento de trabajo manual extenso y suficientes habilidades de micromanipulación. Porque los complejos se forman a través de un proceso de inflamación espontáneo, no se puede controlar el tamaño de la 2.fino y proveedores de servicios multilingües. Además, este Protocolo no permite para el control de la tensión de la membrana de los preparados complejos GUV-MLV, que puede ser necesario recoger información adicional con respecto a la remodelación de la membrana. El 2.fino está conectado a los proveedores de servicios multilingües con el último material lípido provee para el crecimiento sustancial de las MTPs a tal punto que sería imposible de lograr utilizando únicamente la membrana de la 2.fino. Los proveedores de servicios multilingües también contribuyen a reducir las variaciones de tensión de superficie lateral dentro del GUV-MLV complejo⁴⁴, que complicaría los intentos de controlar la tensión de la vesícula mediante aspiración de una micropipeta. Este modelo basado en MLV GUV proporcionan una tensión más baja que mejor imita a los regímenes de tensión encontrados las estructuras de la membrana celular conectadas a depósitos de membrana, tales como los pliegues y las invaginaciones de la membrana⁴⁶. Al mismo tiempo, la técnica de aspiración de la micropipeta puede aplicarse con éxito para controlar la tensión de la membrana en 2.fino sola. Por ejemplo, el trabajo por Graber et al. facilitó detalles sobre la formación de invaginaciones tubulares membrana en 2.fino sola al enlace de los iones de calcio a la membrana en condiciones a granel de tensión variados regímenes⁴⁰. Finalmente, la comparación del comportamiento de la membrana en la exposición local o a granel a calcio requiere mayor control de la adherencia de la membrana a la superficie, que está fuera del alcance del presente Protocolo.

En Resumen, la técnica propuesta permite sin contacto membrana remodelación y formación del MTPs sobre estimulación localizada con los iones del calcio. Futuras aplicaciones de este centro de método en la traducción de sistemas sintéticos de la vesícula a las membranas biológicas autóctonas, como las ampollas de la célula. El método propuesto puede ser incorporado con otros esquemas de interrogatorio unicelular, como Amperometría de patch-clamp o microelectrodo, o combinado con localizada calefacción estrategias^31,47,48. Prueba el efecto de otros iones o moléculas es sencilla y consiste en simplemente sustituir los iones de calcio con las moléculas de interés. Además, se pueden producir vesículas de lípidos sintéticos complejos a través de funcionalización de la membrana con proteínas transmembranales, que puede ampliar nuestra comprensión de la biofísica de dinámica celular remodelación y membrana de la célula asociada con detección de local gradientes químicos. Por último pero no menos importante, la estimulación sin contacto de la membrana de lípidos también puede traducirse a sistemas poliméricos materia blanda, ofreciendo una base para una plataforma de manipulación sin contacto novela.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soy bean polar lipid extract	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	541602C	100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS	Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)	840035C	1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)	ATTO-TEC (Germany)	AD 488-31	1 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack	Corning Incorporated (Corning, NY 14831)	99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	650498-1L-D
Rotary evaporator	Büchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm	KEBO lab (Sweden)	MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO	Sharlau Chemie S.A. (Spain)	P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	T-1503 2050 g
Trizma base	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	5886
MgSO4	Merck (USA)	34549-100 g
EDTA	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	H0887 Sigma
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	Z260282-1PAK	24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm	Sigma Aldrich (Missouri, USA)	631-1339
Menzel Gläzer #1, glass cover slip	VWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccator	Vacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bath	Bandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixer	Labnet International (USA)
488 nm laser line	Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopes	Leica (Germany)	12847995
Inverted fluorescence microscopy system	Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)	Technologies GmbH (Thuringia, Germany)	300038
PatchStar Micromanipulator	Scientifica (Uckfield, UK)	612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.	Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)	VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller	Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet	Eppendorf (Germany)