JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים טכניקה עבור המיקרומניפולציה ללא מגע של שלפוחית, באמצעות מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות. Microinjection של פתרון יון סידן, באזור שלפוחית השומנים ענק, מנוצל כדי לשפץ ממברנה השומנים, וכתוצאה מכך הייצור של בליטות צינורי ממברנה.

Abstract

במגוון רחב של תהליכים תא הבסיסיים, כגון סחר ממברנה אפופטוזיס, קרום התא צורה מעברים להתרחש במקביל בווריאציות מקומיות ריכוז יון הסידן. הרכיבים מולקולרית העיקריים המעורבים בתהליכים אלה זוהו; עם זאת, ספציפית יחסי הגומלין בין מעברי צבע יון סידן ליפידים בתוך קרום התא הרבה פחות ידוע, בעיקר בשל האופי המורכב של תאים ביולוגיים ואת difficultly של התבוננות ערכות. לגשר את הפער הזה, גישה סינתטית מיושם בהצלחה כדי לחשוף את ההשפעה המותאמות לשפות אחרות של יונים של סידן על קרום התא מחקה. הקמת לחקות להידמות התנאים בתוך תא היא בעיה severalfold. ראשית, מודל ביונים נאותה בממדים המתאימים והרכב ממברנה נדרש כדי ללכוד המאפיינים הפיזיים של תאים. שנית, מלכודת המיקרומניפולציה נדרש לספק כמות קטנה של יונים של סידן למיקום מסוים ממברנה. לבסוף, ערכת תצפית נדרש לשם זיהוי ורישום התגובה של קרום השומנים גירוי חיצוני. מאמר זה מציע בגישה ביונים מפורט ללמוד את האינטראקציה יון-הממברנה סידן, שבו מערכת שלפוחית השומנים, המורכב שלפוחית unilamellar ענק (בוס) מחובר של שלפוחית multilamellar (קמפנילה MLV), הוא חשוף של סידן המותאמות לשפות אחרות מעבר צבע נוצר באמצעות מערכת microinjection. הדינמיקה של ההשפעה יוניים על הקרום היו באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות להקליט ולצפות במעשיהם במחירים מסגרת וידאו. בעקבות גירוי קרום, מאוד מעוקל ממברנה צינורי בליטות (MTPs) נוצר בתוך הבוס, אוריינטציה מן הקרום. הגישה המתוארת גורם שיפוץ של קרום שומנים בדם וייצור MTP בצורה לגמרי ללא מגע ומבוקר. גישה זו מציגה את האמצעים לטפל בפרטים של סידן יון-הממברנה אינטראקציות, מתן דרכים חדשות כדי לחקור את המנגנונים של עיצוב מחדש של קרום התא.

Introduction

התפקיד של יוני הסידן בתוך תהליכים ביולוגיים, במיוחד מעורבותם איתות חלוקת התא, ממברנה היתוך, הוא המוקד של מחקרים מכניסטית רבים1. ריכוז יון הסידן cytoplasmic תאיים הוא גודל 100 ננומטר, תוך הסידן organelles, כגון רשתית תוך-פלזמית, שלפוחית הפרשה וכן המיטוכונדריה, להגיע עד עשרות millimolars בריכוז. פעולה זו יוצרת סידן תלול יון ריכוז הדרגתי סדרי גודל מעבר ממברנות תאיים2,3,4,5,6,7,8 ,9. הרמה יון סידן חוץ-תאי הוא בערך 2 מ מ, ומכאן, וריאציות של ריכוז יון הסידן להתרחש ברמות חוץ-תאית, תאיים בשני. יתר על כן, האחרונות מחקרים מספקים ראיות זה יון סידן תאיים איתות האירועים ועל פעילות. עצבית יכולה להתרחש בתנאים של תנודות המקומי של ריכוזים של יון סידן חוץ-תאית, המציין את החשיבות מסונכרנים אינטרה - ו וריאציות של יון סידן חוץ-תאית10.

במטרה להבין את יחסי הגומלין בין יונים של סידן מחקר ביולוגי, בגישה סינתטי שבו קרום התא יליד מוחלפים השומנים bilayer שלפוחית יושם בהצלחה. חשיפת שלפוחית לפתרונות יון סידן מובילה לשינויים קבוצות ראש השומנים, אריזה שרשרת פחמימנים, מתח הממברנה מוגברת, צבירת שלפוחית, וכן ההפרדה של ליפידים ו קרום שלב המעבר11,12 ,13,14,15,16. המאפיינים של הממברנות השומנים בתגובה לחשיפה יונים של סידן נחקרו באמצעות טכניקות נסיוני כזה כמו רנטגן, 1H-NMR, מחקרים ספקטרוסקופיות או תרמודינמי11,16, 17 , 18. במחקרים אלה, ההרכב ממברנה מכוון לעיתים קרובות להידמות יליד קרום התא ומכיל כאלה שומנים פיזיולוגיים כמו phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS). נ. ב חשוב במיוחד כהכנה שלפוחית מלאכותי כי הוא מרכיב חיוני בתהליכים הסלולר רבים, כולל ממברנה תאיים סחר, אקסוציטוזה אפופטוזיס19,20.

לגודל ליפידים מסונתז שלפוחית נע לרוב בין ננומטר מספר מיקרומטר. בין שלפוחית שונים ההכנות, שלפוחית unilamellar ענק (כשמרוגזים), אשר הם מספר עשרות של מיקרון, יש חשיבות מיוחדת עקב גודלם גדולות יחסית, מקרוב הדומה הממדים של הפרט תאים21 , 22 , 23. האנשים שנגדם שטח זמין מאפשר את ההשפעה של מעברי צבע כימיים מקומיים על מאפייני biophysical ממברנה שילמדו. על ידי חשיפת רק חלק מן השטח ממברנה לגירויים חיצוניים, הדינמיקה קרום יכול מקרוב ייחקרו. לדוגמה, הוכח כי יישום מקומי של מעברי צבע כימית או pH השטח של האנשים שנגדם מוביל להיווצרות בליטות צינורי, אשר לא נצפו בצובר חשיפה24,25. ההבדלים שנצפו בהתנהגות ממברנה קוראים להמשך פיתוח שיטת החקירה יחיד-שלפוחית ערכות כדי לקבל כמה תובנות לגבי המנגנונים של איחוי קרום התא.

בונים על השיטות של microinjection ושל המיקרומניפולציה מ בתחילת המאה ה-2026,27, בקשר עם הפיתוחים האחרונים יותר של ערכות מניפולציה יחיד-שלפוחית ה28 של שנות האלפיים23, , מאמר זה מציג גישה בקרום אילו שיפוצים ועל היווצרות קרום צינורי בליטות (MTPs) בתוך הקרומית בוס נוצרים בתגובה יישום מקומי של יונים של סידן.

הגישה שלנו מנצל של שלפוחית מורכבים בהיקף של בוס מחובר עם שלפוחית multilamellar (קמפנילה MLV) כמו מערכת מודל ממברנה ביונים (איור 1 א'). קמפנילה MLV נדרש כמו מאגר השומנים למתחם לספק חומר השומנים הבוס במהלך חשיפה הדרגתי יון סידן. חיבור זה מאפשר המתחם לפצות על עליית מתח הממברנה במהלך שיפוץ המושרה ואת הצורה משתנה של קרום בוס ולספק ליפידים לצמיחה MTP. יתר על כן, קמפנילה MLV מקלה את הנייח משטח כי המאסה שלו הוא גדול יותר בהשוואה לזו של הבוס. מתחמי בוס-קמפנילה MLV, כאשר ותשמרו על גבי מצע מוצק, שימשו בעבר בייצור רשתות nanotube-שלפוחית, לומד פולימר-הממברנה האינטראקציה של מחקה את שלבי אקסוציטוזה29,30, מאוחר 31,32,33.

הפרוטוקולים הקודמים מנוצל תמצית ליפידים קוטביים סויה (SPE) להכין בוס-קמפנילה MLV מתחמי28. המהירות של הכדור הלבן מכיל תערובת של פוספוליפידים הכוללים PC (45.7%), PE (22.1%), phosphatidylinositol (PI, 18.4%), חומצה phosphatidic (PA, כ- 6.9%), תערובת של ליפידים אחרים (6.9%). בהפרוטוקול שלנו בזאת התערובת SPE הוא מסטול עם 20% של 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (מלח נתרן) (DOPS) כדי לחקות את העלון הפנימי של קרום פלזמה התא. 1% נוספים של אטו 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-סמים) משמש כדי להכתים את ליפידית כדי לאפשר פיקוח על שיפוץ ממברנה בעזרת מיקרוסקופ זריחה. האנשים שנגדם יש הרכב השומנים סימטרי לרוחב bilayer, נחשפים באופן מקומי 5 מ מ ריכוזי סידן כלורי (2CaCl). תנאים ניסיוני, עם ריכוז יונים סידן גבוהות, גם לחקות את העלון הממברנה החיצונית של מוות תאים, איפה מולקולות PS ביטוי34. היווצרות מתחמי בוס-קמפנילה MLV מחייב השימוש בשיטה שונה התייבשות-התייבשות שפותחה לראשונה על ידי קריאדו וקלר35. פרוטוקול הכנה שלפוחית כולל היווצרות שכבה יבשה השומנים, בו הוא משתמש כדי ליצור שלפוחית קטנה בפתרון. פתרון זה הוא לאחר מכן מיובש, ולמיומנות כדי ליצור את מתחמי בוס-קמפנילה MLV הסופי. איור 2A -D ממחיש את הפעולות הראשי עבור הכנת מתחם בוס-קמפנילה MLV טיפוסי.

לאחר השלמת הכנת שלפוחית שלפוחית מורכבים. הוא מרותק למיטה על המצע זכוכית, הטכניקה microinjection משמש כדי לספק כמויות קטנות של יונים של סידן העלעל החיצוני של הבוס דרך micropipette זכוכית פתוח-טיפ. הזרימה של תמיסת סידן הטיפ יוצר הדרגתי יון סידן מקומי על פני הממברנה בוס, המוביל אל קרום ואבו מהדור MTPs. MTPs הם שכיוונו הרחק מהמקור יון סידן ולגדול בתוך הבוס. המשקע MTP ניתן ישירות לנטר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות והקליט באמצעות מצלמה דיגיטלית. איור 3 מראה את הגדרת הניסוי נעשה שימוש לצורך ייצור את קרום הבנייה מחדש. היווצרות MTPs (2E איור , איור 4) ב פרוטוקול זה מדגים תוצאה מנוגדים ניסויים חשיפה של יון סידן לבצע בתנאי אחסון בצובר. בתנאים בתפזורת, האנשים שנגדם לקרע ויוצרים כתמים קרום כי יכול להיות שנצפו לדבוק משטח זכוכית25.

עוד פרטים על היווצרות את מתחמי בוס-קמפנילה MLV, כמו גם את ההליך כדי לבצע את microinjection של יוני סידן, מוסברים במאמר זה. הפרוטוקולים הם התמקדו בעיקר microinjection יון סידן; עם זאת, ניתן לשנות גישה זו בקלות לשימוש ללמוד את התגובות ממברנה עקב חשיפה מקומית יונים או חלבונים אחרים. בנוסף, ניתן לכוונן את ההרכב של השלפוחיות המוגלתיות כדי לבודד את התפקידים רכיב השומנים בתהליך שיפוץ ממברנה. פרוטוקול שהוצגו אינו דורש שום ציוד מתוחכם כדי לייצר את מתחמי בוס-קמפנילה MLV, מאופיין על ידי רמה גבוהה של הפארמצבטית.

Protocol

1. הכנת שלפוחית קטנה השומנים

  1. להכין פתרון של ליפידים SPE/DOPS/ATTO488-סמים ב כלורופורם עם מסה ערבוב יחס של 79/20/1.The הסופי ריכוז ליפידים ב כלורופורם הוא 1 מ"ג/מ"ל, המסה הסופית היא 0.6 מ ג (בדרך כלל פחות מ 1 מ ג). שימוש חד פעמי עגול התחתון צלוחיות זכוכית (סבב התחתון צינורות זכוכית, 10 x 75 מ"מ) בעת הכנת הפתרון השומנים ללא צעד קדם ניקוי.
    1. מילוי ולשטוף את מזרקים זכוכית (25 µL) עם הכלורופורם לפחות 5 פעמים לפני השימוש. מילוי ולשטוף את המזרק זכוכית לפחות 5 פעמים, 3-4 מ"ל של כלורופורם מספיקה.
      זהירות: כאשר טיפול כלורופורם, להשתמש זכוכית מזרקים, ולבצע כל ההליכים בשכונה fume בעת לבישת כפפות מתאימות, eyewear הגנה בכל עת. אל תשתמש כל צלוחיות פלסטיק, מזרקים או פיפטות בעת טיפול כלורופורם.
  2. לעטוף את המבחנה זכוכית המכיל את התערובת ליפיד עם רדיד המתכת כדי להגן על התוכן של תאורת להתאדות הממס ב המאדה עבור 3 שעות כדי להסיר את הכלורופורם, עם הלחץ להגיע ואקום 7 kPa ב 80 סל ד. סרט השומנים יבשים נוצר בתחתית המבחנה זכוכית לאחר אידוי (איור 2 א).
    הערה: שינוי גודל למעלה מספר פעמים של שימוש כמויות גדולות יותר של שומנים עשויה לדרוש זמן רב יותר רוטרי אידוי כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם.
  3. לאט לאט להוסיף 600 µL של פוספט buffered (PBS) מאגר תמיסת מלח (pH 7.8, ללא דילול) על גבי הסרט השומנים מיובשים. בעקבות התוספת של המאגר, בעדינות מוסיפים 6 µL של גליצרול על המדגם מפני התייבשות מלאה במהלך בוס-קמפנילה MLV היווצרות שלבים (להשגת ריכוז סופי של גליצרול של 1 wt %)36. חותם את המבחנה זכוכית באמצעות מצלמות-מיקרוסקופים ומכסים ברדיד מתכת כדי להגן מפני אור מקיף. מאחסנים במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: הפתרון מאגר PBS מורכב g 0.151 בבסיס Trizma, 1.592 g K3פו4, 1.021 g2פו ח'4, 0.062 גרם MgSO4 ·7H2O ו- g 0.0465 של EDTA ב- 250 מ של מים מטוהרים. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C, לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הסכום המקביל של 10 מ מ HEPES מאגר יכול לשמש במקום פתרון PBS. הפתרון מאגר HEPES מוכן על ידי דילול 1 מ' HEPES פתרון מניות עם מים מורתחים.
  4. למחרת, sonicate את המבחנה זכוכית המכיל את הפתרון 1 דקות באמצעות אמבט ultrasonication בטמפרטורת החדר. הסר את מצלמות-מיקרוסקופים, פיפטה עד נוצר פתרון אחיד מבחינה ויזואלית של שלפוחית קטנה השומנים (איור 2B). µL 30 aliquot של הפתרון שלפוחית שהושג השומנים קטן לתוך צינורות פלסטיק בודדות 0.5 מ. לשמור על אלה aliquots מניות ב-18 מעלות צלזיוס לכל היותר 6 חודשים.
    הערה: אם הפתרון שלפוחית קטנה השומנים אינה מבחינה ויזואלית אחיד, מערבולת הפתרון 4 פעמים עבור s 1-2 באמצעות מערבל מערבולת במהירות המרבית.

2. הכנת קומפלקסים בוס-קמפנילה MLV

  1. להפשיר לטמפרטורת החדר צינור פלסטיק המכיל של aliquot של ההשעיה קפוא של שלפוחית קטנה השומנים. מערבולת הצינור 4 פעמים במשך 1-2 s באמצעות מערבל מערבולת במהירות המרבית.
  2. מקום 5 µL של שלפוחית קטנה השומנים ההשעיה על פני תגית כיסוי זכוכית (24 x 60 מ מ) כדי ליצור קטן עגול droplet. השתמש תגית כיסוי זכוכית ללא שלבים טרום ניקוי.
  3. מקום בתגית כיסוי זכוכית desiccator ואקום (< 100 ואקום kPa) במשך 20 דקות.
  4. לאחסן את הסרט השומנים מיובשים בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות, ואז לאט לאט פיפטה µL 50 מאגר HEPES 10 מ מ על גבי הסרט השומנים יבש על התייבשות. המתן 5 דקות מראש ליצור את מתחמי בוס-קמפנילה MLV (איור 2C).
  5. מרכז החלקה כיסוי זכוכית על הבמה מיקרוסקופ, פיפטה 300 µL HEPES מאגר על זה ואז למקם במרכז ה-droplet מעל המטרה (איור 3B).
  6. להעביר את µL 50 של הפתרון בוס-קמפנילה MLV הקבועים מראש לתוך הפתרון HEPES (300 µL). לחכות 25 דקות כדי לאפשר בנויה בדלילות מתחמי בוס-קמפנילה MLV לדבוק בחוזקה פני השטח של תגית כיסוי זכוכית (איור דו-ממדי).
    הערה: לעיתים, מתחמי בוס-קמפנילה MLV לא יוצרים על תגית כיסוי זכוכית, במקום השומנים טלאים או רק MLVs הם נצפו. זו יכולה להיות מוסברת ע י בשוגג ניעור של המדגם במהלך השלבים מחזורים ההקפאה-הפשרה 2.4 2.6 או רבים של המתלה שלפוחית קטנה. חזור על שלבים 2.1-2.6 או להשתמש בפתרון מניות השומנים הטרי (שלב 1.1) כדי להשיג את מתחמי בוס-קמפנילה MLV.

3. micropipette והכנה Microinjection

  1. מסביב. לקצוות של הנימים זכוכית בורוסיליקט על-ידי הצבת בעדינות את נימי מסתיים בלהבת נר כדי למנוע את micropipette נשברים תוך כדי לצרף אותו בעל micropipette.
  2. למשוך לפחות 3 נימים זכוכית באמצעות של פולר לייזר אוטומטית באמצעות ערכת התוכנית: חום = 400, Fil = 4, ול = 50, דל = 225, דופק =; חום = 400, Fil = 4, ול = 60, דל = 150, דופק = 120. ערכת התוכנית להזין את הערך הראשון של הברווזים נשאר ריק. באמצעות זכוכית בורוסיליקט נימים של הקוטר הפנימי (ז) מ מ 1.00 ותוצאות הקוטר החיצוני (יתר) 0.78 מ מ micropipette עם חור טיפ של 0.3 מיקרומטר בקוטר.
  3. מילוי חוזר כל micropipette עם µL 8 של 5 מ מ פתרון2 CaCl מאגר HEPES (10 מ מ) באמצעות microloader של. לסנן את הפתרון2 CaCl באמצעות של 0.2-0.5 מיקרומטר מסנן המזרק לפני השימוש כדי למנוע סתימת של קצה פיפטה.
    הערה: ודא כי CaCl2 הוא מומס לחלוטין הפתרון מאגר HEPES, אשר משמש גם עבור השלבים 2.4-2.6.
  4. להתחבר בעל micropipette micromanipulator. בעיא micropipette את המחזיק micropipette בחוזקה. מחברים את משאבת הזרקה בעל נימי באמצעות הצינור האספקה.
  5. התחל את משאבת הזרקה. להתאים את ההגדרות משאבת הזרקה כדי 20 hPa (הזרקה בלחץ) ולהגדיר hPa פיצוי 5 של, לחץ על מצב אוטומטי. השהה את משאבת הזרקה עד micropipette יהיה מוכן לקבל microinjection.
  6. הגדרת המיקרוסקופ למצב brightfield. להגדיר אותו לקבלת ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC). מטרות השימוש 63 X או 100 X גבוה NA (1.3) כדי להשיג את הרזולוציה קצה ממברנה אופטימלית.
  7. השתמש את micromanipulator גס כדי למקם את micropipette מעל ה-droplet המכיל את מתחמי בוס-קמפנילה MLV. אתר קצה micropipette מעל המטרה.
  8. להתמקד המיקרוסקופ נקודת האמצע של המתחם בוס-קמפנילה MLV ומקדו ואז כ 50 מיקרומטר מעל הבוס. השתמש במצב גס של micromanipulator בעדינות להכניס את micropipette המוקד.
  9. לעבור micromanipulator את המצב בסדר גמור. לאט לאט למקד מחדש על פני השטח בוס תוך כדי לתרגם את הטיפ micropipette למטה ולשמור את הטיפ בפוקוס. מקם את מיקרומטר עצה כ 20 micropipette מפני השטח בוס. אם הקצה micropipette נשברה עקב מגע עם תגית כיסוי זכוכית (בדוגמה באיור 5B), להחליף מיד כדי למנוע שחרור יון סידן מיותרים בתוך תמיסת בצובר הדגימה.

4. גיבוש, תרגום של MTPs באמצעות מקור יון סידן

  1. הגדר את המיקרוסקופ למצב זריחה. הגדר dichroics כדי לרגש-488 ננומטר לזהות הפליטה-505-550 ננומטר.
  2. . הפעילי את משאבת הזרקה ולהתחיל את הזריקה יון סידן. השתמש במצב בסדר של micromanipulator, לאט לאט מתקרבים הבוס עם קצה micropipette. מקם את הטיפ micropipette ממרחק של 3 מיקרומטר מהמשטח קרום תוך הזרקת הפתרון2 CaCl מ micropipette כדי לאפשר MTPs לטופס (איור 4).
  3. לתרגם את MTPs לאורך פני השטח בוס, לאט הניעו את הטיפ פיפטה (עם מהירות של 0.1-0.3 מיקרומטר/s) סביב הבוס לפני השטח באמצעות את micromanipulator בסדר (איור 6). לשמור על באותו המרחק (3 מיקרומטר) בין פני השטח בוס הטיפ micropipette בניכוי הזריקה יון סידן.
    הערה: במחירים גבוהים תרגום של קצה micropipette (מעל 0.7 מיקרומטר/s), MTPs לא תעבור בו זמנית עם micropipette. במקום זאת, הם פיזור, לקצר, בעוד MTPs חדש ייווצר במקום החדש של קצה micropipette (איור 7).
  4. כדי להפסיק את microinjection, לבטל את משאבת הזרקה והזז את micropipette מהמשטח בוס.

תוצאות

בעבודה זאת, נדגים היצירה של בוס-קמפנילה MLV מתחמי איך הם יכולים לשמש כדי להבהיר את ההשפעה של מעברי צבע יון סידן על קרום התא דינמיקה. צמוד-השטח מתחמי בוס-קמפנילה MLV נדרשים עבור ניסויים אלה לאפשר לחקות בגודל תא קבוע בזמן הקמת הדרגתי של יונים דרך microinjection. קרום בוס מגיב ריכוז הסידן לשפות אחרות דרך היווצרות MTPs ביים הרחק מהמקור יון סידן. יתר על כן, MTPs יכול להיות מתורגם סביב הבוס באופן ללא מגע על-ידי הזזת הטיפ micropipette סביב פני הממברנה.

איור סכמטי של ההליך הכנה בוס-קמפנילה MLV מוצג באיור2. למרות בפרוטוקול שהוצגו, מתחמי בוס-קמפנילה MLV כבר מראש נוצרות במהלך שלב 2.4 (איור 2C), העברת הפתרון שלפוחית אחר-300 µL droplet מאגר (שלב 2.6 לפרוטוקול) מאפשר את מתחמי בוס-קמפנילה MLV בנויה בדלילות כדי מספיק לדבוק המצע זכוכית. בדרך זו, נוצר קומפלקס מתאימים עבור המיקרומניפולציה ו- microinjection (איור דו-ממדי). לעיתים, האנשים שנגדם להכיל אחד או כמה השומנים כלואה שלפוחית, אשר אינם משפיעים על היווצרות MTP, כפי שמוצג באיור 4A. אלה האנשים שנגדם לייצר MTPs; עם זאת, עלולים להיות חסומים ההדמיה אם השלפוחיות המוגלתיות כלואה גדולים. הרוב המכריע של האנשים שנגדם מוכן (עד 75%) מופיעים המיספרי, מחוברים את MLVs, כפי שמוצג באיור 1A. אלה שלפוחית המוקד העיקרי של פרוטוקול זה, מתאימים ההליך microinjection. 25% האנשים שנגדם הנותרים מופיעים גלית (איור 1B), וזה מעיד על משטר מתח הקרום התחתון. שלפוחית גלית אלה מאפשרים גם להיווצרות בליטות צינורי; עם זאת, הם מציגים קינטיקה שונה, של מורפולוגיה שונה של MTPs יצרו, אשר מעבר להיקף זה פרוטוקול25. הקוטר טיפוסי של השלפוחיות המוגלתיות מוכן משתנה בין 2-15 מיקרומטר עבור MLVs, ובין 2-40 µm עבור האנשים שנגדם. הבוס אופטימלית גודל החשיפה יונים של סידן הוא 5 מיקרומטר או גדול יותר.

Micropipettes שימשו במזימות זמרת-תא החקירה באותה מידה כמו נהלים המחייבים מניפולציה של האנשים שנגדם סינתטי במשך עשרות שנים מספר37,38. הרוב המכריע של יישומים אלה מעורבים מגע פיזי ישיר בין micropipette את פני השטח של תאים או שלפוחית. דוגמאות כוללות את שיטת תיקון-קלאמפ או משיכת ממברנה היתדות של קרום בוס, בנוסף בניית nanotube-שלפוחית רשתות23,28,39. לאחרונה, micropipettes גם שימשו ליצירת מעברי צבע מקומי של יונים ומולקולות סביב האנשים שנגדם לשחזר הטרוגנית תא microenvironments24,25. בפרוטוקול שהוצגו, micropipette בתפקודה (איור 5A) מהווה גורם מכריע להקמת הדרגתי יון סידן על פני גב על ידי שחרור הפתרון מוכלת. מיקום micropipette על פני גב נכונה והימנעות קשר עם קרום השומנים חיוניים microinjection מוצלח. הטיפ micropipette מתקיים במרחק של-3 מיקרומטר מהמשטח בוס, אשר מרחק אופטימלי ליצירת MTPs תוך מחקה וריאציות של סידן בקרבת קרום התא. אם הקצה micropipette הוא בטעות שבור (איור 5B), תחליף נדרש. טווח של CaCl ריכוז שנבדקו בעבר2 בתוך micropipette, אשר מאפשר היווצרות MTP, הוא בין 2 ל 5 מ מ25, התואם ריכוזי סידן חוץ-תאית. ריכוז נמוך יותר של2 CaCl, קרי, 1 מ מ, אין MTPs שנצפו.

היווצרות MTPs על microinjection סידן מתחיל עם היווצרות קרום קטן invaginations, אשר לגדול לתוך MTPs באתר של החשיפה (איור 4B). MTPs ממשיכים לגדול כל עוד שרידי קרום גב חשוף של היונים של סידן. הם משתנים, הצבע הרחק מהמקור יון סידן (איור 4C, 1 הסרט משלים). כאשר אספקת יון סידן מסתיימת, MTPs פיזור על פני בוס, ולכן קשה להסיק אם MTPs נשארים או ובסופו של דבר נעלמים.

ניתן להסביר את היווצרות MTPs יון סידן מקומי איגוד העלעל החיצוני החשוף של קרום בוס, ומפעילה עקמומיות ספונטנית (m), אשר משויך ישירות היווצרות ספונטנית מתח σ = 2κm2 (Κ הוא הנוקשות כיפוף), זה לגרום כיפוף של הקרום ויוצרים MTPs פנימה. בדו"חות קודמים הראו כי דפורמציה של הקרום יכול להיות מנומקת על ידי עיבוי ו/או קיבוץ באשכולות של ליפידים טעונים שלילית על מחייב יוני הסידן למוח, והתוצאה שלילית עקמומיות ספונטנית40. לחלופין, הכריכה חזקה של Ca2 + על פני השטח של bilayer טעונים שלילית מנטרל את צפיפות מטען משטח של העלעל bilayer השומנים חשוף. זה מוביל ההבדל צפיפות מטען על פני bilayer, וכתוצאה מכך שונה מאפס עקמומיות ספונטנית, מספיקה כדי לכופף ממברנה25.

היווצרות שנצפה MTPs מדגים רגישות של ממברנות השומנים כדי יונים של סידן, ומציע גישה ללא מגע מוזרה לייצור מבנים צינורי ממברנה. שחקרתי את המקור של tubulation קרום זה יכול להיות חשוב להבנת הדינמיקה של קרום צורה משתנה במהלך תא פונקציות שונות, תא שינוי צורה, יכול להיות מועיל עבור צובר תובנות הארגון השומנים בתוך התא ממברנות.

התצפיות MTPs נוצרים תמיד באתר קרום בתהליך חשיפה יון סידן. לפיכך, על ידי בחירת המיקום של קצה micropipette, אפשרי להגדיר את האזור של המשטח בוס לצמיחה בליטה. הבא, אם micropipette הוא לאט לאט (0.1-0.3 מיקרומטר/s) עבר סביב השטח בוס, תוך שמירה על המרחק ההפרדה בין הקרום, MTPs מתורגמים במשולב עם micropipette. איור 6 ו Supplementary המתאימים את הסרט 2 להדגים כזה ההעברה של MTPs למשטח בוס. תהליך זה צפוי להיות מלווה היווצרות MTPs חדש על הזרקת יון סידן רציפה25. במחירים תרגום גבוהה (מעל 0.7 מיקרומטר/s), MTPs אינם מסוגלים לעקוב את הטיפ micropipette. במקום זאת, בליטות חדשות נוצרות במקום החדש של קצה micropipette (איור 7).

נצפתה סידן ללא מגע מונחה יון התרגום של MTPs סביב בוס יכול משטח נוסף הבנתנו הנהיגה כוחות מאחורי הדינמיקה של מבנים צינורי ממברנה בתוך תאים. יתר על כן, גישה זו מציע מצב ללא מגע הרומן לשליטה התעבורה של חומר במערכות חומר רך באמצעות מעברי צבע כימי.

figure-results-6219
איור 1 : תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי נציג של מתחמי בוס-קמפנילה MLV ותשמרו על פני השטח של תגית כיסוי זכוכית- (א). דוגמא בוס כדורית. הבוס מופיע בדמות האונה המצורפת של קמפנילה MLV. (ב)-דוגמה בוס גלית. החצים השחורים מצביעים על האזורים המעוות של הקרום. התמונות משופרת, הפוכה כדי לשפר את החזיית בקרום בוס fluorescently עם תוויות. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6915
איור 2 : איורים סכמטי של הכנת בוס-קמפנילה MLV וערכות microinjection. (א)-שכבה השומנים יבשים נוצר בתחתית המבחנה זכוכית בשל התאדות רוטרי כלורופורם מהפתרון השומנים. (ב)-השכבה ולמיומנות השומנים הוא sonicated, שלפוחית קטנה השומנים נוצרות. (ג)-droplet קטן של הפתרון שלפוחית (5 µL) הוא הניח על פני השטח של תגית כיסוי זכוכית והעבירו לתוך desiccator עבור 20 דקות כדי מייבשים את הפתרון השומנים ויוצרים סרט השומנים יבש (שלב זה לא מוצג). Rehydrating את הסרט השומנים יבש עם 50 µL של בופר מייצרת את מתחמי בוס-קמפנילה MLV הקבועים מראש. (ד)-העברת מתחמי הקבועים מראש כדי נפח גדול יותר של מאגר תוצאות על היווצרות בוס מופרדים בדלילות-MLVs מצורף אל פני השטח של תגית כיסוי זכוכית. (ה)-מיקום של micropipette קרוב לפני השטח של הבוס ושחרור של יוני הסידן מפעילה את היווצרות MTPs. האיורים לא נמשכים לקנה המידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8039
איור 3 : הגדרת הניסוי עבור microinjection של יוני סידן. (א). הרכיבים של ההתקנה ניסיוני הנדרש להפקת את MTPs ב- בסדר?. (ב). פרטים של ההתקנה microinjection. Coverslip זכוכית עם הפתרון של מתחמי בוס-קמפנילה MLV להציב על הבמה מיקרוסקופ. הזווית בין micropipette את פני השטח של תגית כיסוי זכוכית היא 30 מעלות (מסומן בלבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8693
איור 4 : היווצרות MTPs על microinjection יוני הסידן על פני השטח של הבוס. (א)-מתחם בוס-קמפנילה MLV לפני חשיפה הדרגתי יון סידן. החץ מצביע על השומנים שלפוחית לכודים בתוך הבוס, אשר לא להכשיל את ההתבוננות MTPs. (B). MTPs קטן נוצרות על microinjection יוני הסידן (5 מ מ ריכוז של CaCl2 micropipette). (ג). צמיחת MTPs בתגובה לחשיפה רציפה יונים של סידן. הדימויים פלורסצנטיות משופרת, הפוכה למטרות הדמיה. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-9468
איור 5 : זכוכית המשמש microinjection יון סידן micropipettes. (א). דוגמא micropipette בתפקודה. (ב)-דוגמה micropipette שיש לו טיפ שבור (האזור הפגוע מזוהה עם חץ שחור). גם תמונות משופרת, הפוך עבור כדי שתראי טוב יותר. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10052
איור 6 : תרגום מונחה יון סידן של MTPs סביב השטח של הבוס. (א)-MTPs נוצרים על פני בוס על microinjection של 5 מ מ2 CaCl פתרון. (בג). תרגום של קצה micropipette (0.2-0.3 μm/s) סביב הקרום השטח מפעילה תנועת MTPs בכיוון של המקור יון סידן. החצים השחורים לסמן את הכיוון של התנועה micropipette. התמונות משופרת, הפוכה לשיפור הדמיית ממברנה. סרגל קנה מידה מייצג 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10762
איור 7 : MTPs בקצב גבוה תרגום של קצה micropipette. (א)-MTPs נוצרים על פני בוס על microinjection של 5 מ מ2 CaCl פתרון (קו לבן). (בג). קצב התרגום גבוהה של micropipette סביב המשטח בוס (μm 1/s) גורמת להיווצרות של MTPs חדש במקום החדש של קצה micropipette (קו בצבע ארגמן), כמו גם פיזור של MTPs בעבר יצרו (קו לבן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-11419
משלים סרט 1: היווצרות של MTPs בבוס עם חשיפה לשפות אחרות ל- Ca 2 + מעבר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה. 

figure-results-11831
הסרט משלים 2: סידן מונחה יון MTP ההעברה למשטח בוס.   אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה. 

Discussion

מערכות תאים ביונים מאפשרות לחקר התנהגות קרום על החשיפה לגירויים חיצוניים כמו יונים, חלבונים או חלקיקים. בסדר, פרנקי, כזה דוגמנית יכול להגיב על שינויים בסביבה כימית על-ידי התאמת הצורה שלהם, אשר כרוך לעתים קרובות היווצרות של הכרישים מבנים, invaginations24,41,42,43 .

מאמר זה מציע גישה ליצירת MTPs באופן ללא מגע באמצעות עיצוב מחדש של המשטח בוס על הזרקת המותאמות לשפות אחרות של יוני סידן על פני גב. הפרוטוקול מתאר את הכנת המתחם בוס-קמפנילה MLV, אשר מחקה פלזמה קרום התא, כמו גם איך להעסיק טכניקה microinjection ליצירת סידן מעברי צבע יון קרוב הבוס לפני השטח לטופס MTPs. הרוב המכריע של מחקרים קודמים ניסיוני ממוען סידן יון-הממברנה אינטראקציות חשוף השומנים שלפוחית בכמות גדולה14,ריכוז יון הסידן17. בהתאם לתנאי הניסוי, חשיפה בכמות גדולה עלול לגרום לתגובה ממברנה שונים אין בליטות צינורי נוצרו25.

היווצרות מתחמי בוס-קמפנילה MLV פשוטה למדי ודורש רק ציוד מעבדה סטנדרטיים, כגון המאדה, באמבט אולטרא, desiccator ואקום. עדיין, ישנם מספר שלבים קריטיים לשקול במהלך הכנת שלפוחית. חשוב להבטיח התייבשות של השלפוחיות המוגלתיות הושלם (במהלך שלב 2.3 לפרוטוקול) סרט יבש השומנים מעגלית המכיל רק כמות קטנה של גבישי מלח נוצרת על פני השטח של תגית כיסוי זכוכית. במהלך הניסוי, זהיר של הפתרון שלפוחית, באמצעות פתרון מניות השומנים טריים כלורופורם, כמו גם מאגר HEPES טריים, חיוני עבור הכנת מתחמי בוס-קמפנילה MLV מוצלחת. יתרה מכך, מצורף מאובטח של המתחם בוס-קמפנילה MLV השטח מכסה זכוכית חיונית המיקרומניפולציה ו- microinjection. כדי לוודא היצמדות נאותה הבוס-קמפנילה MLV מורכבים, micropipette (ללא הזרקת flow) ניתן לדחוף בעדינות כנגד פני השטח בוס. שלפוחית מודבקת בחוזקה לא תחליק על פני בעת מגע פיזי ישיר. בגלל הניסויים מבוצעות ב- droplet המאגר פתוח, אשר עשוי להיות נחקר במשך מספר שעות, אידוי חייב להילקח בחשבון. התאדות מפני ה-droplet מאגר תשנה את התנאים osmotic, אשר יכול להשפיע על יציבות השלפוחיות המוגלתיות. כדי לשחזר את התנאים osmotic, הוספת כתב-העת טהור מים לדוגמה כדי לשחזר את אמצעי האחסון המקורי חוזר המערכת הומאוסטזיס.

בעת שינוי בהרכב הממברנה השומנים, חשוב כי השלפוחיות המוגלתיות מיוצרים בצורה של מתחם בוס-קמפנילה MLV כי קמפנילה MLV מאפשר העברת החומר השומנים הבוס במהלך, ממברנה העיצוב מחדש. מחקרים קודמים הראו כי החלפת הרכיבים של התערובת SPE ליפידים טהור, או הוספת 5-30% של כולסטרול, מאפשר גם בוס-קמפנילה MLV היווצרות מורכבות28,44. הרוב המכריע של האנשים שנגדם מוכן הם unilamellar45.

יתר על כן, כאשר בדיקות אחרות קטיונים דו ערכיים, כגון יוני מגנזיום, היווצרות MTPs בכבדות תלויה הנוכחות של DOPS טעונים שלילית בתערובת השומנים. בלי DOPS, MTPs בצורה לא השלפוחיות המוגלתיות שמתואר פרוטוקול זה. כמו כן, קטיונים monovalent, כגון אשלגן, נתרן, התוצאה אינה היווצרות MTPs, אפילו בתוך שלפוחית המכילה DOPS25.

בנוסף לשלבים הקריטיים לגבי הכנה ומניפולציה של האנשים שנגדם, ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון במהלך ההליך microinjection. Microinjection מוצלח יוני הסידן בכבדות מסתמך על מתפקד כראוי זכוכית micropipettes, אשר מוכנים ביום של הניסוי. ישנם מספר גורמים שעלולים לגרום את micropipette לכשלים. סיבה נפוצה היא פתיחה עצה סתומות. חלקיקים קטנים השומנים, שהם תוצרי לוואי של הכנת שלפוחית, מפוזרים בפתרון, נוטים לדבוק הטיפ micropipette, ובכך יוצר של סתימת. ניקוי הטיפ פיפטה נעשית ע י מרימים אותו מהפתרון שלפוחית והצבתו בחזרה קרוב לפני השטח בוס. השימוש בפונקציה מכריע של המשאבה microinjection יש להמנע כי התוצאה היא הזרקת מסיבית של יוני הסידן בתוך תמיסת בצובר. יתר על כן, בועות אוויר קטנות לכודים בפנים micropipette למנוע microinjection הנכון, שבו במקרה micropipette צריך להיות מוחלף עם אחד חדש. עצה שבירה ניתן למזער באופן משמעותי על-ידי הצבת את הגדרת הניסוי על שולחן כדי למזער את הטיפ תנודות רטט וגלים.

יתר על כן, הטיפול צריך להילקח בעת בחירת לסכימת תצפית, כדי למזער את photobleaching בזמן קבלת את התמונות הטובות ביותר זמן לפתור. מיקרוסקופיית שדה רחב לייזר המושרה פלורסצנטיות היה מנוצל פרוטוקול זה כי זה מאפשר קצב רכישת תמונה גבוהה יחסית בעומק בדיקה אובייקטיבית מוגבלת. יתר על כן, השימוש במיקרוסקופ הפוכה מאפשר microinjection בו זמנית והתבוננות של השומנים שלפוחית, MTPs.

אחת המגבלות העיקריות של השיטה הציג היא הדרישה של עבודה ידנית נרחב ומיומנויות המיקרומניפולציה מספיקות. כי מתחמי נוצרות בתהליך נפיחות ספונטנית, שלא ניתן לשלוט בגודל של האנשים שנגדם ו- MLVs. בנוסף, פרוטוקול זה אינו מאפשר לשליטה של המתח ממברנה של מתחמי בוס-קמפנילה MLV מוכן, אשר עשוי להיות נחוץ לאסוף פרטים נוספים לגבי קרום שיפוץ. האנשים שנגדם אתה מחובר MLVs החומר האחרון השומנים המספקת לצמיחה משמעותית של MTPs במידה זה יהיה בלתי אפשרי להשיג אך ורק ניצול זמין החל האנשים שנגדם הקרום. MLVs גם לתרום להורדת כל הווריאציות לרוחב מתח בתוך בוס-קמפנילה MLV מורכבים44, אשר מסבך את הניסיונות כדי לשלוט המתח של שלפוחית באמצעות שאיפה micropipette. מודל זה מבוסס על בוס-קמפנילה MLV לספק מתח נמוך המחקה כדאי המשטרים המתח נמצאו במבנים הממברנה התאית מחובר ממברנה מאגרים, כמו קרום הקפלים ואת invaginations46. במקביל, הטכניקה השאיפה micropipette ניתן להחיל בהצלחה כדי לשלוט מתח הממברנה כשמרוגזים יחיד. לדוגמה, עבודה מאת גרבר. ואח מסופקים פרטים על היווצרות קרום invaginations צינורי ב כשמרוגזים יחיד על איגוד יוני הסידן הקרום-תנאים בכמות גדולה מן המתח מגוון משטרים40. לבסוף, השוואת התנהגות ממברנה-חשיפה מקומיים והן בתפזורת סידן מחייב שליטה משופרת של הדבקה קרום על פני השטח, אשר מעבר להיקף של פרוטוקול זה.

לסיכום, הטכניקה המוצע מאפשר ממברנה ללא מגע שיפוצים ועל היווצרות MTPs על גירוי מקומי עם יונים של סידן. יישומים עתידיים של מרכז זה שיטה על תרגום ממערכות שלפוחית סינתטי מחקר ביולוגי מקורי, כגון תאים מגדלים פורחים. יכול להיות משולב עם ערכות תא בודד חקירה אחרים, כגון תיקון-קלאמפ או microelectrode amperometry, או בשילוב עם השיטה המוצעת מקומי חימום אסטרטגיות31,47,48. בוחן את ההשפעה של יונים או מולקולות אחרות היא פשוטה וכרוכה פשוט החלפת היונים של סידן עם המולקולות של עניין. יתר על כן, יכול להיות מיוצר השומנים סינתטיים מורכבים שלפוחית דרך הממברנה functionalization עם חלבונים transmembrane, אשר עשוי להרחיב את ההבנה שלנו ביופיזיקה של התא לעיצוב מחדש של קרום התא דינמיקה המשויך חישה של המקומיים מעברי צבע כימי. ואחרון אחרון חביב, גם יכול להיות מתורגם ללא מגע גירוי של קרום השומנים למערכות פולימריות חומר רך, המציע בסיס פלטפורמה הרומן מניפולציה ללא מגע.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Soy bean polar lipid extractAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		541602C100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPSAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		840035C1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)ATTO-TEC (Germany)AD 488-311 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)Sigma Aldrich (Missouri, USA)20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/packCorning Incorporated (Corning, NY 14831)99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizerSigma Aldrich (Missouri, USA)650498-1L-D
Rotary evaporatorBüchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mmKEBO lab (Sweden)MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISOSharlau Chemie S.A. (Spain)P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%Sigma Aldrich (Missouri, USA)S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%Sigma Aldrich (Missouri, USA)G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%Sigma Aldrich (Missouri, USA)T-1503 2050 g
Trizma baseSigma Aldrich (Missouri, USA)P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)5886
MgSO4Merck (USA)34549-100 g
EDTASigma Aldrich (Missouri, USA)H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell cultureSigma Aldrich (Missouri, USA)Z260282-1PAK24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μmSigma Aldrich (Missouri, USA)631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slipVWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccatorVacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bathBandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixerLabnet International (USA)
488 nm laser line Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopesLeica (Germany)12847995 
Inverted fluorescence microscopy system Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)Technologies GmbH (Thuringia, Germany)300038
PatchStar MicromanipulatorScientifica (Uckfield, UK)612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf FemtojetEppendorf (Germany)

References

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?. Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137microinjection

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved