JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем технику для бесконтактных микроманипуляции везикулы, используя локализованные кальций иона градиентов. Микроинъекции раствора ионов кальция, вблизи гигантских липидов везикул, используется для того чтобы remodel липидов мембраны, что приводит в производстве мембранных трубчатых выступов.

Аннотация

В широкий спектр основных клеточных процессов, как оборот мембраны и апоптоз клеточной мембраны форму переходы происходят одновременно с местные различия в концентрации ионов кальция. Были выявлены основные молекулярные компоненты, участвующие в этих процессах; Однако, конкретные взаимосвязи между градиентов ионов кальция и липиды внутри клеточной мембраны гораздо менее известно, главным образом из-за сложного характера биологических клеток и трудно систем наблюдения. Для преодоления этого разрыва, синтетический подход успешно реализуется раскрыть локализованные влияние ионов кальция на имитирует клеточной мембраны. Создание мнемосхемы напоминают условия в ячейке является severalfold проблемой. Во-первых для захвата физические свойства клеток требуется адекватного biomimetic модель с соответствующие размеры и состав мембраны. Во-вторых микроманипуляции установки требуется доставить небольшое количество ионов кальция в частности мембраны место. Наконец для обнаружения и записи отклика липидные мембраны к внешней стимуляции требуется схема наблюдения. Эта статья предлагает подробный biomimetic подход для изучения взаимодействия Ион мембраны кальция, где липидов везикул система, состоящая из гигантских однослойных везикул (GUV), подключенных к multilamellar везикул (МЛВ), подвергается локализованных кальция градиент формируется с помощью системы микроинъекции. Динамика ионного воздействия на мембрану были наблюдается с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны на видео кадров. В результате стимуляции мембраны высоко изогнутые мембраны трубчатых выступы (ССП) формируется внутри GUV, ориентированные от мембраны. Описанный подход вызывает Ремоделирование липидные мембраны и ССП производства полностью бесконтактных и контролируемым образом. Этот подход представляет средства для решения детали кальция Ион мембраны взаимодействий, предоставляя новые возможности для изучения механизмов перестройки клеточной мембраны.

Введение

Роль ионов кальция в биологических процессов, специально их причастности к сигнализации, клеточного деления и синтеза мембранных, находится в центре внимания многих механистический исследований1. Концентрация ионов внутриклеточных цитоплазматического кальция составляет порядка 100 Нм, в то время как кальция в органеллы, например эндоплазматического ретикулума, секреторные пузырьки и митохондрии, достигнуть уровня до десятки millimolars в концентрации. Это создает крутой кальция ионный градиент концентрации порядков через внутриклеточные мембраны2,3,4,5,6,7,8 ,9. Внеклеточным кальцием Ион уровень составляет около 2 мм, и следовательно, вариации концентрации ионов кальция происходят на внеклеточные и внутриклеточных уровнях. Кроме того последние исследования подтверждают что внутриклеточный кальций иона сигнализации событий и активности нейронов может произойти в условиях местные колебания концентрации ионов внеклеточным кальцием, указывая значение синхронизации внутри - и внеклеточной кальций иона вариации10.

Стремясь понять взаимосвязь между ионами кальция и биологических мембран, синтетический подход, в котором родной клеточных мембран заменяются липидного бислоя везикулы была успешно выполнена. Разоблачение везикулы решения ион кальция приводит к изменениям в голову групп липидов и углеводородной цепи упаковки, мембрана повышенной напряженности и везикул агрегации, а также сегрегации липидов и мембранный этап перехода11,12 ,13,14,,1516. Исследованы свойства липидные мембраны под воздействием ионов кальция, с использованием таких экспериментальных методов как рентген, 1H ЯМР и спектроскопические или термодинамические исследования11,16, 17 , 18. в этих исследованиях, состав мембраны настраивается часто напоминают родной клеточных мембран и содержит такие физиологические липиды как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламина (PE) и фосфатидилсерина (PS). PS особенно важна в подготовке искусственных везикул потому, что он является важным компонентом во многих клеточных процессах, включая торговлю внутриклеточные мембраны, экзоцитоз и апоптоз19,20.

Размер синтезируемых липидов везикулы часто колеблется от нанометров до нескольких микрометров. Среди различных везикул препаратов, гигантские однослойных везикул (GUVs), которые являются несколько десятков микрометров в диаметре, имеют особое значение из-за их сравнительно большого размера, напоминающий размеры отдельных клеток21 , 22 , 23. имеющаяся площадь поверхности GUVs позволяет влияние местных химические градиенты на мембраны биофизических свойств, чтобы быть изучены. Подвергая только частью поверхности мембраны на внешние раздражители, мембраны динамика могут расследоваться более тесно. Например было показано, что локализованные применение химического или рН градиентов к поверхности GUVs приводит к образованию трубчатых выступы, которые не наблюдались в основную экспозицию24,25. Наблюдаемые различия в поведении мембраны требуют дальнейшего развития метод допроса одного везикул схем получить некоторые идеи в механизмы клеточной мембраны ремоделирования.

Опираясь на методы микроинъекции и микроманипуляции от ранних 1900-х26,,27, в связи с более последними достижениями сингл везикул манипуляции схем х23,28 , эта статья представляет собой подход, в котором мембраны ремоделирования и формирование мембранных трубчатых выступы (ССП) в мембране GUV создаются в ответ на местном применении ионов кальция.

Наш подход использует везикул комплекс, состоящий из GUV подключен к multilamellar везикул (МЛВ) как biomimetic мембраны модель системы (рис. 1A). MLV требуется как резервуар липидного комплекса на поставку материала липидов в GUV во время воздействия на градиент ион кальция. Эта связь позволяет комплекс компенсировать рост напряженности мембраны при индуцированных ремоделирования форма перехода GUV мембраны и липиды для MTP роста. Кроме того, МЛВ облегчает поверхности иммобилизации, потому что его масса увеличивается по сравнению с GUV. GUV-MLV комплексы, когда иммобилизованных на твердом субстрате, ранее использовались для производства нанотрубок везикул сетей, изучение взаимодействия полимерные мембраны и подражая поздних стадиях экзоцитоз29,30, , 3132,33.

Предыдущие протоколы использовались сои экстракт полярных липидов (SPE) подготовить GUV-MLV комплексы28. SPE состоит из смеси фосфолипидов, которые включают PC (45,7%), PE (22,1%), фосфатидилинозитол (PI, 18,4%), фосфатидной кислоты (ПА, 6,9%) и смесь других липидов (6,9%). В настоящем документе нашей протоколе, смеси SPE легированного 20% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (натриевая соль) (DOPS) имитировать внутреннюю листовка плазматической мембраны клеток. Дополнительно 1% Атто 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-ДОПИНГ) используется для пятно липидного бислоя чтобы включить мониторинг реконструкции мембраны, с помощью микроскопии флуоресцирования. GUVs имеют симметричные липидного состава через бислоя и локально подвергаются 5 мм концентрации хлористого кальция (2CaCl). Такие экспериментальные условия, с концентрацией ионов кальция повышенной также имитировать внешней мембраны листовка apoptotic клеток, где молекулы PS, выраженной34. Формирование комплексов GUV-MLV требует использования метода модифицированных регидратации обезвоживания, первоначально разработанный КРИАДО и Келлер35. Везикул подготовка протокола включает в себя формирование сухой липидного слоя, который затем используется для формирования мелких пузырьков в растворе. Это решение затем обезвоживается и Регидратированные сформировать окончательный GUV-MLV комплексов. Рисунок 2A -D иллюстрирует основные шаги для подготовки типичного комплекса GUV-MLV.

После завершения подготовки везикул и комплекс везикул иммобилизованных на стеклянной подложке, микроинъекции техника используется для доставки небольшое количество ионов кальция к внешней листовка GUV через микропипеткой открытым кончик стекла. Поток раствора кальция из кончика создает локализованные кальция ионный градиент на поверхности мембраны GUV, приводит к реконструкции мембраны и поколения MTPs. MTPs ориентированы вдали от источника ионов кальция и расти внутри GUV. Это образование МТЗ могут контролироваться непосредственно с помощью флуоресцентной микроскопии и записаны с помощью цифровой камеры. Рисунок 3 показывает экспериментальной установки для производства ремоделирования мембраны. Формирование ССП (Рисунок 2E и рис. 4) в этом протоколе демонстрирует контрастных результат ион кальция экспозиции эксперименты, проведенные в условиях массовых объем. В условиях массовых GUVs разрыву и образуют мембраны патчи, которые могут наблюдаться присоединиться к поверхности стекла25.

Более подробную информацию о формировании GUV-MLV комплексов, а также процедуры для выполнения микроинъекции ионов кальция, описаны в этой статье. Протоколы являются в основном на микроинъекции ион кальция; Однако этот подход можно легко изменить для использования в изучении мембраны ответов за счет местного воздействия на другие ионы или белки. Кроме того в состав пузырьки могут быть настроены изолировать компонент роли липидов в процессе реконструкции мембраны. Представленные протокол не требует каких-либо сложного оборудования для производства GUV-MLV комплексов и характеризуется высокой степенью воспроизводимости.

протокол

1. подготовка небольших липидов пузырьки

  1. Приготовляют раствор липидов SPE/DOPS/ATTO488-ДОПИНГ в хлороформе с массой пропорции 79/20/1.The окончательный концентрацию липидов в хлороформе 1 мг/мл, и окончательный массой 0,6 мг (обычно менее 1 мг). Использование одноразовых вокруг нижней стеклянных флаконов (круглая снизу стеклянных трубок, 10 x 75 мм) при подготовке решения липидного без предварительной очистки шаг.
    1. Заполните и промойте стекло шприцы (25 мкл) с хлороформом, по крайней мере 5 раз перед использованием. Чтобы заполнить и промойте стекло шприца по крайней мере 5 раз, достаточно 3-4 мл хлороформа.
      Предупреждение: Когда обработка хлороформ, использовать стеклянные шприцы и выполнять все процедуры в вытяжной шкаф при ношении соответствующей Перчатки и защитные очки во все времена. Не использовать любые пластиковые флаконы, шприцы или пипетки, при обработке хлороформ.
  2. Оберните стеклянный флакон, содержащий смесь липидов с металлической фольгой, чтобы защитить содержимое от окружающего света и испарения растворителя в роторный испаритель для 3 h для удаления хлороформ, с давлением, достигнув 7 кПа вакуум в 80 об/мин. Сухой липидов пленка образуется в нижней части стекла флакона после испарения (рис. 2A).
    Примечание: Масштабирование вверх несколько раз и использовать большие объемы липидов может понадобится больше времени Ротари испарения для обеспечения полного удаления хлороформ.
  3. Медленно добавьте 600 мкл фосфата буфер солевой (PBS) буферного раствора (рН 7,8, без разбавления) поверх фильма сушеные липидов. После добавления буфера аккуратно мкл 6 глицерин для защиты образца от полного обезвоживания во время GUV-MLV формирования шаги (достижение конечной концентрации глицерина 1 wt %)36. Уплотнение стекла флакона с использованием парафина и крышка с металлической фольги для защиты от окружающего света. Хранить в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
    Примечание: PBS буфера решение состоит из 0.151 g Trizma базы, 1.592 g K3PO4, 1.021 g KH2PO4, 0,062 g O MgSO4 ·7H2и 0.0465 г ЭДТА в 250 мл очищенной воды. Хранят раствор при температуре 4 ° C и нагреть до комнатной температуры перед использованием. Эквивалент 10 мм HEPES буфера может использоваться вместо решения PBS. HEPES буферный раствор готовится путем разбавления 1 М HEPES раствор очищенной водой.
  4. Следующий день, sonicate стекла флакон, содержащий решение за 1 мин, с использованием ultrasonication Ванна при комнатной температуре. Удаление парафина и Пипетка до визуально единообразное решение малого липидов везикулы формируется (рис. 2B). Аликвота 30 мкл раствора везикул полученные небольшой липидов в отдельных 0,5 мл пластиковых труб. Держите эти акции аликвоты при-18 ° C для максимум 6 месяцев.
    Примечание: Если небольшой липидов везикул раствор не визуально обмундирования, вихревой решение 4 раза для 1-2 s с помощью вихревой смеситель на максимальной скорости.

2. Подготовка GUV-MLV комплексов

  1. Оттепель в комнатной температуре пластиковая трубка, содержащая Алиготе замороженных подвески малых липидов везикулы. Вихрь трубки 4 раза для 1-2 s с помощью вихревой смеситель на максимальной скорости.
  2. Место 5 мкл подвеска везикул небольшой липидов на поверхность стекла Крышка выскальзования (24 x 60 мм) сформировать небольшой круглой капли. Использование стекла покрытие скольжения без каких-либо предварительно очистки шагов.
  3. Поместите крышку выскальзования стекла в вакуумный сушильный шкаф (< 100 кПа вакуум) за 20 мин.
  4. Хранить сушеные липидных Фильм при комнатной температуре в течение 4 мин, а затем медленно Пипетка 50 мкл буфера HEPES 10 мм на вершине сухой липидной пленки для регидратации. Подождите 5 минут в предварительной форме GUV-MLV комплексы (рис. 2 c).
  5. Центр стекла покрытие скольжения микроскопа, а затем Пипетка 300 мкл буфера HEPES на него и расположите центр капелька выше цели (рисунок 3B).
  6. Передача 50 мкл предварительно сформированных GUV-MLV раствора в HEPES раствор (300 мкл). 25 мин, подождите, чтобы позволить малонаселенных сформированные комплексы GUV-MLV твердо придерживаться на поверхности стекла покрытие скольжения (Рисунок 2D).
    Примечание: Иногда, GUV-MLV комплексы не образуют на стекло крышки выскальзования и вместо этого наблюдаются липидные пятна или только MLVs. Это можно объяснить встряхнув случайной выборки во время шагов 2.4 или 2.6 или многочисленных циклов замораживания оттаивания небольшой пузырек подвески. Повторите шаги 2.1-2.6 или использовать свежеприготовленные липидов Стоковый раствор (шаг 1.1) для получения GUV-MLV комплексов.

3. микропипеткой подготовка и микроинъекции

  1. По краям боросиликатного стекла капилляров, аккуратно поставив капилляра заканчивается в пламени свечи, чтобы не допустить нарушена во время присоединения его к держателю микропипеткой микропипеткой.
  2. Тянуть по крайней мере 3 стеклянные капилляры, используя Автоматический лазерный съемник, с помощью программы: тепла = 400, Fil = 4, Vel = 50, дель = 225, пули =; Тепла = 400, Fil = 4, Vel = 60, дель = 150, пули = 120. Программа набора должны быть введены с первым значением пул оставлено пустым. С использованием боросиликатного стекла капилляров внутреннего диаметра (и.д.) 1,00 мм и результаты 0,78 мм Наружный диаметр (диаметр) в микропипеткой с кончика открытия примерно 0,3 мкм в диаметре.
  3. Обратно заполните каждый микропипеткой с 8 мкл 5 мм CaCl2 раствор в HEPES буфера (10 мм) с помощью microloader. Фильтр CaCl2 решения с помощью 0,2-0,5 мкм фильтром шприца до использования, чтобы избежать засорения кончика пипетки.
    Примечание: Убедитесь, что CaCl2 полностью растворяется в HEPES буферного раствора, который также используется для шагов 2.4-2.6.
  4. Подключите к микроманипулятор микропипеткой держателя. Смонтируйте микропипеткой в держатель микропипеткой плотно. Соедините ТНВД и капиллярной держатель с помощью питания трубки.
  5. Запустите насос впрыска. Отрегулировать параметры на ТНВД 20 гПа (давление впрыска) и установите 5 гПа компенсации давления, в автоматическом режиме. Приостановите впрыскивающий насос до тех пор, пока микропипеткой готова к микроинъекции.
  6. Набор Микроскоп brightfield режим. Настройте его для дифференциальной помехи контраст (ОПК). Использовать для достижения оптимального мембраны края резолюции 63 X или 100 X высоких целей NA (1.3).
  7. Используйте грубый микроманипулятор для расположения микропипеткой выше капли, содержащие GUV-MLV комплексов. Найдите кончик микропипеткой выше цели.
  8. Сосредоточиться на середину GUV-MLV комплекса микроскопом и затем переориентировать примерно 50 мкм выше GUV. Используйте грубый режим микроманипулятор нежно привести микропипеткой в фокус.
  9. Переключатель микроманипулятор для тонкой режиме. Постепенно переориентировать на поверхность GUV при переводе микропипеткой наконечник вниз и держать кончик в фокусе. Расположите микропипеткой кончик приблизительно 20 мкм от поверхности GUV. Если кончик микропипеткой нарушается из-за случайного контакта с стекла Крышка выскальзования (пример на рисунке 5B), замените его немедленно, чтобы избежать ненужных кальций иона выпуска в пример решения массовых.

4. формирование и перевод MTPs с помощью источника ионов кальция

  1. Набор Микроскоп режим флюоресценции. Установите дихроичными возбудить в 488 нм и обнаружения выбросов на 505-550 Нм.
  2. Включите насос впрыска и начало впрыска ионов кальция. Использование режима тонкой микроманипулятор и медленно подход GUV микропипеткой кончиком. Расположите наконечник микропипеткой на расстоянии 3 мкм от поверхности мембраны при парентеральном CaCl2 решения от микропипеткой чтобы позволить MTPs формы (рис. 4).
  3. Чтобы перевести MTPs вдоль поверхности GUV, медленно перемещайте наконечник пипетки (со скоростью 0,1-0,3 мкм/s) вокруг GUV поверхности с помощью тонкой микроманипулятор (рис. 6). Поддерживать примерно таком же расстоянии (3 мкм) между поверхностью GUV и кончик микропипеткой продолжая инъекции ионов кальция.
    Примечание: По ставкам высокий перевод микропипеткой кончика (выше 0,7 микрон/сек), ССП не будут перенесены в синхронизации с микропипеткой. Вместо этого они будут разброс и сократить, в то время как новый ССП будут создаваться в новом месте микропипеткой кончика (рис. 7).
  4. Чтобы остановить микроинъекции, выключите ТНВД и переместить микропипеткой от поверхности GUV.

Результаты

В этой работе мы продемонстрировать создание GUV-MLV комплексов и как они могут использоваться для выяснения влияния градиентов ионов кальция на клеточной мембраны динамика. Придает поверхности GUV-MLV комплексы необходимы для этих экспериментов для обеспечения фиксированного размера ячейки имитировать при создании ионный градиент путем микроинъекции. Мембрана GUV реагирует на концентрации локализованных кальция через формирование ССП направлен в сторону от источника ионов кальция. Кроме того ССП могут быть переведены на вокруг GUV бесконтактных образом, перемещая микропипеткой кончик вокруг поверхности мембраны.

Схематическая иллюстрация процедуры подготовки GUV-MLV показан на рисунке 2. Хотя в протоколе представленных GUV-MLV комплексы формируются уже предварительно во время шага 2.4 (рис. 2 c), передача везикул решение еще 300 мкл капли буфера (шаг 2.6 протокола) позволяет малонаселенных сформированных GUV-MLV комплексы для достаточно придерживаться стеклянной подложке. Таким образом, устанавливается комплекс подходит для микроманипуляции и микроинъекции (Рисунок 2D). Иногда GUVs содержит один или несколько пузырьков зависшие липидов, которые не влияют на формирование ССП, как показано на рисунке 4A. Эти GUVs производят ССП; Однако изображения могут препятствовали если зависшие пузырьки являются большими. Большинство подготовленных GUVs (до 75%) появляются полусферической и прикреплены к MLVs, как показано на рисунке 1A. Эти пузырьки являются основным направлением настоящего Протокола и подходят для микроинъекции процедуры. Около 25% из оставшихся GUVs появляются волнистые (рис. 1B), который свидетельствует о ниже режима напряжение мембраны. Эти волнообразный везикулы также позволяют для формирования трубчатых выступы; Однако они демонстрируют различные кинетики и различных морфологию сформированных ССП, который выходит за рамки данного протокола25. Типичный диаметр подготовленного везикулы колеблется между 2 до 15 мкм для MLVs и 2 до 40 мкм для GUVs. Оптимальное GUV или большего размера, подверженности ионов кальция — 5 мкм.

Micropipettes были использованы в ожог клеточной допроса схемы также как и процедур, требующих манипулирования синтетических GUVs за несколько десятилетий37,38. Большинство из этих приложений участвуют прямого физического контакта между микропипеткой и на поверхности клеток или пузырьков. Примеры включают патч зажим технику или потянув мембраны тросов из GUV мембраны, помимо строительства нанотрубки везикул сети23,28,39. Недавно micropipettes также используются для создания локализованных градиентов ионов и молекул вокруг GUVs реконструировать неоднородной ячейки микросреды24,25. В представленных протокола должным образом функционирующей микропипеткой (Рисунок 5A) является решающим фактором для создания градиента ион кальция на поверхности GUV путем выпускать решения, содержащиеся в. Правильное позиционирование микропипеткой на поверхности GUV и избегая контакта с мембранных липидов необходимы для успешной микроинъекции. Кончик микропипеткой проходит на расстоянии примерно 3 мкм от поверхности GUV, который является оптимальное расстояние для создания MTPs во время имитируя вариации кальция вблизи клеточной мембраны. Если кончик микропипеткой случайно сломанной (Рисунок 5B), требуется замена. Диапазон CaCl ранее протестированных концентрации2 внутри микропипеткой, который позволяет для формирования ССП, находится между 2 и 5 мм25, что соответствует концентрации внеклеточного кальция. При более низкой концентрации2 CaCl, т.е., 1 мм наблюдаются не ССП.

Формирование ССП по микроинъекции кальция начинается с формирования кариолеммы малых мембраны, которые растут в ССП на месте воздействия (рис. 4В). MTPs продолжают расти, пока GUV мембрана подвергается ионов кальция. Они колеблются и точки от источника ионов кальция (Рисунок 4 c, Дополнительные фильм 1). Когда завершается предложением ион кальция, разброс MTPs GUV поверхности, что делает его трудно заключить ли MTPs остаются или в конечном итоге исчезают.

Формирование MTPs могут быть объяснены локализованных кальций иона привязки к воздействию внешних листовка GUV мембраны и вызывает спонтанное кривизны (m), который непосредственно связан с формирования спонтанное напряжение σ = 2κm2 (Κ является изгиб жесткости), что побудить изгиб мембраны и формирования внутрь ССП. Предыдущие доклады показали, что деформации мембраны может быть объяснено путем конденсации или кластеризации отрицательно заряженных липидов после связывания ионов кальция к мембраны, что приводит к отрицательной кривизны спонтанное40. Кроме того прочное связывание Ca2 + на поверхности отрицательно заряженных бислой нейтрализует поверхностная плотность заряда подвергаются липидного бислоя листовки. Это приводит к разница плотность заряда через бислой, что приводит к ненулевой спонтанное кривизны, достаточно, чтобы согнуть мембраны25.

Наблюдается формирование MTPs демонстрирует чувствительность липидов мембран для ионов кальция и предлагает Роман бесконтактных подход для производства мембраны трубчатых структур. Выяснения происхождения этой мембраны Штенгель может иметь важное значение для понимания динамики мембранных фигуру переходит во время различных функций клеток и клеток меняет и может быть полезным для получения понимание организации липидов в ячейке мембраны.

Наблюдаемые MTPs всегда создаются на сайте на мембраны проходят экспозиции ионов кальция. Таким образом выбрав расположение кончика микропипеткой, можно определить площадь поверхности GUV для роста выступ. Далее, если микропипеткой медленно (0,1-0,3 мкм/s) переехал вокруг GUV поверхности, сохраняя при этом расстояние от мембраны, MTPs переводятся в тандеме с микропипеткой. Рисунок 6 и соответствующие Дополнительные фильм 2 продемонстрировать такой миграции MTPs вокруг GUV поверхности. Этот процесс может сопровождаться образованием нового ССП по непрерывной кальций иона инъекций25. На высокой цены (выше 0,7 микрон/сек) ССП не способны следовать за кончик микропипеткой. Вместо этого новые выступов формируются на новом месте микропипеткой кончика (рис. 7).

Наблюдаемые бесконтактных кальция Ион руководствуясь перевод MTPs вокруг GUV поверхности может далее наше понимание движущих сил динамики мембранных трубчатых структур внутри клетки. Кроме того этот подход предлагает Роман Бесконтактный режим для контроля перевозки материалов в системах мягкой материи, используя химические градиенты.

figure-results-7771
Рисунок 1 : Представитель флуоресцентной микроскопии изображений GUV-MLV комплексов, лишенных подвижности на поверхности скольжения Крышка стеклянная. (A). пример сферической GUV. GUV появляется в виде полусферы прикреплены к MLV. (B). пример волнообразный GUV. Черные стрелки указывают деформированной области мембраны. Эти изображения улучшено и перевернутый для улучшения визуализации дневно обозначенные GUV мембран. Линейки шкалы представляет 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8583
Рисунок 2 : Схематические иллюстрации GUV-MLV подготовки и схем микроинъекции. (A). сухой липидный слой образуется в нижней части стекла флакона результате Ротари испарения хлороформ от решения липидов. (B). sonicated Регидратированные липидного слоя, и небольших липидов везикулы образуются. (C). небольшой капли раствора везикул (5 мкл) помещается на поверхности стекла Крышка выскальзования и переведены в эксикатор для 20 мин обезвоживает решение липидов и образуют пленку сухой липидов (этот шаг не показан). Станавливающим сухой липидной пленки с 50 мкл буферного раствора производит предварительно сформированных GUV-MLV комплексов. (D). Передача предварительно сформированные комплексы больший объем буфера результатов в формировании редкой разлученных GUV-MLVs прилагается к поверхности стекла Крышка выскальзования. Е. позиционирование микропипеткой вблизи поверхности GUV и освобождения ионов кальция вызывает формирование ССП. Иллюстрации не обращается к шкале. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-9914
Рисунок 3 : Экспериментальная установка для микроинъекции ионов кальция. (A). компоненты экспериментальной установки, необходимые для создания MTPs в GUVs. (B). детали микроинъекции установки. Coverslip стекла с решением комплексов GUV-MLV размещены на микроскопа. Угол между микропипеткой и поверхностью стекла Крышка выскальзования составляет 30° (отмечены в белом). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10640
Рисунок 4 : Формирование ССП по микроинъекции ионов кальция на поверхности GUV. (A). комплекс GUV-MLV до воздействия к градиенту ионов кальция. Стрелка указывает липидов везикул в ловушке внутри GUV, и которая не мешает наблюдения MTPs. (B). Небольшие MTPs образуются после микроинъекции ионов кальция (концентрация2 CaCl в микропипеткой 5 мм). (C). рост MTPs после непрерывного воздействия для ионов кальция. Флуоресценции изображений Улучшено и перевернутый для целей визуализации. Линейки шкалы представляет 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-11526
Рисунок 5 : Стекло используется для микроинъекции ион кальция micropipettes. (A). пример должным образом функционирующего микропипеткой. (B). пример микропипеткой, имеющий сломанной кончик (поврежденной области указывается с черной стрелкой). Оба изображения улучшено и перевернутый для лучшей визуализации. Линейки шкалы представляет 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-12225
Рисунок 6 : Кальций иона руководствуясь перевод MTPs вокруг поверхности GUV. (A). ССП образуются на поверхности GUV после микроинъекции 5 мм CaCl2 решения. (B-C). Перевод микропипеткой кончика (0,2-0,3 мкм/s) вокруг мембраны поверхности вызывает движение MTPs в направлении источника ионов кальция. Черные стрелки выделить направление движения микропипеткой. Эти изображения улучшено и перевернутый для улучшения визуализации мембраны. Линейки шкалы представляет 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-13063
Рисунок 7 : MTPs скоростью высокой перевод кончика микропипеткой. (A). ССП образуются на поверхности GUV после микроинъекции 5 мм CaCl решение2 (белая линия). (B-C). Размере высокий перевод микропипеткой вокруг поверхности GUV (1 микрон/сек) приводит к образованию новых ССП на новом месте микропипеткой кончика (Пурпурная линия), а также рассеяния ранее сформированных ССП (белая линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-13820
Дополнительные фильм 1: Формирование MTPs в GUV при локализованных экспозиции в ЦС 2 + градиент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм. 

figure-results-14274
Дополнительные фильм 2: Кальция Ион руководствуясь ССП миграции вокруг поверхности GUV.   Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм. 

Обсуждение

Биомиметических систем клетки позволяют для исследования поведения мембраны под воздействием внешних стимулов например, ионы, белки или наночастиц. GUVs, будучи такой модели, может отвечать на изменения в химической среде, регулируя их форму, которая часто включает в себя формирование трубчатых структур и кариолеммы24,,4142,43 .

Эта статья предлагает подход к генерации MTPs через ремоделирования GUV поверхности на локализованных инъекции ионов кальция на поверхности GUV бесконтактных образом. Протокол описывает подготовку GUV-MLV комплекса, который имитирует мембрану клетки плазмы, а также как использовать микроинъекции технику для создания кальция градиентов ионов рядом GUV поверхности в форме ССП. Большинство предыдущих экспериментальных исследований, которые рассмотрены взаимодействия мембраны иона кальция воздействию липидов пузырьки для массового кальций иона концентрации14,17. В зависимости от экспериментальных условий такого массового воздействия может привести к различные мембраны ответ с не трубчатых выступов сформирован25.

Образование комплексов GUV-MLV довольно прост и требует только стандартного лабораторного оборудования, таких как роторный испаритель, Ультразвуковая ванна и вакуумного эксикатора. Тем не менее есть несколько критических шагов для рассмотрения в ходе подготовки везикул. Важно обеспечить обезвоживания везикулы полного (во время шага 2.3 протокола) и сухой круговой липидов фильм, содержащий только небольшое количество кристаллов соли образуется на поверхности стекла Крышка выскальзования. В ходе эксперимента тщательной обработке везикул решения, используя свежие липидов Стоковый раствор в хлороформе, а также свежие HEPES буфера, имеет важное значение для успешной подготовки GUV-MLV комплексов. Кроме того безопасные вложения на поверхность стекла Крышка выскальзования GUV-MLV комплекса имеет решающее значение для микроманипуляции и микроинъекции. Для подтверждения надлежащего адгезии GUV-MLV комплекс, микропипеткой (без инъекций потока) может использоваться для аккуратно вставьте против GUV поверхности. Твердо придерживался везикул не будет скользить по поверхности после прямого физического контакта. Поскольку эксперименты в капли открытого буфера, который может быть допрошен на несколько часов, испарение должны приниматься во внимание. Испарение из буфера капелька изменит осмотического условий, которые могут повлиять на и дестабилизировать везикулы. Чтобы восстановить осмотического условий, периодическое дополнение чистой воды для восстановления первоначального объема образца возвращает системы гомеостаза.

При изменении состава мембранных липидов, важно, что везикулы производятся в виде комплекса GUV-MLV потому что MLV позволяет для передачи материала липидов GUV во время перестройки мембраны. Предыдущие исследования показали, что замена компонентов смеси SPE с чистой липиды, или добавление 5-30% холестерина, также позволяет для GUV-MLV комплекс формирования28,44. Большинство подготовленных GUVs являются однослойных45.

Кроме того при тестировании других двухвалентной катионов, таких как ионы магния, формирование MTPs сильно зависит наличие отрицательно заряженных DOPS в смеси липидов. Без DOPS ССП не образуют в везикулы, указанных в настоящем Протоколе. Кроме того моновалентная катионов, таких как калий и натрий, не приводят к формированию ССП, даже в везикулы, содержащие DOPS25.

Помимо критические шаги в отношении подготовки и манипуляции GUVs есть несколько важных факторов, чтобы рассмотреть во время процедуры микроинъекции. Успешный микроинъекции ионов кальция сильно зависит от надлежащего функционирования стекла micropipettes, которые готовятся в день эксперимента. Существует несколько факторов, которые могут вызвать микропипеткой неисправности. Распространенной причиной является засорение кончик открытия. Малые липидов частицы, которые являются побочными продуктами подготовки везикул, рассредоточены в решении и склонны придерживаться кончик микропипеткой, создавая тем самым засорения. Очистка наконечник пипетки лучше всего сделать, подняв его из раствора везикул и поместив его обратно близко к поверхности GUV. Использование функции Воздуходувный микроинъекции насоса необходимо избегать потому, что это приводит к массовым инъекций в основной раствор ионов кальция. Кроме того небольшие воздушные пузыри в ловушке внутри микропипеткой предотвратить надлежащего микроинъекции, в котором случае микропипеткой следует заменить на новый. Совет поломки могут быть значительно минимизированы, поместив экспериментальной установки на антивибрационная таблицы для сведения к минимуму колебаний Совет.

Кроме того необходимо принимать при выборе схемы наблюдения, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание во время получения лучшее время решена изображений. Микроскопии флуоресцирования лазерно индуцированным поля был использован в этот протокол, потому что она позволяет для приобретения скорости относительно высокий имидж на глубине цель ограниченного зонд. Кроме того использование Перевернутый микроскопии позволяет одновременное микроинъекции и наблюдение везикулы липидов и ССП.

Одним из основных ограничений представленных метода является требование обширные ручной работы и достаточными навыками микроманипуляции. Потому что комплексы формируются в процессе спонтанного отек, невозможно контролировать размер GUVs и MLVs. Кроме того этот протокол не позволяет для контроля мембраны напряженности подготовленных GUV-MLV комплексов, которые может быть необходимо собрать дополнительную информацию в отношении реконструкции мембраны. GUVs подключены к MLVs с последней поставляя липидов материалом для существенного роста MTPs до такой степени, что было бы невозможно добиться исключительно использованием мембраны из GUVs. MLVs также способствовать снижению разброса боковой поверхностное натяжение в пределах GUV-MLV комплекс44, который бы осложнить попытки контролировать натяжение пузырьков с помощью микропипеткой аспирации. Эта модель на основе GUV-MLV предоставляют меньше напряжение, которое лучше имитирует режимов напряженности, в структуры клеточной мембраны, подключен к мембранных резервуаров, такие мембраны складок и кариолеммы46. В то же время метод аспирации микропипеткой может быть успешно применен контролировать натяжение мембраны в одном GUVs. Например работу Грабера et al. представил подробную информацию о формирования трубчатых кариолеммы мембраны в одной GUVs после связывания ионов кальция к мембране в условиях массовых от разнообразных напряженности режимов40. Наконец Сравнение поведения мембраны на как местных, так и массового воздействия кальция требует улучшения управления мембраны прилипания к поверхности, которая выходит за рамки настоящего Протокола.

Подводя итоги, предлагаемая методика позволяет для бесконтактных мембраны ремоделирования и формирования ССП на локализованных стимуляции с ионами кальция. Будущих приложений этот метод центра на перевод от синтетических везикул систем родной биологических мембран, например шелесту клеток. Предложенный метод может быть объединена с другими одноклеточных допроса схем, таких как патч зажим или микроэлектродные amperometry, или в сочетании с локализованных Отопление стратегии31,47,48. Тестирование влияния других ионов или молекул прост и включает в себя просто заменив ионов кальция с молекулами интерес. Кроме того комплекс синтетических липидов везикулы может производиться через мембраны функционализация трансмембранные белки, которые могут расширить наше понимание биофизики клетки реорганизация и клеточной мембраны динамика, связанные с зондирования местных химические градиенты. Не в последнюю очередь, бесконтактных стимуляции липидные мембраны также могут быть переведены для систем полимерных мягкой материи, предлагая основу для платформы Роман бесконтактных манипуляции.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Soy bean polar lipid extractAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		541602C100 mg
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPSAvanti
Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)		840035C1x25 mg
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)ATTO-TEC (Germany)AD 488-311 mg
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.)Sigma Aldrich (Missouri, USA)20735 SIGMA-ALDRICH
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/packCorning Incorporated (Corning, NY 14831)99445-10
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizerSigma Aldrich (Missouri, USA)650498-1L-D
Rotary evaporatorBüchi Rotavapor R-144 Switzerland
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mmKEBO lab (Sweden)MA00360500
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISOSharlau Chemie S.A. (Spain)P9333-500G
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%Sigma Aldrich (Missouri, USA)S7653-1KG
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%Sigma Aldrich (Missouri, USA)G5516-1L
Glycerol, for molecular biology, minimum 99%Sigma Aldrich (Missouri, USA)T-1503 2050 g
Trizma baseSigma Aldrich (Missouri, USA)P5629-500G
Potassium phosphate tribasic (K3PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)P5655
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma Aldrich (Missouri, USA)5886
MgSO4Merck (USA)34549-100 g
EDTASigma Aldrich (Missouri, USA)H0887 Sigma 
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell cultureSigma Aldrich (Missouri, USA)Z260282-1PAK24x60 mm
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μmSigma Aldrich (Missouri, USA)631-1339 
Menzel Gläzer #1, glass cover slipVWR (USA)
Diaphragm vacuum pump for the desiccatorVacuubrand (Germany)
Ultrasonicate bathBandelin Sonolex (Germany)
VX-100 Lab vortexer vortex mixerLabnet International (USA)
488 nm laser line Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)
Leica Microsystems immersion oil for microscopesLeica (Germany)12847995 
Inverted fluorescence microscopy system Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)Technologies GmbH (Thuringia, Germany)300038
PatchStar MicromanipulatorScientifica (Uckfield, UK)612-7933
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,  1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. Harvard Apparatus U.K
Eppendorf microloader (pipette tips)VWR (USA)
P-2000 CO2 laser-puller Sutter Instruments (Novato, USA)
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf FemtojetEppendorf (Germany)

Ссылки

  1. Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport. Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).
  2. Meldolesi, J., Pozzan, T. The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen. Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).
  3. Bygrave, F. L., Benedetti, A. What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?. Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).
  4. Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen. The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).
  5. SantoDomingo, J., et al. Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules. European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).
  6. Moreno, A., et al. Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles. Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).
  7. Bulenda, D., Gratzl, M. Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles. Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).
  8. Montero, M., et al. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).
  9. Villalobos, C., et al. Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells. The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).
  10. Brown, E. M., Hofer, A. M. Extracellular calcium sensing and signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).
  11. Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion. Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).
  12. Boettcher, J. M., et al. Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers. Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).
  13. Binder, H., Zschörnig, O. The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes. Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).
  14. Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).
  15. Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).
  16. Melcrova, A., et al. The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers. Scientific Reports. 6, 38035 (2016).
  17. Roux, M., Bloom, M. Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR. Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).
  18. Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).
  19. Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes. Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).
  20. Vernier, P. T., et al. Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential. Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).
  21. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  22. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  23. Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies. Journal of Visualized Experiments. (95), e52281 (2015).
  24. Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics. Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).
  25. Ali Doosti, B., et al. Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions. Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).
  26. Barber, M. A. A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells. The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).
  27. Taylor, C. V. An accurately controllable micropipette. Science. 1329, 617-618 (1920).
  28. Jesorka, A., et al. Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein. Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).
  29. Lobovkina, T., et al. Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).
  30. Karlsson, A., et al. Networks of nanotubes and containers. Nature. 409 (6817), 150 (2001).
  31. Wegrzyn, I., et al. Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles. Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).
  32. Mellander, L. J., et al. Two modes of exocytosis in an artificial cell. Scientific Reports. 4, (2014).
  33. Cans, A. S., et al. Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).
  34. Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis. FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).
  35. Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).
  36. Duzgunes, N. Methods in Enzymology. Liposomes Part F. Elsevier Science. , (2009).
  37. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  38. Orwar, O., et al. Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis. Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).
  39. Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles. Journal of Visualized Experiments. (130), e56086 (2017).
  40. Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).
  41. Pezeshkian, W., et al. Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes. ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).
  42. Angelova, M. I., Tsoneva, I. Interactions of DNA with giant liposomes. Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).
  43. Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes. ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).
  44. Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis. Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).
  45. Billerit, C., et al. Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles. Soft Matter. (20), (2011).
  46. Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).
  47. Garten, M., et al. Whole-GUV patch-clamping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).
  48. Messina, P., et al. Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes. Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

137

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены