أورثوتوبيك زرع الخلايا غدية الرئة سينجينيك لدراسة التعبير PD-L1

Summary

هنا يصف لنا نموذج أورثوتوبيك سينجينيك مينيملي زرع خلايا غدية الرئة الماوس كنموذج تخفيض وقت وتكلفة لدراسة الخلية غير الصغيرة سرطان الرئة.

Abstract

استخدام نماذج الماوس لا غنى عنه لدراسة الفسيولوجيا المرضية للأمراض المختلفة. فيما يتعلق بسرطان الرئة، والعديد من النماذج المتاحة، وراثيا بما في ذلك تصميم النماذج، فضلا عن نماذج الزرع. نماذج الماوس المهندسة وراثيا غير مضيعة للوقت وباهظة التكاليف، بينما بعض نماذج زرع أورثوتوبيك يصعب إعادة إنتاجها. هنا، يوصف بأسلوب توصيل تحسن غير الغازية للرئة ورم الخلايا كنموذج لزرع أورثوتوبيك بديلة. يسمح استخدام الماوس الرئة خلايا غدية والمتلقين الاختلاس سينجينيك دراسة tumorigenesis تحت وجود نظام المناعة نشط بشكل كامل. وعلاوة على ذلك، التلاعبات الجينية لورم الخلايا قبل الزرع يجعل ملامح هذا النموذج نهج توفير الوقت جذابة لدراسة أثر العوامل الوراثية على نمو الورم والتعبير الجيني في خلايا الورم تحت الظروف الفسيولوجية. باستخدام هذا النموذج، نعرض هذه الرئة خلايا غدية المبرمجة صريح زيادة مستويات القامع تي خلية الموت-يجند 1 (PD-L1) عندما نمت في بيئتها الطبيعية بالمقارنة مع زراعة في المختبر.

Introduction

سرطان الرئة هو لا تزال حتى الآن أكبر قاتل المتصلة بالسرطان في كل من الرجال والنساء¹. وفي الواقع، وفقا "جمعية السرطان الأمريكية"، كل سنة أكثر الناس يموتون بسبب سرطان الرئة من الثدي والبروستاتا، والقولون السرطان معا¹. وحتى وقت قريب، أغلبية المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، وهو النوع الأكثر وفرة من سرطان الرئة، تعامل مع العلاج الكيميائي على أساس البلاتين في السطر الأول، معظمها بالإضافة إلى الأوعية مثبطات². مجموعة فرعية فقط من المرضى المرافئ النمطان الطفرات في مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR)، في الأورام اللمفاوية المتحولة كيناز (ALK)، أو في ROS1، ويمكن التعامل مع^3،المخدرات تستهدف المتاحة⁴. مع ظهور مثبطات الحاجز المناعي، نشأ أمل جديد لمرضى سرطان الرئة، على الرغم من أن حتى الآن، سوى 20 – 40% مرضى تستجيب للعلاج المناعي⁵. ومن ثم يلزم البحث كذلك تحسين هذه النتيجة بالضبط الدقيق للعلاج المناعي نقطة تفتيش وتحقق من خيارات العلاج كومبيناتوري.

دراسة سرطان الرئة، مجموعة واسعة من النماذج السريرية المتاحة، بما في ذلك نماذج عفوية الناجمة عن المواد الكيميائية والمواد المسببة للسرطان والماوس المهندسة وراثيا نماذج (جيم) حيث تنشأ الأورام أصلي عقب تفعيل الشرطي المسرطنة و/أو المنظمة من ورم المكثف الجينات^6،،من⁷⁸. هذه النماذج ذات قيمة خاصة للتحقيق في العمليات الأساسية في التنمية ورم في الرئة، ولكن يحتاجون أيضا إلى الفئران واسعة تربية، والتجارب مضيعة للوقت. ولذلك، العديد من دراسات تقييم احتمال مثبطات الاستفادة من نماذج إكسينوجرافت تحت الجلد (المستمدة من المريض) حيث يتم حقن خطوط خلايا سرطان الرئة البشرية تحت الجلد في الفئران العوز⁹.

في هذه النماذج، لم يتم تمثيل ميكروميليو الأورام تبعاً لذلك؛ ومن ثم، الباحثون أيضا استخدام نماذج زرع أورثوتوبيك، حيث يتم حقن الخلايا السرطانية عن طريق الوريد، إينترابرونتشيالي، أو مباشرة في الرئة حمة^10،11،،من^{1213، 14،15،16،،}من^1718،،من¹⁹²⁰. بعض هذه الطرق صعبة من الناحية الفنية، من الصعب على استنساخ، وتتطلب تدريبا مكثفا للباحثين. ²¹ هنا يمكننا تكييفه أورثوتوبيك غير الغازية، تحسن أسلوب زرع في الفئران الأشخاص، حيث وضع في غضون 3-5 أسابيع الأورام ويحمل التشابه الكبير للأورام البشرية، للحث على التعبير عن تي-الخلية القامع المبرمجة الموت-يجند 1 (PD-L1) في الخلايا السرطانية. ^{11 , 12 , 20} استخدام الماوس ورم الخلايا المستمدة من نماذج جيمم والفئران المستفيدة سينجينيك يتيح دراسة سليمة لورم المكروية بما في ذلك الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الجينات أدوات التحرير مثل كريسبر/Cas9 التكنولوجيا²² في المختبر قبل الزرع الذي يسهل التحقيق في تأثير العوامل الوراثية في الرئة توموريجينيسيس.

Protocol

أقرت الوزارة الاتحادية النمساوية للعلوم والأبحاث والاقتصاد جميع البروتوكولات التجريبية المبينة أدناه واتبع المبادئ التوجيهية الأخلاقية.

ملاحظة: ويصف البروتوكول هنا نموذج أورثوتوبيك زرع خلايا غدية الرئة الماوس إلى المستلمين سينجينيك. قد تكون الخلايا المعزولة من الرئتين الورم الحاملة كراس^LSL-G12D: p53^{fl/فلوريدا} (KP) الفئران^7،18، إذا كانت متوفرة داخل المنظمة، وزرع في الفئران من نفس الخلفية والجنس. إذا تم توفير خلايا من المجموعات البحثية الأخرى والخلفية الدقيق لا يزال غير معروف، نحن نوصي باستخدام الجيل F1 لعبور بين الفئران C57BL/6 و 129S زرع الأعضاء المستفيدين ضمان التسامح القصوى.

1-إعداد الخلية

1. KP البذور الخلايا 24 ساعة قبل الزرع في حوالي 50% في كونفلوينسي في استكماله بمصل العجل الجنين 10% (FCS) والبنسلين يو/مليلتر 100 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين (يشار إليه فيما يلي مستنبت القياسي)، الجلوتامين، ربمي. احتضان الثقافات الخلية في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، وحوالي 95% رطوبة نسبية.
2. في اليوم التالي، حصاد الخلايا باستخدام 1 مل التربسين-يدتا (0.05% في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات [برنامج تلفزيوني]) لمدة 5 دقائق كل لوح 10 سم، وفي وقت لاحق، ريسوسبيند خلايا منفصلة مع 9 مل مستنبت القياسي.
3. عد الخلايا في هيموسيتوميتير ونقل العدد الخلايا اللازمة للتجارب في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي.
   ملاحظة: نوصي بزرع الخلايا في الماوس بين 2.5 × 10⁵ و 1 × 10⁶ KP، لكن هذا قد يكون تكييفها على أساس الاحتياجات للباحث.
4. في وقت لاحق، الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x زونضح المادة طافية، واستخدام ماصة، ريسوسبيند الخلايا في كثافة من 2 × 10⁷/mL (لاستنشاق 1 × 10⁶ KP الخلايا الواحدة الماوس) في مصل الدم وربمي خالية من المضادات الحيوية ، وتستكمل مع حمض الإيثيلين 0.01 متر (يدتا).
5. تبقى الخلايا على الجليد حتى زرع الأعضاء.

2-أورثوتوبيك زرع عن طريق إعطاء إيصال

1. رصانة ماوس (8-12 أسبوعا عمر) الحقن تحت الجلد من خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ وزن الجسم) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم).
2. في حين يعين التخدير، تعد القسطرة التنبيب. ولذلك، بصراحة الإبرة لقسطرة ببساطة قطع النهاية مع المقص. وبعد ذلك، دفع القسطرة تماما على نهاية الإبرة.
3. تأكيد مستوى مناسب من التخدير بدواسة منعكس عن طريق شركة تو معسر وتطبيق مرهم العيون إلى العيون.
4. إصلاح الماوس على منصة تنبيب (الشكل 1A) عن طريق تركيب القواطع العلوية لها أكثر خياطة والتأكد من أن الصدر الرأسي تحت الخياطة.
5. ضع كابل الألياف بصرية بين الأرجل الأمامية لإلقاء الضوء على الصدر (الشكل 1B).
6. فتح فم الماوس وسحب اللسان باستخدام الملقط شقة تطهيرها بعناية. ابحث عن انبعاث الضوء الأبيض لتحديد موقع الحنجرة وتصور غضاريف epiglottis وأريتينويد (الشكل 1).
7. بمجرد فتح القصبة الهوائية مرئية بوضوح، بلطف الشريحة القسطرة في القصبة الهوائية (الشكل 1). يعتمد طول القسطرة لإدراجها على السن وحجم الحيوان، نظراً لأنه لا ينبغي أن تمر دون التشعب تضمن توزيعاً حتى الرئة خلايا غدية داخل الرئة. بسرعة إزالة الإبرة من القسطرة.
8. تتم الإشارة إلى الموضع الصحيح من القسطرة في القصبة الهوائية على ضوء أبيض ساطع من خلال القسطرة (الشكل 1E). من أجل تأكيد وضع القسطرة في القصبة الهوائية، إرفاق حقنه 1 مل يحتوي على الماء بالقسطرة. سوف سرعة نقل المياه في المحاقن صعودا وهبوطاً وفقا للتنفس (الشكل 1F).
   ملاحظة: يمكن أن يتم حذف هذه الخطوة من الباحثين ذوي الخبرة.
9. الاحماء تعليق خلية بعقد الأنبوب في متناول اليد، وفي وقت لاحق، "الماصة؛" 50 ميليلتر من تعليق تحتوي على خلايا 1 × 10⁶ عدد الخلايا (قد يكون المتغير) في مركز المحور القسطرة. سوف يستنشق التعليق على الفور. وفي وقت لاحق، إرفاق حقنه 1 مل والاستغناء عن 300 ميليلتر من الهواء لضمان توزيع متسقة داخل الرئتين.
10. إزالة القسطرة بلطف وإزالة الماوس من منصة تنبيب ووضعه على لوح حرارة حتى أنه يتعافى من التخدير.

3-الرئة التحضير للتدفق الخلوي

1. في النهاية التجريبية المطلوبة ورصانة الماوس الحقن تحت الجلد من خليط من الكيتامين (100 مغ/كغ وزن الجسم) وإكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) و euthanize عليه بخلع عنق الرحم.
2. نقع الذبيحة في الإيثانول 70% وتأمين الماوس على لوحة تشريح باستخدام الشريط.
3. جعل شق خط الوسط البطني وعكس بلطف الجلد لفضح عضلات جدار الصدر والبطن الأجهزة. ثقب الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع مع مقص لفضح تجويف الصدر.
4. نتخلل الرئتين 3 x مع مل 6-8 من برنامج تلفزيوني المثلج من خلال البطين الأيمن باستخدام إبرة ز 27 بعد قطع فتحه صغيرة في البطين الأيسر للسماح للدم بمغادرة. ينبغي إزالة الرئتين الدم ودورة بيضاء تماما.
5. تأخذ بها الرئتين وتخطر الفصوص إلى قطع صغيرة باستخدام مقص. نقل القطع الرئة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل واحتضان ذلك في 1.5 مل من الرئة الهضم المخزن المؤقت (ربمي، 5 ٪ السفح، 150 يو/مليلتر كولاجيناز الأول، و 50 يو/مليلتر الدناز أنا).
6. احتضان الرئة القطع 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ومع الرج المستمر.
7. نقل تعليق خلية الرئة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. واضحة في المصفاة مع الجزء الخلفي من حقنه 10 مل العقيمة وشطف المصفاة مع 15 مل من برنامج تلفزيوني مع FCS 2%.
8. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) العازلة ليسينج واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل من الكريات الحمراء المتبقية.
9. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع FCS 2% والمضي قدما في البروتوكول المصبوغة المطلوب للتدفق الخلوي²³.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، قد يكون حراكه الخلايا في ربمي التي تحتوي على 30% FCS و 10% [دمس] وتجميد استخدام حاوية تجميد لتحليلها في وقت لاحق.

النتائج

أننا باستخدام طراز زرع أورثوتوبيك عن طريق إعطاء إيصال خلية الورم لاختبار ما إذا كان ورم المكروية يحفز التعبير PD-L1. ولذلك، نحن عزل خلايا الرئة AC الماوس من طراز KP أصلي (KP الخلايا)، 10 أسابيع عقب التعريفي الورم عن طريق لجنة المساواة العرقية-ريكومبيناسي-وإذ يعرب عن تسليم إتش (Ad....

Discussion

دراسة الأحداث الرئة الفسيولوجية ومرضية في الرئة وهي أساليب تنبيب إعطاء الغازية وغير الغازية لتقطير الكواشف المختلفة المستخدمة على نطاق واسع^26،،من^{2728،29 ،30،،}من³¹³²

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82