Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

Résumé

Nous décrivons ici un modèle de transplantation orthotopique syngénique minimalement invasives des cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris comme un modèle de temps - et réduction des coûts pour étudier le cancer du poumon non à petites cellules.

Résumé

L’utilisation de modèles murins est indispensable pour l’étude de la physiopathologie des maladies diverses. En ce qui concerne le cancer du poumon, plusieurs modèles sont disponibles, y compris les organismes génétiquement machiné des modèles ainsi que les modèles de la transplantation. Cependant, les modèles de souris génétiquement modifiées sont long et coûteux, que certains modèles de transplantation orthotopique sont difficiles à reproduire. Ici, une méthode de livraison non invasif par voie intratrachéale de cellules de tumeur du poumon comme un modèle de transplantation orthotopique alternative est décrite. L’utilisation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris et receveurs de greffe syngénique permet à étudier la tumorigenèse sous la présence d’un système immunitaire pleinement active. En outre, les manipulations génétiques de tumeur cellules avant transplantation rend ce modèle une approche intéressante de gagner du temps pour étudier l’impact des facteurs génétiques sur la croissance tumorale et l’expression des gènes cellulaires tumorales profils dans des conditions physiologiques. En utilisant ce modèle, nous montrons ce poumon cellules d’adénocarcinome express niveaux accrus de l’éliminateur de lymphocytes programmé mort-ligand 1 (PD-L1) lorsqu’il est cultivé dans leur milieu naturel par rapport à la culture in vitro.

Introduction

Cancer du poumon est toujours de loin le plus grand tueur de liés au cancer dans les hommes et les femmes¹. En effet, selon l’American Cancer Society, chaque année plus de personnes meurent du cancer du poumon que du cancer du sein, la prostate et du côlon cancer ensemble¹. Jusqu'à récemment, la majorité des patients souffrant de cancer de poumon non à petites cellules (NSCLC), qui est le plus abondant sous-type de cancer du poumon, ont été traitée avec une chimiothérapie à base de platine dans un cadre de première ligne, principalement avec l’ajout de l’angiogenèse inhibiteurs de la². Seulement un sous-ensemble de patients recèle oncogènes mutations dans le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), kinase de lymphome anaplasique (ALK), ou dans ROS1 et peut être traité avec disponible ciblant médicaments^3,4. Avec l’avènement des inhibiteurs de la point de contrôle immunitaire, nouvel espoir pour les patients atteints de cancer du poumon a été soulevée, même si jusqu'à présent, seulement 20 à 40 % des patients répondent à l’immunothérapie⁵. Par conséquent, plus recherche est nécessaire pour améliorer ce résultat en thérapie immunitaire de point de contrôle de réglage fin et d’étudier les options de traitement combinatoire.

Pour étudier le cancer du poumon, une vaste gamme de modèles précliniques sont disponible, y compris les modèles spontanés déclenché par des produits chimiques et les agents cancérigènes et les souris génétiquement modifiée modèles (GEMM) où autochtones tumeurs surviennent suite à l’activation conditionnelle d' oncogènes et/ou l’inactivation du suppresseur de tumeur gènes^6,7,8. Ces modèles sont particulièrement utile pour étudier les processus fondamentaux dans le développement de tumeurs du poumon, mais elles exigent également une vaste souris d’élevage, et expériences sont coûteuses en temps. Par conséquent, plusieurs études évaluant les inhibiteurs potentiels Profitez des modèles de xénogreffes de (patient dérivés) sous-cutané où lignées de cellules cancéreuses du poumon humain sont injectées par voie sous-cutanée de souris immunodéficientes⁹.

Dans ces modèles, le micromilieu des tumeurs n’est pas représenté en conséquence ; par conséquent, les chercheurs utilisent aussi des modèles de transplantation orthotopique, où les cellules tumorales sont injectées par voie intraveineuse, intrabronchially ou directement dans le poumon parenchyme^{10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20}. Certaines de ces méthodes sont techniquement difficiles, difficiles à reproduire et nécessitent une formation intensive des chercheurs. ²¹ ici, nous avons adapté un orthotopique non invasif, méthode de transplantation par voie intratrachéale chez les souris immunocompétentes, où les tumeurs se développent dans les 3 à 5 semaines et présentent une similitude importante de tumeurs humaines, à induire l’expression de la T-cellule suppresseur programmé mort-ligand 1 (PD-L1) sur les cellules tumorales. ^{11 , 12 , 20} l’utilisation de cellules de tumeur de souris provenant de modèles GEMM et souris destinataires syngéniques permet une étude appropriée du microenvironnement tumoral, y compris les cellules immunitaires. En outre, gène outils comme CRISPR/Cas9 technologie²² d’édition peut être utilisé in vitro avant la transplantation qui facilite la recherche sur l’impact des facteurs génétiques dans la tumorigenèse du poumon.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux comme indiqué ci-dessous suivent les directives éthiques et ont été approuvés par le ministère fédéral autrichien de la Science, la recherche et l’économie.

Remarque : Le protocole ici décrit un modèle orthotopique de transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris dans syngéniques bénéficiaires. Les cellules peuvent être isolées des poumons avec tumeur de Kras^LSL-G12D: p53^fl/fl (KP) souris^7,18, si elles sont disponibles en interne et transplantées chez des souris de même sexe et de fond. Si les cellules proviennent d’autres groupes de recherche et de l’arrière-plan exacte reste inconnue, nous recommandons l’utilisation de la génération F1 d’un croisement entre les souris C57BL/6 et 129S comme des greffés afin de garantir une tolérance maximale.

1. préparation de la cellule

1. KP semence cellules 24h avant la transplantation à environ 50 % confluence dans RPMI additionné de sérum de veau foetal de 10 % (FCS), glutamine et 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (ci-après dénommé le milieu de culture standard). Incuber les cultures cellulaires à 37° C, 5 % de CO₂et environ 95 % d’humidité relative.
2. Le lendemain, récolter les cellules en utilisant 1 mL de trypsine-EDTA (0,05 % dans une solution saline tamponnée au phosphate [PBS]) pendant 5 min par plaque de 10 cm et, par la suite, remettre en suspension les cellules individuelles avec 9 mL de milieu de culture standard.
3. Compter les cellules dans un hémocytomètre et transférer le nombre de cellules nécessaires pour les expériences dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
   Remarque : Nous vous recommandons de repiquage entre 2. 5 x 10⁵ et KP 1 x 10⁶ cellules / souris, mais cela pourrait être adapté selon les besoins du chercheur.
4. Par la suite, centrifuger les cellules pendant 5 min à 300 x g, aspirer le surnageant et, à l’aide d’une pipette, remettre en suspension les cellules à une densité de 2 x 107/ml (pour l’inhalation de 1 x 10⁶ cellules de KP par souris) dans le sérum et sans antibiotique RPMI , additionné de 0,01 M d’acide tétraacétique (EDTA).
5. Conserver les cellules sur la glace jusqu'à la transplantation.

2. Orthotopic Transplantation via intratrachéale livraison

1. Endormir une souris (8-12 semaines d’âge) par une injection sous-cutanée d’un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel).
2. Pendant ce temps l’anesthésie définit dans, préparez le cathéter pour l’intubation. Par conséquent, émousser l’aiguille d’un cathéter en coupant simplement la fin avec des ciseaux. Par la suite, retirer le cathéter intégralement sur l’extrémité de l’aiguille.
3. Confirmer le niveau approprié de l’anesthésie en pédale réflexe via orteil ferme pinçant et pommade ophtalmique pour les yeux.
4. Difficulté de la souris sur la plate-forme de l’intubation (Figure 1 a) en accrochant ses incisives supérieures sur une suture et confirmer que la poitrine est verticale sous la suture.
5. Placer un câble à fibre optique entre les pattes avant pour éclairer la poitrine (Figure 1 b).
6. Soigneusement, ouvrir la bouche de la souris et tirez sur la languette à l’aide de pinces plates désinfectée. Recherchez l’émission de lumière blanche pour localiser le larynx et visualiser les cartilages de l’épiglotte et le cartilage (Figure 1).
7. Une fois que l’ouverture de la trachée est clairement visible, faites doucement glisser la sonde dans la trachée (Figure 1). La longueur du cathéter doit être inséré dépend de l’âge et la taille de l’animal, car il ne devrait pas aller au-dessous de la bifurcation pour garantir une répartition uniforme du poumon cellules d’adénocarcinome du poumon. Retirer rapidement l’aiguille du cathéter.
8. Le positionnement correct de la sonde dans la trachée est indiqué par la lumière blanche qui brille à travers le cathéter (Figure 1E). Afin de confirmer le placement de la sonde dans la trachée, fixez une seringue de 1 mL contenant de l’eau au cathéter. L’eau dans la seringue sera rapidement bouger de haut en bas selon la respiration (Figure 1F).
   Remarque : Cette étape peut être omise par des chercheurs expérimentés.
9. Réchauffer la suspension cellulaire en tenant le tube dans la main et, par la suite, distribuer 50 µL de la suspension contenant 1 x 10⁶ cellules (le nombre de cellules peut être variable) dans le centre de l’embase du cathéter. La suspension va être aspirée immédiatement. Ensuite, fixez une seringue de 1 mL et administrer 300 µL d’air pour assurer une répartition homogène dans les poumons.
10. Délicatement retirer le cathéter, retirer la souris de la plate-forme de l’intubation et mettez-le sur une bouillote jusqu'à ce qu’il récupère de l’anesthésie.

3. poumon préparation pour cytométrie en flux

1. Le point de terminaison souhaité expérimentale, endormir la souris par une injection sous-cutanée d’un mélange de kétamine (100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et il euthanasier par dislocation cervicale.
2. Tremper la carcasse dans l’éthanol à 70 % et garantir la souris sur une planche de dissection à l’aide de ruban adhésif.
3. Faire une incision médiane ventrale et retourner doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. La perforation de la membrane et couper les côtes avec des ciseaux pour exposer la cavité thoracique.
4. Perfuse les poumons 3 x avec 6 à 8 mL de PBS glacé à travers le ventricule droit à l’aide d’une aiguille de 27 G après avoir coupé une petite ouverture dans le ventricule gauche pour permettre au sang de quitter. Les poumons doivent être provisionnés du sang, tourner complètement blanc.
5. Retirez les poumons et émincer les lobes en petits morceaux à l’aide de ciseaux. Transférer les morceaux de poumons dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et il incuber dans 1,5 mL de tampon de digestion de poumon (RPMI, 5 % FCS, collagénase de U/mL 150 50 U/mL DNase et j’ai j’ai).
6. Incuber le poumon pieces 30-60 min à 37 ° C et sous agitation constante.
7. Transférer la suspension de cellules pulmonaires à travers un tamis de cellule 70 µm dans un tube de 50 mL. Désactivez la passoire avec le dos d’une seringue stérile de 10 mL et rincer la crépine avec 15 mL de PBS avec 2 % FCS.
8. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de tampon de lyse (ACK) d’ammonium-chlorure-potassium et les incuber pendant 5 min à température ambiante pendant la lyse des érythrocytes résiduelles.
9. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS avec 2 % FCS et aller de l’avant avec le protocole de coloration désiré pour écoulement cytometry²³.
   Remarque : Alternativement, les cellules peuvent être charriés dans RPMI contenant 30 % de FCS et 10 % de DMSO et gelés à l’aide d’un gel contenant pour une analyse ultérieure.

Résultats

Nous avons utilisé le modèle de transplantation orthotopique par livraison de cellules tumorales par voie intratrachéale pour tester si le microenvironnement tumoral stimule expression PD-L1. Par conséquent, nous avons isolé cellules pulmonaires AC souris du modèle KP autochtone (cellules de KP), dix semaines après induction tumorale via Cre recombinase-exprimant l’adénovirus (Ad.Cre) livraison²⁴. Par la suite, nous avons marqué le poumon cellules AC en ...

Discussion

Afin d’étudier les manifestations physiologiques et pathologiques de poumon dans le poumon, méthodes intubation par voie intratrachéale invasive et non invasive pour l’instillation de différents réactifs sont largement utilisé^{26,27,28,29 ,30,31,32}. Dans le domaine du cancer, les c...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82