Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

Summary

כאן נתאר מודל השתלת orthotopic syngeneic פולשנית של תאים אדנוקרצינומה של הריאה העכבר כמודל זמן - ו בהפחתת עלויות ללמוד סרטן ריאות שאינם קטנים התא.

Abstract

השימוש העכבר מודלים היא הכרחית עבור לימוד הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות. לגבי סרטן ריאות, במספר דגמים זמינים, כולל גנטית מהונדסים מודלים, כמו גם מודלים השתלת. עם זאת, מודלים מהונדס גנטית עכבר הם זמן רב ויקר, ואילו דגמים השתלת orthotopic קשים להתרבות. כאן, שיטת משלוח intratracheal לא פולשנית של תאים סרטניים ריאות כמודל השתלת orthotopic חלופי הוא תיאר. השימוש העכבר ריאות אדנוקרצינומה תאים והנמענים שתל syngeneic מאפשר ללמוד tumorigenesis תחת הנוכחות של מערכת החיסון פעיל מלא. יתר על כן, שינויים גנטיים של גידול תאים לפני השתלת גורם מודל זה גישה לחיסכון בזמן אטרקטיבי לחקור את ההשפעה של גורמים גנטיים על הגידול ועל גידול התא גנים פרופילים בתנאים פיזיולוגיים. באמצעות מודל זה, אנו מציגים את הריאה תאים אדנוקרצינומה אקספרס רמות גבוהות של משתיק קול T-cell מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1) כאשר גדל בסביבה הטבעית שלהם לעומת טיפוח במבחנה.

Introduction

סרטן הריאות הוא עדיין עד כה הרוצח הגדול ביותר הקשורים לסרטן הן גברים והן נשים¹. ואכן, על פי האגודה האמריקנית לסרטן, כל שנה יותר אנשים מתים מסרטן הריאות מאשר של השד, הערמונית, המעי הגס סרטן ביחד¹ עד לאחרונה, רוב החולים הסובלים סרטן ריאות תאים שאינם קטנים (NSCLC), המהווה סוג המשנה הנפוץ ביותר של סרטן ריאות, טופלו עם פלטינה מבוססי כימותרפיה באווירה השורה הראשונה, בעיקר עם התוספת של אנגיוגנזה מעכבי². רק תת-ערכה של חולים בנמלים מוטציות oncogenic הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), קינאז לימפומה אנפלסטית (ALK), או ROS1, ולא יכולים להיות מטופלים עם זמינות מיקוד סמים^3,4. עם כניסתו של מעכבי המערכת החיסונית במחסום, שצמחו תקווה חדשה לחולי סרטן ריאות, אמנם עד עכשיו, רק 20-40% מהחולים מגיבים לטיפול מערכת החיסון⁵. לפיכך, בהמשך המחקר נדרש כדי לשפר את התוצאה על ידי כוונון מחסום המערכת החיסונית טיפול חוקרים את אפשרויות הטיפול combinatory.

ללמוד סרטן ריאות, מגוון רחב של מודלים פרה זמינים, כולל דגמים ספונטנית מופעלות על ידי כימיקלים, חומרים מסרטנים ועכבר מהונדס גנטית מודלים (GEMM) בו גידולים autochthonous להתעורר בעקבות הפעלת מותנה oncogenes ו/או איון של הגידול משתיק קול גנים^6,7,8. מודלים אלה הם בעלי ערך מסוים כדי לחקור תהליכי יסוד בהתפתחות סרטן ריאות, אבל הם גם דורשים עכברים נרחב רבייה, ניסויים הם זמן רב. לכן, מחקרים רבים הערכת פוטנציאל מעכבי את היתרון של מודלים xenograft תת עורית (נגזר החולה) שבו שורות תאים של סרטן ריאות אדם subcutaneously מוזרק עכברים immunodeficient⁹.

דגמים אלה, micromilieu של גידולים אינו מיוצג בהתאם; לכן, החוקרים להשתמש גם מודלים השתלת orthotopic, שבו תאים סרטניים שהם מזריקים לווריד, intrabronchially או ישירות לתוך הריאות parenchyma^{10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20}. כמה שיטות אלה הן מבחינה טכנית מאתגר, קשה להיות מועתק, וזקוקים אימונים אינטנסיביים של החוקרים. ²¹ . שינינו orthotopic לא פולשנית, intratracheal שיטת השתלת בעכברים immunocompetent, איפה גידולים לפתח בתוך 3-5 שבועות, נספח למחזהו משמעותי גידולים אנושיים, לזירוז הביטוי של T-cell משתיק קול מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1) על תאים סרטניים. ^{11 , 12 , 20} השימוש של תאים סרטניים העכבר נגזר GEMM מודלים ומאפשר עכברים הנמען syngeneic לומד נכונה של microenvironment הגידול כולל תאים חיסוניים. יתר על כן, ג'ין עריכה כלים כמו CRISPR/Cas9 טכנולוגיה²² יכול לשמש במבחנה לפני השתלת המאפשרת החקירה של ההשפעה של גורמים גנטיים בתוך הריאות tumorigenesis.

Protocol

כל ניסוי הפרוטוקולים כמתואר להלן ההנחיות אתית ואושרו על-ידי האוסטרי הפדרלי משרד המדע, מחקר וכלכלה.

הערה: פרוטוקול כאן מתאר מודל השתלת orthotopic של תאים אדנוקרצינומה של הריאה העכבר לתוך נמענים syngeneic. תאים עשויים להיות מבודד נושאות הריאות של קראס^LSL-G12D: p53^{חליל/חליל} (KP) עכברים^7,18, אם הוא זמין ללא צורך במיקור חוץ, מושתל לתוך עכברים מאותו רקע ומין. אם תאים נמסרו מקבוצות אחרות מחקר רקע המדויק אינו ידוע, אנו ממליצים על השימוש הדור F1 של הכלאה בין עכברים C57BL/6 ו- 129S כמו השתלת הנמענים כדי להבטיח עמידות מקסימאלית.

1. תא הכנה

1. KP הזרע תאים 24 שעות לפני השתלת כ 50% confluency ב RPMI בתוספת עגל עוברית 10% סרום (FCS), גלוטמין, ואת פניצילין U/mL 100 100 סטרפטומיצין μg/mL (ןלהל בינוני תרבות רגיל). דגירה של תרביות תאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ו בסביבות 95% לחות יחסית.
2. ביום הבא, קציר תאים באמצעות 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.05% בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח [PBS]) עבור 5 דקות לכל צלחת 10 ס מ ו, לאחר מכן, resuspend מנותקת תאים עם 9 מ של תקן תרבות בינוני.
3. לספור את התאים hemocytometer ולהעביר את מספר התאים הדרושים עבור הניסויים בשפופרת צנטרפוגה חרוט 50-mL.
   הערה: מומלץ משתילים בין 2.5 x 10⁵ KP עונה 1 פרק 10⁶ תאי עכבר, אבל זה יכול להיות מותאם מבוסס על הצרכים של החוקר.
4. לאחר מכן, centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב x 300 גרם, וארוקן את תגובת שיקוע, באמצעות פיפטה של, resuspend את התאים על צפיפות של 2 x 10⁷/mL (לאינהלציה של עונה 1 פרק 10⁶ KP תאי עכבר) בסרום, תרופתיים RPMI , בתוספת חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.01 M (EDTA).
5. לשמור את התאים על הקרח עד השתלת.

2. Orthotopic השתלת באמצעות משלוח Intratracheal

1. תרופת הרגעה עכבר (מגיל 8-12 שבועות) על ידי זריקה תת עורית של תערובת של קטאמין (100 mg/kg של משקל גוף) חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף).
2. בזמן ההרדמה מגדיר, להכין את הצנתר לצנרור. לכן, להקהות את המחט של צנתר על ידי חיתוך פשוט הסוף עם מספריים. לאחר מכן, דחף את הצנתר לחלוטין מעל קצה המחט.
3. לאשר את רמת ההרדמה המתאימה על ידי פדלים רפלקס באמצעות הבוהן המשרד צובט ולהחיל אופטלמולוגיות משחה לעיניים.
4. לתקן את העכבר על פלטפורמת צנרור (איור 1 א') על-ידי חיבור החותכות העליונות שלה על התפר, ובדקו כי החזה אנכי מתחת התפר.
5. במקום כבל סיב אופטי סיבים בין כאשר רגליו הקדמיות כדי להאיר את החזה (איור 1B).
6. בזהירות פתח את הפה של העכבר, להוציא את הלשון באמצעות מלקחיים שטוח מחוטא. חפשו את פליטת אור לבן כדי לאתר את הגרון והמחש את הסחוסים האפיגלוטיס ו- arytenoid (איור 1C).
7. לאחר הפתיחה של קנה הנשימה נראה בבירור, החלק בעדינות את הצנתר לתוך קנה הנשימה (איור 1D). האורך של הקטטר שיוכנס תלוי הגיל והגודל של החיה, מאז זה לא צריך להיות מתחת ההסתעפות להבטחת ריפודי כתופיים של הריאה תאים אדנוקרצינומה בתוך הריאות. להסיר במהירות את המחט של הקטטר.
8. אור לבן זורח דרך הקטטר (איור 1E) מציינים את המיקום הנכון של הקטטר לקנה. על מנת לוודא את המיקום של הקטטר לקנה, לצרף מזרק 1-mL המכיל מים הצנתר. המים במזרק ינוע במהירות מעלה מטה לפי הנשימה (איור 1F).
   הערה: שלב זה יכול להיות מושמט על ידי חוקרים מנוסים.
9. לחמם את התליה תא על-ידי החזקת את הצינורית ביד, לאחר מכן, פיפטה µL 50 של ההשעיה המכיל 1 x 10⁶ תאים (מספר התאים עשוי להיות משתנה) אל מרכז ה-hub קטטר. ההשעיה aspirated מיד. לאחר מכן, לצרף מזרק 1 מ"ל, לוותר על 300 µL של אוויר כדי להבטיח התפלגות אחידה בתוך הריאות.
10. בעדינות להסיר את הצנתר להסיר את העכבר פלטפורמת צנרור, שים את זה על כרית חום עד זה יחלים מן ההרדמה.

3. ריאות הכנה Cytometry זרימה

1. נקודת הקצה ניסיוני הרצוי, לסמם את העכבר על ידי זריקה תת עורית של תערובת של קטאמין (100 mg/kg של משקל גוף) חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), המתת חסד זה מאת נקע בצוואר הרחם.
2. להשרות את הגווייה 70% אתנול ולאבטח את העכבר על קרש חיתוך באמצעות הקלטת.
3. עושים חתך הגחון קו האמצע, היפוך בעדינות על העור כדי לחשוף את שרירי בית החזה הקיר ואת על אברי הבטן. לנקב את הסרעפת וחותכים את הצלעות עם מספריים כדי לחשוף את חלל בית החזה.
4. Perfuse הריאות 3 x 6-8 מ של PBS קר כקרח דרך החדר הימני באמצעות מחט 27 G לאחר חיתוך פתח קטן החדר השמאלי כדי לאפשר לדם לעזוב. יש לנקות את הריאות של הדם, להפוך לבן לחלוטין.
5. להוציא את הריאות, מינצ האונות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. להעביר את חתיכות ריאות צינור microcentrifuge 2 מ"ל, דגירה זה ב- 1.5 מ של מאגר עיכול בריאה (RPMI, 5% FCS, collagenase U/mL 150 ואני DNase U/mL 50 אני).
6. דגירה הריאה חתיכות 30-60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, עם טלטול מתמיד.
7. העברת התליה תא הריאות דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור 50 מ. נקה את מסננת עם גב מזרק 10-mL סטרילי ולשטוף את מסננת 15 מ של PBS עם 2% FCS.
8. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend תאי 1 מ"ל אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) מאגר lysing, דגירה אותם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר במשך פירוק של אריתרוציטים שיורית.
9. Centrifuge התאים ב x 300 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, resuspend תאי 1 מ"ל של PBS עם 2% FCS והמשך עם פרוטוקול ההגדלה הרצויה עבור cytometry זרימה²³.
   הערה: לחלופין, ייתכן resuspended התאים ב RPMI המכיל 30% FCS ו-10% דימתיל סולפוקסיד קפוא באמצעות מיכל ההקפאה לניתוח בשלב מאוחר יותר.

תוצאות

השתמשנו המודל השתלת orthotopic ויה intratracheal גידול התא משלוח כדי לבדוק אם הגידול microenvironment מעוררת את הביטוי PD-L1. לכן, אנחנו מבודדים העכבר ריאות AC תאים מהמודל KP autochthonous (KP תאים), 10 שבועות בעקבות הגידול אינדוקציה דרך לבטא-Cre-recombinase משלוח אדנו (Ad.Cre)²⁴. לאחר מכן, סיווגנו את הר?...

Discussion

במחקר ריאות הפיזיולוגיות ואירועים פיפטות בריאה, intratracheal פולשני ו פולשני שיטות צנרור החדרה של ריאגנטים שונים נמצאים בשימוש נרחב^{26,27,28,29 ,30,31,32}. בתחום הסרטן, חוקרים ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82