Ортотопическая трансплантация клеток аденокарциномы сингенных легкого учиться выражение PD-L1

Резюме

Здесь мы описываем минимально инвазивной сингенных ортотопическая модель трансплантации клеток аденокарциномы легкого мыши как сокращение времени и стоимости модель для изучения немелкоклеточного рака легкого.

Аннотация

Использование мыши модели необходимы для изучения патофизиологии различных заболеваний. Что касается рака легких несколько моделей доступны, включая генетически engineered моделей, а также трансплантация модели. Однако генетически модифицированные мыши модели являются длительным и дорогостоящим, тогда как некоторые модели трансплантации ортотопическая трудно воспроизвести. Здесь описан метод доставки неинвазивные трахею клеток опухоли легкого как альтернативного ортотопическая трансплантации модель. Использование мыши клеток аденокарциномы легкого и сингенных трансплантата получателей позволяет изучать tumorigenesis под наличие полностью активной иммунной системы. Кроме того генетические манипуляции опухолевых клеток до трансплантации делает эту модель привлекательной экономии времени подход для изучения влияния генетических факторов на рост опухоли и опухоли экспрессии генов в клетки профилей в физиологических условиях. С помощью этой модели, мы показываем, что легких аденокарциномы клетки Экспресс повышенного уровня Т-клеток супрессоров запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) при выращивании в их естественной среде по сравнению с выращиванием в пробирке.

Введение

Рак легких является еще далеко большой связанных с раком убийца в¹как мужчин, так и женщин. Действительно по данным американского общества рака, каждый год больше людей умирают от рака легких, чем груди, простаты и толстой кишки рак вместе¹. До недавнего времени, большинство пациентов, страдающих от не-немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), который является наиболее распространенным подтипа немелкоклеточного рака, лечили химиотерапии на основе платины в обстановке первой линии, главным образом с добавлением ангиогенеза Ингибиторы². Только подмножество пациентов гаваней онкогенных мутаций в рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), Анапластическая лимфомы киназы (АЛК), или в ROS1 и можно лечить с помощью доступных таргетинга наркотиков^3,4. С появлением ингибиторов иммунных контрольно-пропускной пункт возникла новая надежда для больных раком легкого, хотя до сих пор, только 20 – 40% пациентов реагировать иммунной терапии⁵. Таким образом дальнейшие исследования требуется улучшить этот результат доработки терапии иммунных контрольно-пропускной пункт и изучая комбинаторной лечения.

Для изучения рака легкого, широкий спектр доклинических моделей доступны, включая спонтанное модели вызваны химических веществ и канцерогенов и генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) где автохтонные опухоли возникают после условного активации Онкогены и/или инактивации опухолевые супрессоры гены^6,7,8. Эти модели имеют особое значение для изучения основных процессов развития опухоли легких, но они также требуют обширной мышей разведения, и эксперименты времени. Таким образом многие исследования, оценку потенциальных ингибиторов воспользоваться подкожной Ксенотрансплантат (пациент производных) моделей где человеческих легких рак клеточных линий подкожно вводят в иммунодефицитных мышей⁹.

В этих моделях micromilieu опухоли не представлены соответственно; Таким образом исследователи также использовать модели ортотопическая трансплантации, где опухолевые клетки вводят внутривенно, intrabronchially или непосредственно в легких паренхимы^{10,11,12,13, 14,,1516,,1718,19,20}. Некоторые из этих методов являются технически сложным, трудно быть воспроизведены и требуют интенсивной подготовки исследователей. ²¹ здесь мы адаптировали неинвазивной ортотопическая, метод трансплантации трахею иммунокомпетентных мышей, где опухоли развиваться в течение 3-5 недель и демонстрируют значительное сходство человека опухоли, чтобы побудить выражение Т-клеток подавитель запрограммированных смерти лиганд 1 (PD-L1) на опухолевые клетки. ^{11 , 12 , 20} использование мыши опухолевых клеток, полученных от ГЭММ модели и мышь сингенных получателей позволяет надлежащее изучение микроокружения опухоли, включая иммунные клетки. Кроме того гена, инструменты как ТРИФОСФАТЫ/Cas9 технологии²² редактирования может использоваться в лабораторных условиях до трансплантации, который облегчает изучение влияния генетических факторов в опухолей легких.

протокол

Все экспериментальные протоколы изложенные ниже следовать этическим принципам и были одобрены австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики.

Примечание: Протокол описывает модель ортотопическая трансплантации клеток аденокарциномы легкого мыши в сингенных получателей. Клетки могут быть изолированы от опухоли подшипник легких крас^LSL-G12D: p53^fl/fl (КП) мышах^7,18, при наличии собственных и пересаженные в мышей же фон и секс. Если клетки были предоставлены из других исследовательских групп и точное фон остается неизвестным, мы рекомендуем использовать поколения F1 крест между мышей C57BL/6 и 129S как пересадка получателей для обеспечения максимальной терпимости.

1. Подготовка клетки

1. Семя КП клетки 24 ч до пересадки на приблизительно 50% confluency в RPMI, дополненная плода теленка 10% сыворотки (FCS), глютамин и 100 ед/мл пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина (далее именуемые как стандартные питательной среды). Инкубировать клеточных культур при 37° C, 5% CO₂и около 95% относительной влажности.
2. На следующий день урожай клеток с использованием 1 мл трипсина-ЭДТА (0,05% в фосфат амортизированное saline [PBS]) для 5 минут за 10 см пластины и, впоследствии, Ресуспензируйте отдельные клетки с 9 мл стандартного питательной среды.
3. Подсчитать ячейки в Горяева и передавать количество клеток, необходимых для экспериментов в 50-мл конические пластиковых пробирок.
   Примечание: Мы рекомендуем пересадки между 2,5 x 10⁵ и 1 x 10-⁶ КП ячеек на мыши, но это может быть адаптирована на основе потребностей исследователя.
4. Впоследствии, центрифуга клетки для 5 мин на 300 x g, аспирационная супернатанта и, с помощью пипетки, Ресуспензируйте клетки на плотность 2 x 107/мл (для вдыхания 1 х 10⁶ клеток КП на мышь) в сыворотке и антибиотик бесплатно RPMI , дополненный 0,01 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА).
5. Держите клетки на льду до трансплантации.

2. ортотопическая трансплантация через трахею доставки

1. Степенный мышь (8-12 недель возраста) подкожно смесь кетамин (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (10 мг/кг веса тела).
2. В то время как анестезии устанавливает в, подготовьте катетер для интубации. Таким образом тупым иглы катетера, просто резки конце ножницами. Потом задвиньте катетер на конце иглы.
3. Подтверждения соответствующий уровень анестезии, педали рефлекс через фирмы мыс щипать и применять глазной мази в глаза.
4. Исправьте мыши на платформе интубации (рис. 1A) путем ее верхних резцов над швом и подтверждают, что грудь вертикальный под шов.
5. Место волоконно-оптического кабеля между передней ноги, чтобы осветить груди (рис. 1B).
6. Осторожно открыть рот мыши и вытащить язык, с помощью вылеченных плоскими щипцами. Ищите выбросов белый свет для обнаружения гортани и визуализировать надгортанник и arytenoid хрящей (рис. 1 c).
7. После открытия трахеи ясно видна, осторожно задвиньте катетер в трахею (рис. 1 d). Длина катетера для вставки зависит от возраста и размера животного, так как он не должен идти ниже бифуркации обеспечить равномерное распределение легких аденокарциномы клетки в легких. Быстро удалите иглу из катетера.
8. Правильное размещение катетера в трахею обозначается белый свет, который светит через катетер (Рисунок 1E). Для подтверждения размещения катетера в трахею, приложите 1 мл шприц, содержащих воду в катетер. Вода в шприц будет быстро перемещаться вверх и вниз в соответствии с дыханием (Рисунок 1F).
   Примечание: Этот шаг может быть опущен опытными исследователями.
9. Согреться суспензию клеток, держа трубку в руке и, впоследствии, Пипетка 50 мкл суспензии, содержащей 1 х 10⁶ клеток (количество клеток может быть переменная) в центр катетер концентратора. Подвеска будет придыханием немедленно. Впоследствии приложите 1 мл шприц и отказаться от 300 мкл воздуха, чтобы обеспечить равномерное распределение в легких.
10. Аккуратно удалите катетер, удалите мышь от платформы интубации и положил его на площадку тепла до тех пор, пока он восстанавливает от анестезии.

3. легких подготовка для проточной цитометрии

1. В желаемой экспериментальной конечной точке степенный мыши подкожно смесь кетамин (100 мг/кг массы тела) и ксилазина (10 мг/кг массы тела) и усыпить, шейки матки дислокации.
2. Замочите каркаса в 70% этанола и зафиксируйте мыши на доске рассечение, с помощью липкой ленты.
3. Сделать разрез брюшной срединной и осторожно перевернуть кожи подвергать мышцы грудной стенки и органов брюшной полости. Прокол диафрагмы и вырезать ножницами подвергать грудной полости ребер.
4. Perfuse легких 3 x с 6-8 мл ледяной PBS покинуть через правый желудочек, с помощью иглы 27 G после резки небольшое отверстие в левом желудочке, чтобы позволить крови. Легкие должны быть очищены от крови и очередь полностью белым.
5. Возьмите легкие и фарш долей на мелкие кусочки с помощью ножниц. Передача части легких в 2-мл пробирку microcentrifuge и инкубировать в 1,5 мл легкого пищеварения буфера (RPMI, 5% FCS, 150 ед/мл коллагеназы я и 50 ед/мл DNase I).
6. Инкубировать легких штук 30-60 минут при 37 ° C и постоянном встряхивании.
7. Перенесите суспензию клеток легких через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки. Снимите сетчатый фильтр с задней части стерильный шприц 10 мл и промойте ситечко с 15 мл PBS с 2% FCS.
8. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант. Ресуспензируйте клеток в 1 мл раствора аммония хлорид калия (ACK) лизировать буфер и проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре для lysis остаточного эритроцитов.
9. Центрифуга клетки на 300 x g 5 минут при температуре 4 ° C и Ресуспензируйте клеток в 1 мл PBS с 2% FCS и приступить к желаемой окрашивание протокол для потока цитометрии²³.
   Примечание: Кроме того, клетки могут быть высокомобильна в RPMI, содержащий 30% FCS и 10% ДМСО и замороженные, с использованием замораживания контейнер для последующего анализа.

Результаты

Мы использовали модель трансплантации ортотопическая через трахею опухолевых клеток доставки для проверки ли микроокружения опухоли стимулирует выражение PD-L1. Таким образом мы изолированные клетки легких AC мыши из автохтонных модели КП (КП клетки), 10 недель после ин?...

Обсуждение

Для изучения легких физиологические и патологические события в легких, трахею инвазивные и неинвазивные методы интубации для инстилляций различных реагентов, широко используемых в^{26,27,28,29 ,30,}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82