Trasplante ortotópico de células de Adenocarcinoma de pulmón Syngeneic para estudiar la expresión de PD-L1

Resumen

Aquí describimos un modelo de trasplante orthotopic syngeneic mínimamente invasivo de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón como un modelo de reducción de costos y tiempo para el estudio de cáncer de pulmón de células no pequeñas.

Resumen

El uso de modelos de ratón es indispensable para el estudio de la fisiopatología de diversas enfermedades. Con respecto al cáncer de pulmón, varios modelos están disponibles, incluyendo genéticamente diseñado modelos como modelos de trasplante. Sin embargo, modelos de ratón modificados genéticamente son lentos y caros, mientras que algunos modelos de trasplante ortotópico son difíciles de reproducir. Aquí, se describe un método de entrega intratraqueal no invasivo de las células tumorales de pulmón como un modelo de trasplante orthotopic alternativos. El uso de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón y receptores de injerto syngeneic permite estudiar tumorigenesis bajo la presencia de un sistema inmune activo. Además, las manipulaciones genéticas del tumor células antes del trasplante hace este modelo un atractivo enfoque de ahorro de tiempo para estudiar el impacto de los factores genéticos en el crecimiento del tumor y la expresión de gene de la célula de tumor perfiles bajo condiciones fisiológicas. Usando este modelo, demostramos eso pulmón células de adenocarcinoma expresados niveles crecientes del supresor de T-cell programan ligando de muerte 1 (PD-L1) cuando cultivadas en su entorno natural en comparación con el cultivo in vitro.

Introducción

Cáncer de pulmón es todavía en gran medida el más grande asesino relacionado con el cáncer en hombres y mujeres¹. De hecho, según la American Cancer Society, cada año más personas mueren de cáncer de pulmón que de mama, próstata y colon cáncer juntos¹. Hasta hace poco, la mayoría de los pacientes que sufren de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), que es el más abundante subtipo de cáncer de pulmón, fueron tratada con quimioterapia basada en platino en un entorno de primera línea, sobre todo con la adición de la angiogénesis inhibidores de la². Sólo un subconjunto de pacientes alberga las mutaciones oncogénicas en el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), kinasa del linfoma anaplásico (ALK), o en ROS1 y puede tratarse con medicamentos dirigidos a disposición^3,4. Con el advenimiento de los inhibidores de control inmune, ha surgido la nueva esperanza para pacientes con cáncer de pulmón, aunque hasta ahora, sólo un 20-40% de los pacientes responden a la terapia inmune⁵. Por lo tanto, se necesita investigación adicional para mejorar este resultado por ajuste terapia inmune checkpoint e investigando opciones de tratamiento combinatorio.

Para estudiar el cáncer de pulmón, una gran variedad de modelos preclínicos están disponible, incluyendo modelos espontáneos provocados por productos químicos y agentes carcinógenos y ratón genéticamente modelos (GEMM) donde se presentan tumores autóctonos tras la activación condicional de oncogenes o la inactivación de tumor supresor genes^6,7,8. Estos modelos son de particular valor para investigar los procesos fundamentales en el desarrollo del tumor de pulmón, pero también requieren extensa ratones de cría, y los experimentos son desperdiciadores de tiempo. Por lo tanto, muchos estudios evaluando potenciales inhibidores aprovechan modelos de xenoinjerto subcutáneo (paciente de origen) en líneas celulares de cáncer humano de pulmón se inyectan por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes⁹.

En estos modelos, la micromilieu de tumores no está representado en consecuencia; por lo tanto, los investigadores también utilizan modelos de trasplante orthotopic, donde las células del tumor se inyectan por vía intravenosa, intrabronchially o directamente en el pulmón parénquima^{10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20}. Algunos de estos métodos son un desafío técnico, difícil de reproducir y requieren una capacitación intensiva de los investigadores. ²¹ aquí adaptamos un orthotopic invasiva, método de trasplante intratraqueal en ratones inmunocompetentes, donde los tumores desarrollan dentro de 3-5 semanas y exhiben semejanzas significativas en los tumores humanos, inducir la expresión de la célula de T supresor programados ligando de muerte 1 (PD-L1) en las células del tumor. ^{11 , 12 , 20} el uso de las células tumorales de ratón derivadas de modelos GEMM y ratones receptores syngeneic permite el estudio adecuado del microambiente tumoral incluyendo las células inmunes. Además, gen herramientas como CRISPR/Cas9 tecnología²² de edición puede ser utilizado in vitro antes de un trasplante que facilita la investigación del impacto de factores genéticos en la tumorogénesis pulmonar.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales como se describe a continuación siguen las directrices éticas y fueron aprobados por el Ministerio Federal austríaco de la ciencia, la investigación y la economía.

Nota: El protocolo aquí describe un modelo de trasplante ortotópico de células de adenocarcinoma de pulmón de ratón en los receptores syngeneic. Las células pueden ser aisladas de pulmones con tumores de Kras^LSL-G12D: p53^fl/fl (KP) ratones^7,18, si están disponibles en el local y trasplantado en ratones del mismo fondo y sexo. Si las células se de otros grupos de investigación y el fondo exacto sigue siendo desconocido, se recomienda el uso de la generación F1 de un cruce entre ratones C57BL/6 y 129S como para garantizar la máxima tolerancia del trasplante.

1. preparación de la célula

1. Las células de KP semilla 24 h antes del trasplante en aproximadamente 50% de confluencia en RPMI suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), glutamina y 100 U/mL de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina (en lo sucesivo como medio de cultivo estándar). Incubar los cultivos celulares a 37° C, 5% CO₂y alrededor del 95% de humedad relativa.
2. Al día siguiente, las células con 1 mL de tripsina-EDTA (0,05% en solución salina tamponada con fosfato [PBS]) por 5 min por placa de 10 cm de la cosecha y, posteriormente, resuspender las células separadas con 9 mL de medio de cultivo estándar.
3. Contar las células en un hemocitómetro y transferir el número de células necesarias para los experimentos en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
   Nota: Se recomienda trasplantar entre KP 1 x 10⁶ y 2.5 x 10⁵ células por ratón, pero esto podría ser adaptado basado en las necesidades del investigador.
4. Posteriormente, centrifugar las células durante 5 min a 300 x gaspirar el sobrenadante y, usando una pipeta, resuspender las células en una densidad de 2 x 107/ml (por la inhalación de 1 x 10⁶ células de KP por ratón) en el suero y antibióticos RPMI , complementado con 0.01 M de ácido etilendiaminotetracético (EDTA).
5. Mantener las células en hielo hasta el trasplante.

2. trasplante orthotopic vía intratraqueal entrega

1. Sedar a un ratón (8-12 semanas de edad) mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal).
2. Mientras que la anestesia se establece, preparar el catéter para la intubación. Por lo tanto, embota la aguja de un catéter cortando el extremo con las tijeras. Después, empuje completamente el catéter en el extremo de la aguja.
3. Confirmar el nivel de anestesia adecuado pedal reflejo a través del dedo del pie firme pellizcando y aplicar pomada oftálmica en los ojos.
4. Fijar el ratón en la plataforma de intubación (figura 1A) enganchando sus incisivos superiores sobre una sutura y confirmar que el pecho es vertical por debajo de la sutura.
5. Coloque un cable de fibra óptica entre las patas delanteras para iluminar el pecho (figura 1B).
6. Cuidadosamente abra la boca del ratón y sacar la lengua con unas pinzas desinfectadas de planas. Busque la emisión de luz blanca para ubicar la laringe y visualizar las epiglotis y aritenoides cartílagos (figura 1).
7. Una vez que la abertura de la tráquea es claramente visible, deslice suavemente la sonda en la tráquea (figura 1). La longitud del catéter a introducir depende de la edad y el tamaño del animal, ya que no debe ir por debajo de la bifurcación para garantizar una distribución uniforme del pulmón de células de adenocarcinoma de pulmón. Retire rápidamente la aguja del catéter.
8. La correcta colocación del catéter en la tráquea está indicada por la luz blanca brillante a través del catéter (Figura 1E). Para confirmar la colocación del catéter en la tráquea, acople una jeringa de 1 mL que contiene agua al catéter. El agua en la jeringa rápidamente se moverá hacia arriba y hacia abajo según la respiración (Figura 1F).
   Nota: Este paso puede ser omitido por los investigadores con experiencia.
9. Calentar la suspensión de la célula manteniendo el tubo en la mano y, posteriormente, pipetee 50 μl de la suspensión que contiene 1 x 10⁶ células (el número de células puede ser variable) en el centro de la muesca del catéter. La suspensión será aspirada inmediatamente. Posteriormente, conectar una jeringa de 1 mL y añada 300 μL de aire para asegurar una distribución uniforme dentro de los pulmones.
10. Suavemente Retire el catéter, quitar el ratón de la plataforma de la intubación y ponerlo en una almohadilla de calor hasta que recupera de la anestesia.

3. pulmón preparación para citometría de flujo

1. En el extremo experimental deseado, SEDAR el ratón mediante una inyección subcutánea de una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) y eutanasia por dislocación cervical.
2. Remoje el cadáver en etanol al 70% y asegure el ratón sobre una tabla de disección utilizando cinta.
3. Haga una incisión de línea media ventral e invierta suavemente la piel para dejar al descubierto los músculos de la pared torácica y los órganos abdominales. Perfore la membrana y corte las costillas con unas tijeras para exponer la cavidad torácica.
4. Perfusión de los pulmones 3 x 6-8 ml de PBS helado a través del ventrículo derecho con una aguja de 27 G después de cortar una abertura pequeña en el ventrículo izquierdo para permitir que la sangre salir. Los pulmones deben borrarse de la sangre y vuelta completamente blanco.
5. Sacar los pulmones y pique los lóbulos en trozos pequeños con unas tijeras. Transferir las piezas del pulmón a un tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar en 1,5 mL de tampón de digestión pulmonar (RPMI, 5% FCS, colagenasa U/mL 150 I y 50 U/mL DNasa I).
6. Incubar el pulmón piezas 30-60 min a 37 ° C y con agitación constante.
7. Transfiera la suspensión de células de pulmón a través de un tamiz de célula 70 μm en un tubo de 50 mL. Limpiar el filtro con la parte posterior de una jeringa estéril de 10 mL y enjuagar el filtro con 15 mL de PBS con FCS 2%.
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de buffer lisis de amonio cloruro de potasio (ACK) e Incube por 5 min a temperatura ambiente durante la lisis de los eritrocitos residuales.
9. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y resuspender las células en 1 mL de PBS con 2% de FCS y proceder con el protocolo de tinción deseado para citometría de flujo²³.
   Nota: Alternativamente, pueden ser serán suspendidas las células en RPMI conteniendo 30% FCS y 10% DMSO y congelado utilizando un recipiente congelación para posterior análisis.

Resultados

Se utilizó el modelo de trasplante ortotópico vía intratraqueal entrega de células de tumor para probar si el microambiente tumoral estimula la expresión de PD-L1. Por lo tanto, se aislaron células de pulmón AC de ratón desde el modelo autóctono de KP (células de KP), 10 semanas después de inducción de tumor a través expresión recombinase de Cre adenovirus (Ad.Cre) entrega²⁴. Posteriormente, etiquetamos el pulmón células AC usando una proteína fluo...

Discusión

Para estudiar eventos fisiológicos y patológicos del pulmón en el pulmón, métodos de intubación endotraqueal invasiva y no invasiva para la instilación de diversos reactivos son ampliamente utilizado^{26,27,28,29 ,30,31,32}. En el campo del cáncer, los investigadores utilizan la intrat...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82