Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

Riepilogo

Qui descriviamo un modello di trapianto orthotopic syngeneic minimamente invasiva delle cellule di adenocarcinoma del polmone del topo come un modello di tempo - e riduzione dei costi per studiare il cancro del polmone non a piccole cellule.

Abstract

L'utilizzo di modelli murini è indispensabile per lo studio della fisiopatologia delle malattie varie. Per quanto riguarda il cancro del polmone, sono disponibili diversi modelli, tra cui geneticamente ingegnerizzati modelli così come i modelli di trapianto. Tuttavia, modelli murini geneticamente sono lunghe e costose, considerando che alcuni modelli di trapianto orthotopic sono difficili da riprodurre. Qui, un metodo di consegna intratracheale non invasiva delle cellule del tumore del polmone come un modello di trapianto ortotopico alternativo è descritto. L'uso di cellule di adenocarcinoma del polmone del topo e destinatari di trapianto syngeneic permette di studiare il tumorigenesis in presenza di un sistema immunitario pienamente attiva. Inoltre, le manipolazioni genetiche del tumore le cellule prima di trapianto rende questo modello un approccio attraente di risparmiare tempo per studiare l'impatto dei fattori genetici sulla crescita del tumore e l'espressione genica delle cellule di tumore profili in condizioni fisiologiche. Utilizzando questo modello, vi mostriamo quello polmone cellule dell'adenocarcinoma espresso livelli aumentati del soppressore T-cellula programmata morte-legante 1 (PD-L1) quando coltivate nel loro ambiente naturale rispetto alla coltivazione in vitro.

Introduzione

Cancro ai polmoni è ancora di gran lunga il più grande assassino di neoplasia in uomini e donne¹. Infatti, secondo l'American Cancer Society, ogni anno più persone muoiono di cancro al polmone rispetto al seno, prostata e colon cancro insieme¹. Fino a poco tempo, la maggior parte dei pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), che è il sottotipo più abbondante del cancro del polmone, sono stata curata con la chemioterapia platino-basata in un ambiente di prima linea, per lo più con l'aggiunta dell'angiogenesi inibitori². Solo un sottoinsieme dei pazienti porti mutazioni oncogeniche nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), chinasi anaplastic di linfoma (ALK) o in ROS1 e può essere trattato con farmaci targeting disponibili:^3,4. Con l'avvento degli inibitori di checkpoint immuni, nuova speranza per i malati di cancro del polmone è sorto, anche se fino ad ora, solo il 20-40% dei pazienti risponde alla terapia immune⁵. Quindi, ulteriore ricerca è necessaria per migliorare questo risultato di fine-tuning terapia immunitaria checkpoint e indagando le opzioni di trattamento combinatorio.

Per studiare il cancro del polmone, una vasta gamma di modelli preclinici sono disponibile, compresi i modelli spontanee innescato da prodotti chimici e agenti cancerogeni e geneticamente costruito del topo modelli (GEMM) dove i tumori autoctoni derivano dopo l'attivazione condizionale del oncogeni e/o l'inattivazione di tumore soppressore geni^6,7,8. Questi modelli sono di particolare valore per indagare i processi fondamentali nello sviluppo del tumore del polmone, ma richiedono anche topi vasti allevamento, e gli esperimenti sono che richiede tempo. Di conseguenza, molti studi che valutano potenziali inibitori sfruttare modelli sottocutaneo dello xenotrapianto (paziente-derivato) dove linee cellulari del cancro del polmone umano vengono iniettati per via sottocutanea in topi immunodeficienti⁹.

In questi modelli, la micromilieu dei tumori non è rappresentato in conseguenza; quindi, i ricercatori usano anche modelli di trapianto ortotopico, dove le cellule del tumore sono iniettate per via endovenosa, intrabronchially o direttamente nel polmone parenchima^{10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20}. Alcuni di questi metodi sono tecnicamente impegnativi, difficili da essere riprodotto e richiedono una formazione intensiva dei ricercatori. ²¹ qui abbiamo adattato un invasivo ortotopico, intratracheale metodo di trapianto in topi immunocompetenti, dove i tumori si sviluppano entro 3-5 settimane ed esibiscono le somiglianze significative di tumori umani, di indurre l'espressione della T-cellula soppressore programmata morte-legante 1 (PD-L1) sulle cellule del tumore. ^{11 , 12 , 20} l'uso delle cellule del tumore del mouse derivati da modelli di GEMM e topi syngeneic destinatari permette di studiare corretta del microambiente tumorale tra cui cellule del sistema immunitario. Inoltre, gene editing strumenti come CRISPR/Cas9 tecnologia²² può essere impiegato in vitro prima del trapianto che facilita l'indagine dell'impatto dei fattori genetici in tumorigenesis del polmone.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali come indicato qui sotto seguono linee guida etiche e sono stati approvati dal Ministero federale austriaco della scienza, ricerca ed economia.

Nota: Il protocollo qui descrive un modello di trapianto ortotopico di cellule di adenocarcinoma del polmone del topo in syngeneic destinatari. Le cellule possono essere isolate dai polmoni del tumore-cuscinetto di Kras^LSL-G12D: p53^fl/fl (KP) topi^7,18, se disponibile in-House e trapiantate in topi dello stesso sesso e sfondo. Se le cellule sono state fornite da altri gruppi di ricerca e sullo sfondo esatto rimane sconosciuto, si consiglia l'uso della generazione F1 di un incrocio tra topi C57BL/6 e 129S come destinatari per garantire massima tolleranza di trapianto.

1. cella preparazione

1. KP seme cellule 24 h prima di trapianto al circa il 50% confluency in RPMI completati con 10% siero fetale del vitello (FCS), glutammina e 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (in appresso denominato "il terreno di coltura standard"). Incubare le colture a 37° C, 5% CO₂e circa 95% di umidità relativa.
2. Il giorno successivo, raccogliere le cellule con 1 mL di tripsina-EDTA (0.05% in tampone fosfato salino [PBS]) per 5 min per piastra di 10 cm e, successivamente, risospendere le cellule indipendente con 9 mL di medium di coltura standard.
3. Contare le celle in un emocitometro e trasferire il numero di cellule necessarie per gli esperimenti in una provetta conica per centrifuga da 50 mL.
   Nota: Si consiglia di trapiantare tra 2,5 x 10⁵ e KP 1 x 10⁶ cellule per topo, ma questo potrebbe essere adattato in base alle esigenze del ricercatore.
4. Successivamente, centrifugare le cellule per 5 min a 300 x g, aspirare il supernatante e, utilizzando una pipetta, risospendere le cellule ad una densità di 2 x 107/ml (per l'inalazione di 1 x 10⁶ cellule KP per topo) in siero e senza antibiotico RPMI , completati con 0,01 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
5. Mantenere le cellule su ghiaccio fino al trapianto.

2. trapianto orthotopic via intratracheale consegna

1. Sedare un mouse (8-12 settimane di età) tramite un'iniezione sottocutanea di una miscela di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo).
2. Mentre l'anestesia imposta, è possibile preparare il catetere per l'intubazione. Di conseguenza, smussato l'ago di un catetere semplicemente tagliando l'estremità con le forbici. In seguito, spingere il catetere completamente sopra l'estremità dell'ago.
3. Confermare il livello appropriato di anestesia da pedale riflessa tramite ditta punta pizzicamento e applicare unguento oftalmico agli occhi.
4. Difficoltà il mouse sulla piattaforma di intubazione (Figura 1A) agganciando i suoi incisivi superiori sopra una sutura e confermare che il petto è verticale sotto la sutura.
5. Inserire un cavo in fibra ottica tra le zampe anteriori per illuminare il torace (Figura 1B).
6. Attentamente, aprire la bocca del mouse e tirare fuori la lingua usando il forcipe piatto disinfettato. Cercare l'emissione di luce bianca per individuare la laringe e visualizzare l'epiglottide e Muscolo aritenoideo cartilagini (Figura 1).
7. Una volta che l'apertura della trachea è chiaramente visibile, scivolare delicatamente il catetere nella trachea (Figura 1). La lunghezza del catetere deve essere inserito dipende l'età e le dimensioni dell'animale, dal momento che non dovrebbe andare sotto la biforcazione per garantire una distribuzione uniforme del polmone cellule dell'adenocarcinoma all'interno del polmone. Rimuovere rapidamente l'ago dal catetere.
8. Il corretto posizionamento del catetere nella trachea è indicato dalla luce bianca brillante attraverso il catetere (Figura 1E). Al fine di confermare il posizionamento del catetere nella trachea, fissare una siringa da 1 mL contenente acqua al catetere. L'acqua nella siringa si sposterà rapidamente su e giù in conformità con la respirazione (Figura 1F).
   Nota: Questo passaggio può essere omesso da ricercatori esperti.
9. Riscaldare la sospensione cellulare tenendo in mano il tubo e, successivamente, pipettare 50 µ l della sospensione contenente 1 x 10⁶ cellule (il numero delle cellule può essere variabile) nel centro del catetere. La sospensione verrà aspirata immediatamente. Successivamente, collegare una siringa da 1 mL e dispensare 300 µ l di aria per assicurare una distribuzione coerenza all'interno dei polmoni.
10. Delicatamente rimuovere il catetere, togliere il mouse dalla piattaforma di intubazione e metterlo su un pad termico fino a quando si recupera l'effetto dell'anestesia.

3. polmone preparazione per citometria a flusso

1. Presso l'endpoint desiderato sperimentale, sedare il mouse tramite un'iniezione sottocutanea di una miscela di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) ed eutanasia e di dislocazione cervicale.
2. Immergere la carcassa in etanolo al 70% e garantire il mouse su una tavola di dissezione con del nastro.
3. Fare un'incisione ventrale del midline e capovolgere delicatamente la pelle per esporre i muscoli della parete toracica e gli organi addominali. Perforare il diaframma e tagliare le costole con le forbici per esporre la cavità toracica.
4. Irrorare i polmoni 3 x 6-8 ml di PBS ghiacciata attraverso il ventricolo di destra utilizzando un ago da 27 G dopo aver tagliato una piccola apertura nel ventricolo sinistro per consentire sangue a lasciare. Devono essere deselezionati i polmoni di sangue e Disabilita completamente bianco.
5. Prendere fuori i polmoni e tritare i lobi in piccoli pezzi con le forbici. Trasferire i pezzi di polmone ad un tubo del microcentrifuge 2 mL e viene quindi incubato in 1,5 mL di tampone di digestione del polmone (RPMI, 5% FCS, collagenasi di 150 U/mL ho e 50 U/mL dnasi io).
6. Incubare il polmone pezzi 30-60 min a 37 ° C e con agitazione costante.
7. Trasferire la sospensione delle cellule del polmone attraverso un colino di cella 70 µm in una provetta da 50 mL. Deselezionare il filtro con il dorso di una siringa sterile da 10 mL e risciacquare il filtro con 15 mL di PBS con 2% di FCS.
8. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C e aspirare il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone lisante di ammonio-cloruro-potassio (ACK) e li Incubare per 5 min a temperatura ambiente per la lisi degli eritrociti residui.
9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C e risospendere le cellule in 1 mL di PBS con 2% FCS e procedere con il protocollo di colorazione desiderato per flusso cytometry²³.
   Nota: In alternativa, le cellule possono essere risospesi in RPMI contenente 30% FCS e 10% DMSO e congelato utilizzando un contenitore di congelamento per un'analisi successiva.

Risultati

Abbiamo usato il modello di trapianto ortotopico via intratracheale consegna di cellule del tumore per verificare se il microambiente tumorale stimola l'espressione di PD-L1. Di conseguenza, abbiamo isolato cellule di topo polmone AC dal modello KP autoctono (cellule KP), 10 settimane dopo induzione del tumore tramite Cre-ricombinasi-espressione dell'adenovirus (Ad.Cre) consegna²⁴. Successivamente, abbiamo etichettato il polmone cellule AC usando una proteina fluor...

Discussione

Per studiare gli eventi fisiologici e patologici del polmone nel polmone, metodi di intubazione endotracheale invasive e non invasive per l'instillazione di vari reagenti sono ampiamente usato^{26,27,28,29 ,30,31,32}. Nel campo del cancro, i ricercatori usano l'intratracheale (e intranasale) i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82