Orthotopen Transplantation von Phänomen Lungenzellen Adenokarzinom, PD-L1 Ausdruck zu studieren

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine minimalinvasive Phänomen orthotopen Transplantation Modell der Lunge Adenokarzinom Mauszellen als Zeit und kostensenkende Modell, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zu studieren.

Zusammenfassung

Die Nutzung von Maus-Modellen ist unverzichtbar für die Erforschung der Pathophysiologie von verschiedenen Krankheiten. In Bezug auf Lungenkrebs gibt es mehrere Modelle, einschließlich gentechnisch Modelle sowie Transplantation Modelle entwickelt. Gentechnisch veränderte Mausmodelle sind jedoch aufwändig und teuer, während einige orthotopen Transplantation Modelle schwer zu reproduzieren sind. Hier ist eine nicht-invasive intratrachealen Übermittlungsmethode der Lunge Tumorzellen als alternative orthotopen Transplantation Modell beschrieben. Die Nutzung von Maus Lungenzellen Adenokarzinom und Phänomen Transplantat-Empfänger ermöglicht Studium der Tumorgenese unter Anwesenheit eines voll aktiven Immunsystems. Darüber hinaus genetische Manipulationen der Tumor Zellen vor Transplantation macht dieses Modell eine attraktive zeitsparende Ansatz zur Untersuchung der Auswirkungen von genetischen Faktoren auf Tumorwachstum und Tumor Zelle Genexpression unter physiologischen Bedingungen Profile. Mit Hilfe dieses Modells zeigen wir diese Lunge Adenokarzinom Zellen programmiert express erhöhte Spiegel von der T-Zell-Suppressor Tod-Liganden 1 (PD-L1) Wenn Sie in ihrer natürlichen Umgebung im Vergleich zum Anbau in-vitro-angebaut.

Einleitung

Lungenkrebs ist nach wie vor bei weitem die krebsbedingte Todesursache bei Männern und Frauen¹. In der Tat, nach der American Cancer Society, Menschen Sie jedes Jahr sterben mehr an Lungenkrebs zu erkranken als der Brust-, Prostata- und Darmkrebs Krebs zusammen¹. Bis vor kurzem wurden die Mehrheit der Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die am häufigsten vorkommende Subtyp an Lungenkrebs zu erkranken, mit Platin-basierten Chemotherapie in einer Erstlinien Umgebung, meist mit dem Zusatz von Angiogenese behandelt. Inhibitoren². Nur eine Teilmenge der Patienten birgt Onkogene Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), anaplastische Lymphom Kinase (ALK) oder ROS1, und mit verfügbaren targeting Drogen^3,4behandelt werden kann. Mit dem Aufkommen von immun Checkpoint-Inhibitoren entstanden neuer Hoffnung für Patienten mit Lungenkrebs, obwohl bis jetzt nur 20 – 40 % der Patienten reagieren auf Immuntherapie⁵. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um dieses Ergebnis zu verbessern, indem Sie Feinabstimmung immun Checkpoint Therapie und Untersuchung von kombinatorischen Behandlungsmöglichkeiten.

Um Lungenkrebs zu studieren, eine breite Palette von präklinischen Modellen stehen zur Verfügung, einschließlich spontane Modelle ausgelöst durch Chemikalien und Karzinogene und gentechnisch Maus Modelle (GEMM) wo autochthone Tumoren im Anschluss an die bedingte Aktivierung des entstehen Onkogene und/oder die Inaktivierung von Tumorsuppressor Gene^6,7,8. Diese Modelle sind von besonderem Wert zu untersuchen, grundlegende Prozesse in der Entwicklung von Lungen-Tumoren, aber sie erfordern auch umfangreiches Mäuse züchten, und Experimente sind zeitaufwendig. Deshalb nutzen viele Studien bewerten potentielle Inhibitoren subkutane (Patienten-abgeleitet) Xenograft Modelle menschlichen Lunge-Krebs-Zell-Linien werden wo in immungeschwächte Mäuse⁹subkutan injiziert.

In diesen Modellen wird die Micromilieu von Tumoren nicht entsprechend dargestellt. Daher verwenden die Forscher auch orthotopen Transplantation Modelle, wo werden Tumorzellen intravenös, intrabronchially oder direkt in die Lunge Parenchym^{10,11,12,13injiziert, 14,15,16,17,18,19,20}. Einige dieser Methoden sind technisch anspruchsvoll, schwer reproduziert werden und erfordern intensive Ausbildung der Forscher. ²¹ hier angepasst wir eine nicht-invasive orthotopen, intratrachealen Haartransplantation Methode bei immunkompetenten Mäusen, denen Tumoren entwickeln sich innerhalb 3-5 Wochen und weisen deutliche Ähnlichkeiten zum menschlichen Tumoren induzieren die Expression von der T-Zell Suppressor programmierten Tod-Liganden 1 (PD-L1) auf Tumorzellen. ^{11 , 12 , 20} die Nutzung von Maus Tumorzellen von GEMM Modellen abgeleitet und Phänomen Empfänger Mäuse ermöglicht ordnungsgemäßen Studium der der Tumor Mikroumgebung einschließlich Immunzellen. Darüber hinaus kann gen Bearbeitungstools wie CRISPR/Cas9 Technologie²² in vitro vor der Transplantation verwendet werden, die die Untersuchung der Auswirkungen der genetischen Faktoren bei der Lunge Tumorgenese erleichtert.

Protokoll

Alle experimentelle Protokolle wie unten ethischen Richtlinien und wurden genehmigt durch das Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft.

Hinweis: Das Protokoll hier beschreibt eine Orthotopic Transplantation Modell der Lunge Adenokarzinom Mauszellen in Phänomen Empfänger. Zellen können isoliert von Tumor-tragenden Lungen von Kras^LSL-G12Dwerden: p53^fl/fl (KP) Mäuse^7,18, falls vorhanden Inhouse und transplantierten in Mäuse von den gleichen Hintergrund und Sex. Wenn Zellen aus anderen Arbeitsgruppen zur Verfügung gestellt wurden und die genaue Hintergründe unbekannt bleibt, empfehlen wir die Verwendung der F1-Generation eine Kreuzung zwischen C57BL/6 und 129S Mäuse wie Empfänger garantieren maximale Toleranz zu verpflanzen.

1. Zelle-Vorbereitung

1. Samen KP Zellen 24 h vor der Transplantation bei ca. 50 % Konfluenz in RPMI mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), Glutamin, 100 U/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin (nachfolgend standard Kulturmedium) ergänzt. Inkubieren Sie die Zellkulturen bei 37° C, 5 % CO₂und rund 95 % Relative Luftfeuchtigkeit.
2. Am nächsten Tag mit 1 mL Trypsin-EDTA (0,05 % Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS]) für 5 min pro 10 cm Platte Zellen zu ernten Sie und anschließend Aufschwemmen Sie freistehende Zellen mit 9 mL standard Kulturmedium.
3. Zählen der Zellen in einem Hemocytometer und übertragen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Versuche in einer konischen Zentrifugenröhrchen 50 mL benötigt.
   Hinweis: Wir empfehlen Transplantation von Zellen per Mausklick zwischen 2,5 x 10,⁵ und 1 x 10⁶ KP, aber dies könnte anhand des Forschers Anforderungen angepasst werden.
4. Anschließend Zentrifugieren der Zellen für 5 min bei 300 X g, den Überstand abgesaugt und mit einer Pipette, die Zellen bei einer Dichte von 2 x 10⁷/mL (für die Inhalation von 1 x 10⁶ KP Zellen pro Maus) im Serum und antibiotikafreien RPMI Aufschwemmen , ergänzt mit 0,01 M Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA).
5. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Transplantation.

(2) orthotopen Transplantation über intratrachealen Lieferung

1. Beruhigen Sie eine Maus (8-12 Wochen alt) durch eine subkutane Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht).
2. Während die Narkose einstellt, bereiten Sie den Katheter für Intubation. Daher, stumpfe Nadel eines Katheters durch einfaches Ende mit einer Schere abschneiden. Danach schieben Sie den Katheter komplett über das Ende der Nadel.
3. Bestätigen Sie die angemessene Höhe der Anästhesie durch Pedal reflex über feste Zeh kneifen und gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen.
4. Beheben Sie die Maus auf die Intubation Plattform (Abbildung 1A) durch Einhaken der oberen Schneidezähne über eine Naht zu und bestätigen Sie, dass die Brust unterhalb der Naht senkrecht steht.
5. Legen Sie ein LWL-Kabel zwischen den Vorderbeinen, die Brust (Abbildung 1 b) zu beleuchten.
6. Vorsichtig das Maul der Maus und ziehen Sie die Zunge mit desinfizierten flache Pinzette. Suchen Sie nach der Emission des weißen Lichts zu lokalisieren den Kehlkopf und visualisieren die Epiglottis und Arytenoid Knorpel (Abbildung 1).
7. Sobald die Öffnung der Luftröhre deutlich sichtbar ist, schieben Sie den Katheter in die Luftröhre (Abbildung 1). Die Länge des Katheters einzufügende richtet sich nach Alter und Größe des Tieres, da es unterhalb der Bifurkation, eine gleichmäßige Verteilung der Lunge Adenokarzinom Zellen in der Lunge garantieren nicht gehen sollte. Schnell entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter.
8. Die richtige Platzierung des Katheters in der Luftröhre wird durch das weiße Licht durch den Katheter (Abb. 1E) angezeigt. Um die Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu bestätigen, befestigen Sie eine 1-mL-Spritze mit Wasser, um den Katheter. Das Wasser in der Spritze wird im Einklang mit der Atmung (Abb. 1F) schnell rauf und runter bewegen.
   Hinweis: Dieser Schritt kann von erfahrenen Forschern weggelassen werden.
9. Warm up die Zellsuspension durch das Rohr in der hand halten und anschließend pipette 50 µL der Suspension mit 1 x 10⁶ Zellen (die Anzahl der Zellen kann variabel sein) in der Mitte des Katheters Hubs. Die Suspension wird sofort abgesaugt werden. Anschließend fügen Sie eine 1 mL Spritze und Spenden Sie 300 µL der Luft um eine einheitliche Verteilung innerhalb der Lungen zu gewährleisten.
10. Sanft entfernen Sie den Katheter, entfernen Sie die Maus von der Intubation-Plattform, und legen Sie es auf einem Wärmekissen, bis es aus der Narkose erholt.

(3) Lunge Vorbereitung für Durchflusszytometrie

1. Am gewünschten Endpunkt experimentelle beruhigen Sie die Maus durch eine subkutane Injektion einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und durch zervikale Dislokation einschläfern.
2. Genießen Sie den Kadaver in 70 % igem Ethanol und sichern Sie die Maus auf eine Dissektion Brett mit Klebeband zu.
3. Machen Sie einen ventralen Mittellinie Einschnitt und invertieren Sie sanft die Haut, die Muskeln der Brustwand und der Bauchorgane aussetzen. Punktion des Zwerchfells und schneiden Sie die Rippen mit der Schere die Brusthöhle aussetzen.
4. Durchspülen der Lunge 3 X mit 6-8 mL eiskaltem PBS durch die rechte Herzkammer mit einer 27 G Nadel nach dem Schneiden einer kleinen Öffnung in der linken Herzkammer, Blut zu verlassen. Die Lunge sollte Blut und Turn komplett weiß geklärt werden.
5. Nehmen Sie die Lunge und hacken Sie die Lappen mit einer Schere in kleine Stücke. Die Lunge-Stücke zu einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch zu übertragen und in 1,5 mL Lunge Verdauung Puffer inkubieren (RPMI, 5 % FCS, 150 U/mL Kollagenase ich und 50 U/mL DNase ich).
6. Inkubieren Sie die Lunge Stück 30-60 min bei 37 ° C und mit konstanter schütteln.
7. Übertragen Sie die Lunge Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube. Deaktivieren Sie das Sieb mit der Rückseite des eine sterile 10-mL-Spritze und spülen Sie das Sieb mit 15 mL PBS mit 2 % FCS.
8. Zentrifugieren der Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C und den Überstand abgesaugt. Aufschwemmen Sie die Zellen in 1 mL der Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysiereinrichtung Puffer und inkubieren sie 5 min bei Raumtemperatur für die lyse der verbleibenden Erythrozyten.
9. Zentrifugieren der Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C und die Zellen in 1 mL PBS mit 2 % FCS Aufschwemmen und fahren Sie mit dem gewünschten Färbung Protokoll für Flow Cytometry²³.
   Hinweis: Alternativ können die Zellen in RPMI, enthält 30 % FCS und 10 % DMSO Nukleinsäuretablette werden und mit einem eiskalten Container für die spätere Analyse eingefroren.

Ergebnisse

Der orthotopen Transplantation Modell über intratrachealen Tumor Zelle Lieferung verwendet, um zu testen, ob der Tumor Mikroumgebung PD-L1 Ausdruck stimuliert. Daher isoliert wir Maus AC Lungenzellen aus dem autochthonen KP-Modell (KP-Zellen), 10 Wochen nach Tumor-Induktion über Cre-Rekombinase mit dem Ausdruck Adenovirus (Ad.Cre) Lieferung²⁴. Anschließend wir die Lunge AC Zellen unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) beschriftet-Lentivir...

Diskussion

Um die Lunge physiologische und pathologische Ereignisse in der Lunge zu untersuchen, sind invasive und nicht-invasive intratracheale Intubation Methoden für die Instillation von verschiedenen Reagenzien weit verbreiteten^{26,27,28,29 ,30,31,32}. Im Bereich Krebs Forscher nutzen die intratrac...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
mouse lung adenocarcinoma cell line			isolated in house
C57Bl/6 mice			F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)
129S mice
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11544446
Fetal Calf Serum	Life Technologies	11573397
Penicillin/Streptomycin Solution	Life Technologies	11548876
L-Glutamine	Life Technologies	11539876
Trypsin, 0.25% (1x) with EDTA	Life Technologies	11560626
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020
Ketasol (100 mg/mL Ketamine)	Ogris Pharma	8-00173
Xylasol (20 mg/mL Xylazine)	Ogris Pharma	8-00178
BD Insyste (22 GA 1.00 IN)	BD	381223
Blunt forceps	Roboz	RS8260
Leica CLS150 LED	Leica	30250004	Fibre Light Illuminator
Student Iris Scissors	Fine Science Tools	91460-11
DNase I (RNase-Free)	New England Biolabs	M0303S
Collagenase Type I	Life Technologies	17100017
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7	eBioscience	25-5982-82
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-82