A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
البحث عن استراتيجيات العلاج teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent مهم للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول أولاً، تولد teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران، ومن ثم، إلى الهدف بشكل انتقائي وعلاج هذه الأورام المجراة الحيوانات الصغيرة إيرادياتور باستخدام.
تزايد عدد ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة،" زرع الأعضاء غير المنظم للخلايا الجذعية في العالم، أثارت مخاوف حول سلامة زرع الخلايا الجذعية. وبالرغم من أن زرع الأعضاء المتباينة بدلاً من خلايا غير متمايزة ممارسة شائعة، teratomas يمكن لا تزال تنشأ من وجود بقايا الخلايا الجذعية غير متمايزة في وقت زرع أو من الطفرات العفوية في التمييز بين الخلايا. لأنه غالباً ما يتم تسليمها علاجات الخلايا الجذعية في المواقع الحساسة تشريحيا، الأورام الصغيرة حتى يمكن أن يكون مدمراً سريرياً، أدى إلى العمى والشلل والتشوهات المعرفية، والخلل في القلب والأوعية الدموية. قد تكون العمليات الجراحية من الوصول إلى هذه المواقع أيضا محدودة، وترك المرضى مع عدد قليل من الخيارات العلاجية. السيطرة على الخلايا الجذعية سوء السلوك ولذا، حاسمة بالنسبة للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية.
الإشعاع شعاع خارجي يوفر وسيلة فعالة لإيصال العلاج المستهدفة لخفض عبء تيراتوما مع التقليل من الإصابة إلى المحيطة بالأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، التي ترتبط بسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل. هنا، نحن وصف بروتوكول إنشاء pluripotent teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران وتطبيق العلاج الإشعاعي الخارجي شعاع ليجتذ هذه الأورام في المجراة بشكل انتقائي.
تطوير علاجات الخلايا الجذعية لتجديد الأنسجة واجه عددا من الحواجز في العقود العديدة الماضية، تعرقل الجهود المبذولة من أجل نشر الكفاءة السريرية. وتشمل هذه العقبات استبقاء خلية الفقراء في مواقع التسليم، الاستمناع الخلايا الجذعية، وإمكانات الورمية بشكل تيراتوماس1. توموريجينيسيتي مصدر قلق خاص السريرية كما أنها قد تكون ضارة لمتلقي زرع الخلايا الجذعية2. وأبلغ حسابات لتشكيل الورم بسبب حقن الخلايا الجذعية غير المنظم فعلا في عدة إعدادات السريرية3،،من45. إمكانية تشكيل تيراتوما هو الأكثر كثيرا ما استشهد القلق السريرية في pluripotent الخلايا الجذعية (PSC) التنمية وقد أدى إلى تأخيرات وإلغاءات متعددة الخلايا الجذعية الجنينية من رفيعة (ESC) والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent (اللجنة التوجيهية) المحاكمات6،7،،من89. ومن ثم، هناك حاجة ملحة لإجراء تحقيقات متعدية كرس نحو توفير العلاج المناسب، ينبغي أن تنشأ هذه الأورام علاجية المنشأ.
وحتى الآن، ركزت معظم استراتيجيات السيطرة على سوء سلوك الخلايا الجذعية على تخفيض عدد PSCs مع الورمية المحتملة2،10. للأسف، سوى عدد قليل من الخلايا المتبقية (.على سبيل المثال، 1 × 104 إلى 1 × 105 خلايا11) مطلوب من أجل تشكيل تيراتوما، الذي هو الآن أقل من حد الكشف قوله فحوصات المتاحة حاليا12، 13-تتضمن المحددات الأخرى لاستخدام هذه الأساليب بريسيباريشن انخفاض الكفاءة وارتفاع المصروفات، والاعتماد على تعليق خلية واحدة قد لا تكون مناسبة لأحدث نهج هندسة الأنسجة، والأضرار المحتملة للخلية البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت.
وتناولت دراسات قليلة خيارات العلاج عقب تشكيل تيراتوما. ربما هي استراتيجية مدروسة أكثر إدماج الجينات "انتحارية" في الخلايا الجذعية البالغة14،15. يتضمن هذا الأسلوب التلاعب وراثيا أن الخلايا الجذعية لإدراج جينات المبرمج-تفعيل إيندوسيبلي التي يمكن تفعيلها من خلال التحفيز الدوائي بوستينجيكشن، وبالتالي توفير نهج إنقاذ إذا حقن الخلايا تنتج تيراتوماس. إلا أن هذا النهج، تعاني من عيوب كبيرة، بما في ذلك الآثار خارج الهدف من التعديلات الوراثية لشركات الأمن الخاصة وإمكانات تنمية تدريجية ل مقاومة المخدرات16. ويستخدم نهج مماثل الجزيئات الصغيرة للحث على موت الخلايا الانتقائي الأمنية الخاصة عن طريق تثبيط مسارات مكافحة--أبوبتوتيك17. واستهدفت الجماعات الأخرى موت الخلية الأمنية الخاصة باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السطح بلوريبوتينسي، مثل بودوكاليكسين مثل البروتين-1 (بودكسل)18. يقف توقيت إنجاز جزيء صغير أو جسم أن يكون لها تأثير كبير على إمكانات PSCs العلاجية إذا سلمت في وقت مبكر جداً، وقد تفتقر إلى الفعالية العلاجية إذا سلمت في وقت متأخر جداً. وبالإضافة إلى ذلك، لم تدرس التأثيرات المنتظمة للجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة المستخدمة في هذا الشكل.
وثمة نهج بديل لعلاج هذه الأورام يعتمد على استخدام العلاج بالإشعاع الخارجي شعاع (إبرت). إبرت إحدى الطرائق الرئيسية المستخدمة حاليا في علاج الأورام الصلبة19. وقد مكنت الابتكارات في إبرت، بما في ذلك تطوير شعاع بروتون والشعاعية المناظير باستخدام الأشعة، استهداف تعزيز هياكل المرضية مع تجنب الأضرار بأنسجة طبيعية، مما يجعل مثالية لمعالجة تيراتوما إبرت الامتثالي تشكيل هياكل تشريحيا الحساسة20. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، والذي على حد سواء محفوفة بالسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل15. وأخيراً، قد مكنت السلف في الدقيقة-إيرادياتورس تطبيق إبرت في القوارض21.
في هذه المقالة، نحن لشرح كيفية إنشاء نموذج الحيوانات الصغيرة لتشكيل تيراتوما بالحقن إيبسكس البشرية في الفئران. ثم نعرض كيفية تطبيق إبرت لاستئصال هذه الأورام في المجراة مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة بطريقة انتقائية. هذا النهج يوفر علاج مستهدفة ل teratomas المستمدة من PSC مع تجنب آثار خارج الهدف إيصال النظمية للجزيئات البيولوجية والببتيدات والتحوير الوراثي شركات الأمن الخاصة. لأغراض الفحص، نحن نقدم خطوة اختيارية ترانسدوسي الخلايا الجذعية مع الجينات مراسل لتعقب استجابة الورم للعلاج بالإشعاع عبر الإضاءة الحيوية التصوير (BLI).
ووافقت هذه التجربة الحيوانية والمضطلع بها في إطار مجلس المراجعة المؤسسية والفريق الإداري في "مختبر رعاية الحيوان" في جامعة ستانفورد.
1-خلية ثقافة من إيبسكس
2. توصيل إيبسكس مع "الجين المراسل" مزدوجة-الانصهار
3-زرع PSCs في الجهة الظهرية لتشكيل تيراتوما في الفئران العوز
4-الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) لزرع خلايا لتقييم خلية بقاء ونمو تيراتوما
5-تيراتوما التشعيع باستخدام الإكلينيكية إيرادياتور الموجهة بصورة (الشكل 1)
حقن الفئران عادة ما سوف تثبت تيراتوما تشكيل النمو بعد 4 – 8 أسابيع كما أكد BLI التصوير (الشكل 2). سوف تتقلص الأورام كبيرة عند تشعيعها بجرعة تراكمية غراي 18 نظراً لمدة شهر واحد بعد الولادة الخلية، أدى إلى انخفاض كبير في إشارة لوسيفراس (الشكل 2). ا?...
البيانات الإكلينيكية والحالات النادرة من ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة" تؤكد أن خطر الإصابة تيراتوماس عيب خطير المقترنة PSC علاجات23. وضع نهج دقيق لمنع وعلاج الأورام المخاطر المرتبطة بالخلايا الجذعية العلاج ولذا، خطوة هامة في تيسير الترجمة السريرية للعلاج الخلايا الجذعية ال...
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
الكتاب يود أن يشكر الوطنية معاهد للصحة R01 HL134830 (المعر) و K08 HL135343 (KS) 5F32HL134221 (جور)؛ معهد هوارد هيوز الطبي (ASL)؛ وفي "جامعة ستانفورد" القلب والأوعية الدموية المعهد (ASL) لدعمهم.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved