العلاج المستهدفة وانتقائية من Teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية Pluripotent استخدام الإشعاع الخارجي شعاع في نموذج الحيوانات الصغيرة

Summary

البحث عن استراتيجيات العلاج teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent مهم للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية. هنا، يمكننا وصف بروتوكول أولاً، تولد teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران، ومن ثم، إلى الهدف بشكل انتقائي وعلاج هذه الأورام المجراة الحيوانات الصغيرة إيرادياتور باستخدام.

Abstract

تزايد عدد ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة،" زرع الأعضاء غير المنظم للخلايا الجذعية في العالم، أثارت مخاوف حول سلامة زرع الخلايا الجذعية. وبالرغم من أن زرع الأعضاء المتباينة بدلاً من خلايا غير متمايزة ممارسة شائعة، teratomas يمكن لا تزال تنشأ من وجود بقايا الخلايا الجذعية غير متمايزة في وقت زرع أو من الطفرات العفوية في التمييز بين الخلايا. لأنه غالباً ما يتم تسليمها علاجات الخلايا الجذعية في المواقع الحساسة تشريحيا، الأورام الصغيرة حتى يمكن أن يكون مدمراً سريرياً، أدى إلى العمى والشلل والتشوهات المعرفية، والخلل في القلب والأوعية الدموية. قد تكون العمليات الجراحية من الوصول إلى هذه المواقع أيضا محدودة، وترك المرضى مع عدد قليل من الخيارات العلاجية. السيطرة على الخلايا الجذعية سوء السلوك ولذا، حاسمة بالنسبة للترجمة السريرية للعلاج بالخلايا الجذعية.

الإشعاع شعاع خارجي يوفر وسيلة فعالة لإيصال العلاج المستهدفة لخفض عبء تيراتوما مع التقليل من الإصابة إلى المحيطة بالأجهزة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، التي ترتبط بسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل. هنا، نحن وصف بروتوكول إنشاء pluripotent teratomas المستمدة من الخلايا الجذعية في الفئران وتطبيق العلاج الإشعاعي الخارجي شعاع ليجتذ هذه الأورام في المجراة بشكل انتقائي.

Introduction

تطوير علاجات الخلايا الجذعية لتجديد الأنسجة واجه عددا من الحواجز في العقود العديدة الماضية، تعرقل الجهود المبذولة من أجل نشر الكفاءة السريرية. وتشمل هذه العقبات استبقاء خلية الفقراء في مواقع التسليم، الاستمناع الخلايا الجذعية، وإمكانات الورمية بشكل تيراتوماس¹. توموريجينيسيتي مصدر قلق خاص السريرية كما أنها قد تكون ضارة لمتلقي زرع الخلايا الجذعية². وأبلغ حسابات لتشكيل الورم بسبب حقن الخلايا الجذعية غير المنظم فعلا في عدة إعدادات السريرية^3،،من⁴⁵. إمكانية تشكيل تيراتوما هو الأكثر كثيرا ما استشهد القلق السريرية في pluripotent الخلايا الجذعية (PSC) التنمية وقد أدى إلى تأخيرات وإلغاءات متعددة الخلايا الجذعية الجنينية من رفيعة (ESC) والناجم عن الخلايا الجذعية pluripotent (اللجنة التوجيهية) المحاكمات^6،7،،من⁸⁹. ومن ثم، هناك حاجة ملحة لإجراء تحقيقات متعدية كرس نحو توفير العلاج المناسب، ينبغي أن تنشأ هذه الأورام علاجية المنشأ.

وحتى الآن، ركزت معظم استراتيجيات السيطرة على سوء سلوك الخلايا الجذعية على تخفيض عدد PSCs مع الورمية المحتملة^2،10. للأسف، سوى عدد قليل من الخلايا المتبقية (.على سبيل المثال، 1 × 10⁴ إلى 1 × 10⁵ خلايا¹¹) مطلوب من أجل تشكيل تيراتوما، الذي هو الآن أقل من حد الكشف قوله فحوصات المتاحة حاليا^{12، 13}-تتضمن المحددات الأخرى لاستخدام هذه الأساليب بريسيباريشن انخفاض الكفاءة وارتفاع المصروفات، والاعتماد على تعليق خلية واحدة قد لا تكون مناسبة لأحدث نهج هندسة الأنسجة، والأضرار المحتملة للخلية البقاء على قيد الحياة وانجرافتمينت.

وتناولت دراسات قليلة خيارات العلاج عقب تشكيل تيراتوما. ربما هي استراتيجية مدروسة أكثر إدماج الجينات "انتحارية" في الخلايا الجذعية البالغة^14،15. يتضمن هذا الأسلوب التلاعب وراثيا أن الخلايا الجذعية لإدراج جينات المبرمج-تفعيل إيندوسيبلي التي يمكن تفعيلها من خلال التحفيز الدوائي بوستينجيكشن، وبالتالي توفير نهج إنقاذ إذا حقن الخلايا تنتج تيراتوماس. إلا أن هذا النهج، تعاني من عيوب كبيرة، بما في ذلك الآثار خارج الهدف من التعديلات الوراثية لشركات الأمن الخاصة وإمكانات تنمية تدريجية ل مقاومة المخدرات¹⁶. ويستخدم نهج مماثل الجزيئات الصغيرة للحث على موت الخلايا الانتقائي الأمنية الخاصة عن طريق تثبيط مسارات مكافحة--أبوبتوتيك¹⁷. واستهدفت الجماعات الأخرى موت الخلية الأمنية الخاصة باستخدام الأجسام المضادة ضد علامات السطح بلوريبوتينسي، مثل بودوكاليكسين مثل البروتين-1 (بودكسل)¹⁸. يقف توقيت إنجاز جزيء صغير أو جسم أن يكون لها تأثير كبير على إمكانات PSCs العلاجية إذا سلمت في وقت مبكر جداً، وقد تفتقر إلى الفعالية العلاجية إذا سلمت في وقت متأخر جداً. وبالإضافة إلى ذلك، لم تدرس التأثيرات المنتظمة للجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة المستخدمة في هذا الشكل.

وثمة نهج بديل لعلاج هذه الأورام يعتمد على استخدام العلاج بالإشعاع الخارجي شعاع (إبرت). إبرت إحدى الطرائق الرئيسية المستخدمة حاليا في علاج الأورام الصلبة¹⁹. وقد مكنت الابتكارات في إبرت، بما في ذلك تطوير شعاع بروتون والشعاعية المناظير باستخدام الأشعة، استهداف تعزيز هياكل المرضية مع تجنب الأضرار بأنسجة طبيعية، مما يجعل مثالية لمعالجة تيراتوما إبرت الامتثالي تشكيل هياكل تشريحيا الحساسة²⁰. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يتجنب التلاعب بالجينات أو توصيل فيروسي للخلايا الجذعية، والذي على حد سواء محفوفة بالسلامة سريرية إضافية وفعالية الشواغل¹⁵. وأخيراً، قد مكنت السلف في الدقيقة-إيرادياتورس تطبيق إبرت في القوارض²¹.

في هذه المقالة، نحن لشرح كيفية إنشاء نموذج الحيوانات الصغيرة لتشكيل تيراتوما بالحقن إيبسكس البشرية في الفئران. ثم نعرض كيفية تطبيق إبرت لاستئصال هذه الأورام في المجراة مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة المحيطة بطريقة انتقائية. هذا النهج يوفر علاج مستهدفة ل teratomas المستمدة من PSC مع تجنب آثار خارج الهدف إيصال النظمية للجزيئات البيولوجية والببتيدات والتحوير الوراثي شركات الأمن الخاصة. لأغراض الفحص، نحن نقدم خطوة اختيارية ترانسدوسي الخلايا الجذعية مع الجينات مراسل لتعقب استجابة الورم للعلاج بالإشعاع عبر الإضاءة الحيوية التصوير (BLI).

Protocol

ووافقت هذه التجربة الحيوانية والمضطلع بها في إطار مجلس المراجعة المؤسسية والفريق الإداري في "مختبر رعاية الحيوان" في جامعة ستانفورد.

1-خلية ثقافة من إيبسكس

1. تنمو إيبسكس البشرية المتأتية عن طريق إعادة برمجة لينتيفيرال على ألواح 6-بئر مغطاة بالغشاء مصفوفة (مثلاً، ماتريجيل المشار إليها كمصفوفة الممتلكات).
2. تغيير يوميا وسائل إعلام إيبسكس مع إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) حضانة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂.
3. حالما تصل الخلايا إلى التقاء 80 – 90% (تقريبا كل 4 أيام)، أضف 1 مل إنزيم تفكك خلية المؤتلف (انظر الجدول للمواد) كل جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. بعد 5 دقائق، فصل الخلايا من البئر بيبيتينج ونقلها إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 300 x غ.
5. وبعد الطرد المركزي، نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) المخصب مع مثبط Y27632 في إضعاف 1:1,000.
6. إجراء عد خلية من خلايا معزولة وريبلاتي الخلايا المغلفة بمصفوفة ألواح 6-جيدا في كثافة من 2 × 10⁵ 4 × 10⁵.

2. توصيل إيبسكس مع "الجين المراسل" مزدوجة-الانصهار

1. ممر إيبسكس في لوحات 6-جيدا وفقا للروتين وإضافة إثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على 6 ميكروغرام/مل هيكساديميثريني بروميد.
   ملاحظة: حجم مستعمرة المثالي 200 – 400 خلايا/مستعمرة يحقق أعلى كفاءة توصيل.
2. تركز lentivirus الذاتي يخمد حمل اليراع لوسيفراس وأخضر نيون البروتين (فلك-اجفب) يقودها ubiquitin البشرية مروج-ج بالطرد المركزي الرواسب مع دوار SW-29 عند 50,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية.
3. إضافة الركاز الفيروسية إلى إيبسكس في لوحة 6-جيدا في عدد وافر عدوى (وزارة الداخلية) من 10 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شركة 5%₂.
   ملاحظة: كان يحددها تعدد الإصابة بالتعبير عن البروتين أحادي fluorescence تحليلها بواسطة خلية تنشيط fluorescence الفرز المسح الضوئي (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
4. في اليوم التالي، إزالة الفيروس باستخدام الطرد المركزي ألواح 6-جيدا اللجنة التوجيهية في 300 x ز لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تغيير وسائط الإعلام يوميا بإثراء الثقافة المتوسطة (انظر الجدول للمواد)، ومرور وفقا للبروتوكول. استخدام مجهر الأسفار لتحديد كفاءة توصيل التقريبي اجفب.
6. كفاءة من 30-40% غير كافية لفرز نظام مراقبة الأصول الميدانية. الانتقال إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية للتعبير عن اجفب إذا كان التعبير عن 30-40 في المائة على الأقل من الخلايا اجفب هيبسكس.
7. للتأكد من نشاط فلك السابقين فيفو، لوحة الخلايا معربا عن التجارة والنقل حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في كثافة الخلايا 5,000 كل بئر.
8. احتضان خلايا ترانسدوسيد وغير ترانسدوسيد الخلايا (والتي ستكون بمثابة عنصر التحكم السلبي) مع المراسل الإضاءة الحيوية التحقيق د-لوسيفرين (100 μmol/لتر) ل 6 h. قياس الإضاءة الحيوية مع سبيكتروفلوروميتير ميكروسكوبية.

3-زرع PSCs في الجهة الظهرية لتشكيل تيراتوما في الفئران العوز

1. أضف 1 مل من تفكك خلية المؤتلف إنزيم ميكس كل لوح 6-البئر الذي يحتوي على إيبسكس البشرية ترانسدوسيد مع جين مراسل مزدوجة-الانصهار (فلك-التجارة والنقل) في الثقافة (انظر القسم 2) واحتضانها لمدة 5 دقائق.
2. وبعد فترة الحضانة، تفريق الخلايا بتطلع ماصة والتعبير. إضافة وحدة تخزين مساوية للثقافة المتوسطة وثم الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 4 دقائق.
3. بعد الانتهاء من استخدام الطرد المركزي، نضح الحل طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 30 ميليلتر من المصفوفة، ووضعه على الجليد للحفاظ على قدرته على البقاء قبل الحقن. تأكيد حصادا من 1 × 10⁶ الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
4. في حالة استخدام مزدوج-الانصهار مراسل-جين-transfected الخلايا، تعليق الخلايا إيجابية مزدوجة نظام مراقبة الأصول الميدانية (من القسم 2) في 30 ميليلتر من المصفوفة.
5. حمل التخدير في الأسبوع 8-10 athymic الفئران عارية باستخدام إيسوفلورانسي 2% مع الأكسجين 1 لتر في الدقيقة ومن ثم استخدام الصيانة 2% إيسوفلوراني مع 1 لتر في الدقيقة للأوكسجين.
6. استخدام المحاقن ز 28.5، حقن الخليط خلية/مصفوفة تعليق (انظر الجدول للمواد) في الفضاء تحت الجلد في الجناح، تهدف لحقن في مجموع 5 × 10³ إلى 5 × 10⁶ خلايا (ماي حوالي 100 كل الحقن).
7. تنظر في موقع حقن والذيلية أكثر إذا كان التخطيط للحفاظ على الفئران لفترة طويلة وتوقع نمو الورم كبير.
8. مسموح بالحيوانات تخديره لاسترداد على لوح ساخن حتى المتنقلة (عادة < ح 1) مع رصد معدل التنفس، الجلد لون من أصابع القدم حتى المتنقلة.

4-الإضاءة الحيوية التصوير (BLI) لزرع خلايا لتقييم خلية بقاء ونمو تيراتوما

1. تيميبوينتس المرجوة بعد التطعيم، بإجراء حقنه (الملكية الفكرية) داخل 375 ملغ/كغ من التحقيق الصحفي لوسيفرين د في الفئران.
2. إشارة 10 دقيقة بعد حقن IP، الصورة الإضاءة الحيوية في الحيوانات أنيسثيتيزيد (أداء كما هو موضح في الخطوة 3، 5) لاستخدام windows اقتناء 1 دقيقة على فترات 5-دقيقة و 30 دقيقة.
   ملاحظة: وينصح الأسبوعية صورة التملك. التخدير يتم الاحتفاظ أثناء التصوير بتسليم استنشاقه isoflurane عبر مخروط الآنف.
3. لتحليل البيانات، ورسم طقة فائدة (ROI) أكثر من إشارة BLI، وتطبيع ثم، لشراء الوقت تقدير كمية الانبعاثات في وحدات للفوتونات الحد الأقصى في الثانية الواحدة سنتيمتر مربع كل ستراديان (خ الفوتونات/s/سم²).

5-تيراتوما التشعيع باستخدام الإكلينيكية إيرادياتور الموجهة بصورة (الشكل 1)

1. تخدير بماوس في مربع ضربة قاضية باستخدام إيسوفلوراني 2% في الأكسجين 100% بمعدل تدفق من 1 لتر في الدقيقة. بعد أن يتم تخديره تماما من الماوس، نقله إلى السرير من إيرادياتور ما قبل السريرية الموجهة بصورة (انظر الجدول للمواد). المحافظة على التخدير بنسبة 2% إيسوفلوراني باستمرار عن طريق مخروط الآنف.
2. الحصول على الصور المقطعية الصغرى كمجموعة من 400 الإسقاط الصور ما يزيد على 360° استخدام كفب 40، 2 mA شعاع الأشعة السينية، وإعادة بناء تلك إلى صور الحجمي مع الخواص بكسل بحجم 0.2 مم.
3. خطة علاج الإشعاعي استخدام الصور المقطعية الصغرى باستخدام حزمة البرامج RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/)، والقيام العلاج.
   ملاحظة: خطة العلاج المستخدمة تتكون من عوارض الأشعة السينية كفب 225 اثنين، الموجهة بالمرور عبر تيراتوما سطحية الهدف حين التفاف على سطح بقية الماوس وتجنيب الأحشاء الكامنة. يتم تعديل أوقات التعرض للحزم استناداً إلى نظام معايرة البيانات الفصلية حيث أن الجرعة في مركز الورم المستهدف كان غراي 6.
4. كرر عملية المعالجة في ثلاثة أيام متتالية لتقديم ما مجموعة 18 غراي للورم المستهدف.
5. الحفاظ على معيار المعالجة اللاحقة رعاية الحيوانات.

النتائج

حقن الفئران عادة ما سوف تثبت تيراتوما تشكيل النمو بعد 4 – 8 أسابيع كما أكد BLI التصوير (الشكل 2). سوف تتقلص الأورام كبيرة عند تشعيعها بجرعة تراكمية غراي 18 نظراً لمدة شهر واحد بعد الولادة الخلية، أدى إلى انخفاض كبير في إشارة لوسيفراس (الشكل 2). ا?...

Discussion

البيانات الإكلينيكية والحالات النادرة من ضحايا "الخلايا الجذعية السياحة" تؤكد أن خطر الإصابة تيراتوماس عيب خطير المقترنة PSC علاجات²³. وضع نهج دقيق لمنع وعلاج الأورام المخاطر المرتبطة بالخلايا الجذعية العلاج ولذا، خطوة هامة في تيسير الترجمة السريرية للعلاج الخلايا الجذعية ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation