Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

Zusammenfassung

Forschung auf Behandlungsstrategien für pluripotente Stammzellen abgeleitet darum ist wichtig für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erstens Stammzellen abgeleitet darum zu generieren, bei Mäusen und dann selektiv auf und behandeln diese Tumoren in vivo mit einem kleinen Tier Brutapparat.

Zusammenfassung

Die wachsende Zahl der Opfer des "Stem Cell Tourismus," die unregulierten Transplantation von Stammzellen weltweit, hat Bedenken bezüglich der Sicherheit der Stammzelltransplantation angesprochen. Obwohl die Transplantation von differenzierten anstatt undifferenzierte Zellen ist gängige Praxis, darum können noch von der Anwesenheit des restlichen undifferenzierte Stammzellen zum Zeitpunkt der Transplantation entstehen oder durch spontane Mutationen in differenziert Zellen. Weil Stammzelltherapien oft in anatomisch sensiblen Standorten geliefert werden, können auch kleine Tumoren klinisch verheerend, was zu Blindheit, Lähmungen, kognitive Auffälligkeiten und kardiovaskuläre Dysfunktion sein. Chirurgische Zugang zu diesen Seiten möglicherweise auch begrenzt, so dass Patienten mit wenigen therapeutischen Optionen. Kontrolle der Stammzelle Fehlverhalten ist daher entscheidend für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie.

Externen Strahl Strahlung bietet ein wirksames Mittel zur gezielten Therapie liefern Teratom-Belastung zu verringern, bei gleichzeitiger Minimierung der Verletzungen in die umliegenden Organe. Darüber hinaus diese Methode vermeidet Genmanipulation oder virale Transduktion von Stammzellen, die zusätzliche klinische Sicherheit und Wirksamkeit Anliegen zugeordnet sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, pluripotente Stammzellen abgeleitet darum bei Mäusen zu schaffen und externen Strahl Strahlentherapie um diese Tumoren in vivo selektiv Abtragen anzuwenden.

Einleitung

Die Entwicklung von Stammzelltherapien für die Geweberegeneration aufgetreten behindert Bemühungen für effizienten klinischen Einsatz in den letzten Jahrzehnten eine Reihe von Hindernissen. Diese Hürden gehören schlechte Zelle Aufbewahrung an Standorten der Lieferung, Stammzellen Immunogenität und neoplastischen potenziell Form darum¹. Tumorigenität ist von besonderer klinischer Bedeutung, da es potentiell Stammzell-Transplantation Empfänger²Schaden kann. Konten der Tumorbildung durch unregulierte Stammzellinjektionen wurden bereits in mehreren klinischen Einstellungen^3,4,5beschrieben. Das Potenzial für Teratom Bildung ist die am häufigsten zitierten klinischen Sorge in pluripotente Stammzellen (PSC) Entwicklung und hat führte zu Verspätungen und Annullierungen von mehreren hochkarätigen embryonalen Stammzellen (ESC) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Versuche^6,7,8,9. So gibt es eine dringende Notwendigkeit einer translatorischen Untersuchung gewidmet auf eine entsprechende Behandlung dieser iatrogenen Tumoren entstehen sollte.

Bisher konzentrierten sich die meisten Strategien um Stammzellen Fehlverhalten zu steuern auf die Verringerung der Zahl der einheitlichen Ansprechpartner mit tumorigenic möglichen^2,10. Leider ist nur eine kleine Anzahl der verbleibenden Zellen (z. B.., 1 x 10⁴ bis 1 x 10⁵ Zellen¹¹) für Teratom Formation, die weit unterhalb der Nachweisgrenze von derzeit verfügbaren Tests^12, zitiert ist erforderlich ¹³. andere Einschränkungen bei der Verwendung dieser preseparation Methoden gehören geringe Effizienz und hohe Kosten, Abhängigkeit von einzelligen Suspensionen, die möglicherweise nicht geeignet für neuere Ansätze der Gewebe-Engineering und der möglichen Beeinträchtigung des Zelle Überleben und Engraftment.

Nur wenige Studien haben Behandlungsmöglichkeiten nach Teratom Bildung gerichtet. Vielleicht ist die am meisten gut untersuchte Strategie der Einbeziehung der "Selbstmord" Gene in Stammzellen^14,15. Bei dieser Methode wird genetisch manipuliert die Stammzellen um ein induzierbares Apoptose-aktivierende gen enthalten, die durch pharmakologische Stimulation Steroidtherapie, wodurch einen Rettungs-Ansatz wenn injizierte Zellen darum produzieren aktiviert werden kann. Dieser Ansatz leidet jedoch erhebliche Nachteile, einschließlich Ziel Auswirkungen gentechnischer Veränderungen der einheitlichen Ansprechpartner und das Potenzial für eine allmähliche Entwicklung der Droge Widerstand¹⁶. Ein ähnlicher Ansatz nutzt kleine Moleküle um selektive Zelltod der einheitlichen Ansprechpartner über die Hemmung der Anti-apoptotischen Signalwege¹⁷zu induzieren. Andere Gruppen haben Zelltod der einheitlichen Ansprechpartner mit Antikörpern gegen Pluripotenz Oberflächenmarker, z. B. Podocalyxin-Like Protein-1 (PODXL)¹⁸ins Visier genommen. Das Timing der klein-Molekül oder Antikörper Lieferung steht, einen erheblichen Einfluss auf das therapeutische Potenzial der einheitlichen Ansprechpartner zu haben, wenn zu früh geliefert und therapeutische Wirksamkeit fehlt können, wenn zu spät geliefert. Darüber hinaus sind die systemischen Wirkungen von kleinen Molekülen und auf diese Weise verwendeten Antikörper nicht untersucht worden.

Ein alternativer Ansatz zur Behandlung dieser Tumoren stützt sich auf die Verwendung von externen Strahl Strahlentherapie (EBRT). EBRT ist eines der primären Modalitäten derzeit beschäftigt bei der Behandlung von soliden Tumoren¹⁹. Innovationen im EBRT, einschließlich der Entwicklung der Protonenstrahl und stereotaktische Radiochirurgie, haben es ermöglicht, die verstärkte Ausrichtung der pathologischen Strukturen unter Vermeidung von Schäden an normalem Gewebe, wodurch winkeltreue EBRT ideal für den Umgang mit Teratom Bildung in anatomisch sensiblen Strukturen²⁰. Darüber hinaus ist diese Methode vermeidet die genetische Manipulation oder virale Transduktion von Stammzellen, die beide mit zusätzliche klinische Sicherheit behaftet sind und Wirksamkeit betrifft¹⁵. Zu guter Letzt konnten Fortschritte in der Mikro-Bestrahlungsgeräte Anwendungder EBRT Nagetiere²¹.

In diesem Artikel zeigen wir wie erstelle ich ein kleines Tier-Modell der Teratom Bildung durch die Injektion von menschlichen iPSCs bei Mäusen. Wir zeigen dann wie bewerbe EBRT um diese Tumoren in vivo mit minimaler Beschädigung der umgebenden Gewebe gezielt zu beseitigen. Dieser Ansatz ermöglicht eine gezielte Therapie für PSC abgeleitet darum unter Vermeidung der Ziel-Effekte der systemischen Lieferung von biologischen Molekülen und Peptide und die genetische Manipulation der EAP. Für experimentelle Zwecke bieten wir einen optionalen Schritt um transduzieren Stammzellen mit Reporter-Gene ansprechen des Tumors auf Strahlentherapie über Biolumineszenz imaging (BLI) verfolgen.

Protokoll

Dieser Tierversuch wurde genehmigt und unter der Institutional Review Board und die Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care an der Stanford University durchgeführt.

(1) Zellkultur von iPSCs

1. Wachsen Sie menschliche iPSCs durch Lentivirale umprogrammieren auf 6-Well-Platten beschichtet mit Basalmembran Matrix (z. B. Matrigel, hereon als Matrix bezeichnet) abgeleitet.
2. Täglicher Wechsel der Medien die iPSCs mit angereicherten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO₂.
3. Sobald die Zellen 80 – 90 % Zusammenfluss (ca. alle 4 Tage) erreicht haben, fügen Sie 1 mL der rekombinanten Zelle-Dissoziation Enzym (siehe Tabelle der Materialien) pro gut und bei 37 ° C für 5 min inkubieren.
4. Distanzieren Sie nach 5 min die Zellen aus dem Brunnen durch pipettieren, übertragen Sie sie auf eine 15 mL-Tube und bei 300 X gzentrifugieren.
5. Nach der Zentrifugation Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in angereicherten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) angereichert mit Y27632-Hemmer bei einer 1:1,000 Verdünnung.
6. Führen Sie eine Zellzahl der dissoziierten Zellen und replate Zellen auf Matrix beschichtet 6-Well-Platten bei einer Dichte von 2 x 10⁵ bis 4 x 10⁵.

(2) Transduktion von iPSCs mit einem Doppel-Fusion-Reporter-Gen

1. Durchgang iPSCs in 6-Well-Platten nach Routine und angereicherte Kulturmedium hinzufügen (siehe Tabelle der Materialien) mit 6 µg/mL Hexadimethrine Bromid.
   Hinweis: Die ideale Koloniegröße ist 200 – 400 Zellen/Kolonie um die höchste Transduktion Effizienz zu erzielen.
2. Konzentrieren Sie, selbst Inaktivierung Lentivirus tragen Firefly Luciferase und grün fluoreszierendes Protein (FLuc-eGFP) angetrieben durch menschliche Ubiquitin Promotor-C Sediment Zentrifugation mit SW-29 Rotor bei 50.000 X g 2 h bei 4 ° C.
3. Die iPSCs in einem 6-Well-Platte bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10 das virale Konzentrat hinzu und Inkubation über Nacht bei 37 ° C um 5 % CO₂.
   Hinweis: Die Multiplizität der Infektion wurde durch den Ausdruck von Monomeren Fluoreszenz-Protein durch eine Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Scan analysiert bestimmt.
4. Am folgenden Tag, entfernen Sie den Virus durch Zentrifugation von der iPSC-6-Well-Platten bei 300 X g für 6 min bei Raumtemperatur.
5. Wechseln Sie das Medium täglich mit angereicherten Kulturmedium (siehe Tabelle der Materialien) und Durchgang gemäss Protokoll. Nutzen Sie ein Fluoreszenzmikroskop um die ungefähre Transduktion Effizienz für eGFP zu bestimmen.
6. Ein Wirkungsgrad von 30-40 % ist ausreichend für die Sortierung von FACS. Fahren Sie mit der FACS HiPSCs eGFP auszudrücken, wenn mindestens 30 – 40 % der Zellen eGFP ausdrücken.
7. FLuc Aktivität ex Vivo bestätigen, Platte die Zellen GFP sortiert nach FACS bei einer Dichte von 5.000 Zellen pro Bohrloch zum Ausdruck zu bringen.
8. Brüten die transduced Zellen und nicht ausgestrahlt Zellen (die als negative Kontrolle dienen werden) mit der Biolumineszenz-Reporter Sonde D-Luciferin (100 μmol/L) für 6 h messen die Biolumineszenz mit einer Mikrotestplatte Spectrofluorometer.

(3) Transplantation von EAP in der dorsalen Flanke für Teratom Bildung in immungeschwächte Mäuse

1. Fügen Sie 1 mL der rekombinanten Zelle-Dissoziation-Enzym-Mix Pro 6-Well-Platte mit menschlichen iPSCs mit einem Doppel-Fusion Reportergen (FLuc-GFP) ausgestrahlt, in der Kultur (siehe Abschnitt 2) und 5 min inkubieren.
2. Zerstreuen Sie nach der Inkubationszeit die Zellen durch Pipette streben und Ausdruck. Fügen Sie ein gleiches Volumen Kulturmedium und dann bei 250 X g für 4 min zentrifugieren.
3. Nach Zentrifugation abgeschlossen ist, aspirieren Sie die überstehende Lösung, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 30 µL der Matrix, und legen Sie es auf dem Eis, die Rentabilität des Unternehmens vor der Injektion zu bewahren. Eine Ernte von 1 x 10⁶ Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer zu bestätigen.
4. Aussetzen Sie Doppel-Fusion Reporter-gen-transfizierten Zellen nutzen, die doppelt-positiven FACS Zellen (aus Abschnitt 2) in 30 µL der Matrix.
5. Anästhesie bei 8-10 Wochen Athymic nackten Mäusen mit 2 % Isoflurance mit 1L/min Sauerstoff zu induzieren und Wartung 2 % Isofluran mit 1L/min Sauerstoff verwenden.
6. Mit einer 28,5 G Spritze injizieren Zellmatrix/Mischung (siehe Tabelle der Materialien) Aussetzung in den subkutanen Raum an der Flanke, mit dem Ziel für eine Injektion von insgesamt 5 x 10-³ , 5 x 10⁶ Zellen (ca. 100 Ul pro Injektion).
7. Betrachten Sie eine mehr kaudalen Injektionsstelle, wenn Mäuse für längere Zeit und erwarten große Tumorwachstum aufrecht zu erhalten.
8. Narkotisierten Tiere dürfen sich wieder auf einem beheizten Pad bis ambulant (in der Regel < 1h) mit Überwachung der Atemfrequenz, Hautfarbe der Zehen bis zum Chorumgang.

4. Biolumineszenz Imaging (BLI) der transplantierten Zellen Teratom Wachstum und Überleben der Zellen beurteilen

1. Führen Sie an die gewünschten Zeitpunkten nach der Inokulation intraperitoneale Injektion (IP) von 375 mg/kg der Reporter Sonde D-Luciferin in den Mäusen.
2. 10 min nach IP-Injektion, Bild der Biolumineszenz signal am narkotisierten Tier (durchgeführt in beschrieben Schritt 3.5) für 30 min mit 1 min Erwerb Windows in 5-Minuten-Intervallen.
   Hinweis: Wöchentliche Bild Akquisitionen werden empfohlen. Anästhesie wird beibehalten während der Bildgebung durch die Bereitstellung von Isofluran über eine Bugnase eingeatmet.
3. Für die Datenanalyse Zeichnen einer Region of Interest (ROI) über das BLI-Signal und dann normalisieren zum Erwerb Mal die Emissionen in Einheiten von maximal Photonen pro Sekunde pro Quadratzentimeter pro Steradiant (Photonen/s/cm²/sr) zu quantifizieren.

5. Teratom Bestrahlung mit einer präklinischen bildgestützten Brutapparat (Abbildung 1)

1. Eine Maus in einem Knockdown-Box mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff mit einer Durchflussrate von 1 L/min zu betäuben. Nachdem die Maus vollständig betäubt ist, überträgt es auf das Bett eine bildgebende vorklinischen Brutapparat (siehe Tabelle der Materialien). Aufrechterhaltung der Anästhesie von 2 % Isofluran kontinuierlich über eine Nase Kegel.
2. Mikro-CT-Bilder als eine Reihe von 400 Projektion von Bildern über 360° mit einem 40 "KVP", 2 mA Röntgenstrahl zu erwerben und diese in volumetrischen Bilder mit einem isotropen Pixelgröße von 0,2 mm zu rekonstruieren.
3. Planen Sie eine Bestrahlung mit der Mikro-CT-Bilder mit der RT_Image-Software-Paket (http://rtimage.sourceforge.net/) und durchführen Sie die Behandlung.
   Hinweis: Der Behandlungsplan verwendet, besteht aus zwei 225 "KVP" Röntgenstrahlen, orientiert an der oberflächlichen Ziel Teratom durchlaufen, während entlang der Oberfläche des Restes der Maus und der zugrunde liegenden Eingeweide zu schonen. Die Belichtungszeiten für die Balken sind basierend auf vierteljährlich System Kalibrierdaten angepasst, so dass die Dosis in der Mitte des Tumors Ziel 6 Gy war.
4. Wiederholen Sie die Behandlung an drei aufeinanderfolgenden Tagen, insgesamt 18 Gy an der Ziel-Tumor zu liefern.
5. Standard nach der Behandlung Betreuung der Tiere zu erhalten.

Ergebnisse

Injizierte Mäusen zeigen in der Regel Teratom Wachstum Bildung nach 4 – 8 Wochen bestätigt BLI imaging (Abbildung 2). Tumore werden drastisch schrumpfen, bei der Bestrahlung mit einer kumulativen Dosis von 18 Gy Frist von einem Monat nach Lieferung der Zelle, was zu einem deutlichen Rückgang der Luciferase Signal (Abbildung 2). Wichtig ist, scheinen normale Gewebe 5 mm von der bestrahlten Website genommen nicht erhebliche Sc...

Diskussion

Präklinische Daten und vereinzelte Fälle von Opfern des "Stem Cell Tourismus" bestätigen, dass das Risiko der Entwicklung darum ein gravierender Nachteil PSC Behandlungen²³zugeordnet ist. Entwicklung vorsichtig Ansätze zur Vorbeugung und Behandlung von neoplastischen Risikogehalt Stammzelltherapien ist daher ein wichtiger Schritt in die klinische Übersetzung regenerative Stammzelltherapien zu erleichtern. In diesem Artikel wir beschrieb eine Methode des therapeutischen Ausrichtung der PSC-ass...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation