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Method Article
Forschung auf Behandlungsstrategien für pluripotente Stammzellen abgeleitet darum ist wichtig für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erstens Stammzellen abgeleitet darum zu generieren, bei Mäusen und dann selektiv auf und behandeln diese Tumoren in vivo mit einem kleinen Tier Brutapparat.
Die wachsende Zahl der Opfer des "Stem Cell Tourismus," die unregulierten Transplantation von Stammzellen weltweit, hat Bedenken bezüglich der Sicherheit der Stammzelltransplantation angesprochen. Obwohl die Transplantation von differenzierten anstatt undifferenzierte Zellen ist gängige Praxis, darum können noch von der Anwesenheit des restlichen undifferenzierte Stammzellen zum Zeitpunkt der Transplantation entstehen oder durch spontane Mutationen in differenziert Zellen. Weil Stammzelltherapien oft in anatomisch sensiblen Standorten geliefert werden, können auch kleine Tumoren klinisch verheerend, was zu Blindheit, Lähmungen, kognitive Auffälligkeiten und kardiovaskuläre Dysfunktion sein. Chirurgische Zugang zu diesen Seiten möglicherweise auch begrenzt, so dass Patienten mit wenigen therapeutischen Optionen. Kontrolle der Stammzelle Fehlverhalten ist daher entscheidend für die klinische Übersetzung der Stammzell-Therapie.
Externen Strahl Strahlung bietet ein wirksames Mittel zur gezielten Therapie liefern Teratom-Belastung zu verringern, bei gleichzeitiger Minimierung der Verletzungen in die umliegenden Organe. Darüber hinaus diese Methode vermeidet Genmanipulation oder virale Transduktion von Stammzellen, die zusätzliche klinische Sicherheit und Wirksamkeit Anliegen zugeordnet sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, pluripotente Stammzellen abgeleitet darum bei Mäusen zu schaffen und externen Strahl Strahlentherapie um diese Tumoren in vivo selektiv Abtragen anzuwenden.
Die Entwicklung von Stammzelltherapien für die Geweberegeneration aufgetreten behindert Bemühungen für effizienten klinischen Einsatz in den letzten Jahrzehnten eine Reihe von Hindernissen. Diese Hürden gehören schlechte Zelle Aufbewahrung an Standorten der Lieferung, Stammzellen Immunogenität und neoplastischen potenziell Form darum1. Tumorigenität ist von besonderer klinischer Bedeutung, da es potentiell Stammzell-Transplantation Empfänger2Schaden kann. Konten der Tumorbildung durch unregulierte Stammzellinjektionen wurden bereits in mehreren klinischen Einstellungen3,4,5beschrieben. Das Potenzial für Teratom Bildung ist die am häufigsten zitierten klinischen Sorge in pluripotente Stammzellen (PSC) Entwicklung und hat führte zu Verspätungen und Annullierungen von mehreren hochkarätigen embryonalen Stammzellen (ESC) und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Versuche6,7,8,9. So gibt es eine dringende Notwendigkeit einer translatorischen Untersuchung gewidmet auf eine entsprechende Behandlung dieser iatrogenen Tumoren entstehen sollte.
Bisher konzentrierten sich die meisten Strategien um Stammzellen Fehlverhalten zu steuern auf die Verringerung der Zahl der einheitlichen Ansprechpartner mit tumorigenic möglichen2,10. Leider ist nur eine kleine Anzahl der verbleibenden Zellen (z. B.., 1 x 104 bis 1 x 105 Zellen11) für Teratom Formation, die weit unterhalb der Nachweisgrenze von derzeit verfügbaren Tests12, zitiert ist erforderlich 13. andere Einschränkungen bei der Verwendung dieser preseparation Methoden gehören geringe Effizienz und hohe Kosten, Abhängigkeit von einzelligen Suspensionen, die möglicherweise nicht geeignet für neuere Ansätze der Gewebe-Engineering und der möglichen Beeinträchtigung des Zelle Überleben und Engraftment.
Nur wenige Studien haben Behandlungsmöglichkeiten nach Teratom Bildung gerichtet. Vielleicht ist die am meisten gut untersuchte Strategie der Einbeziehung der "Selbstmord" Gene in Stammzellen14,15. Bei dieser Methode wird genetisch manipuliert die Stammzellen um ein induzierbares Apoptose-aktivierende gen enthalten, die durch pharmakologische Stimulation Steroidtherapie, wodurch einen Rettungs-Ansatz wenn injizierte Zellen darum produzieren aktiviert werden kann. Dieser Ansatz leidet jedoch erhebliche Nachteile, einschließlich Ziel Auswirkungen gentechnischer Veränderungen der einheitlichen Ansprechpartner und das Potenzial für eine allmähliche Entwicklung der Droge Widerstand16. Ein ähnlicher Ansatz nutzt kleine Moleküle um selektive Zelltod der einheitlichen Ansprechpartner über die Hemmung der Anti-apoptotischen Signalwege17zu induzieren. Andere Gruppen haben Zelltod der einheitlichen Ansprechpartner mit Antikörpern gegen Pluripotenz Oberflächenmarker, z. B. Podocalyxin-Like Protein-1 (PODXL)18ins Visier genommen. Das Timing der klein-Molekül oder Antikörper Lieferung steht, einen erheblichen Einfluss auf das therapeutische Potenzial der einheitlichen Ansprechpartner zu haben, wenn zu früh geliefert und therapeutische Wirksamkeit fehlt können, wenn zu spät geliefert. Darüber hinaus sind die systemischen Wirkungen von kleinen Molekülen und auf diese Weise verwendeten Antikörper nicht untersucht worden.
Ein alternativer Ansatz zur Behandlung dieser Tumoren stützt sich auf die Verwendung von externen Strahl Strahlentherapie (EBRT). EBRT ist eines der primären Modalitäten derzeit beschäftigt bei der Behandlung von soliden Tumoren19. Innovationen im EBRT, einschließlich der Entwicklung der Protonenstrahl und stereotaktische Radiochirurgie, haben es ermöglicht, die verstärkte Ausrichtung der pathologischen Strukturen unter Vermeidung von Schäden an normalem Gewebe, wodurch winkeltreue EBRT ideal für den Umgang mit Teratom Bildung in anatomisch sensiblen Strukturen20. Darüber hinaus ist diese Methode vermeidet die genetische Manipulation oder virale Transduktion von Stammzellen, die beide mit zusätzliche klinische Sicherheit behaftet sind und Wirksamkeit betrifft15. Zu guter Letzt konnten Fortschritte in der Mikro-Bestrahlungsgeräte Anwendungder EBRT Nagetiere21.
In diesem Artikel zeigen wir wie erstelle ich ein kleines Tier-Modell der Teratom Bildung durch die Injektion von menschlichen iPSCs bei Mäusen. Wir zeigen dann wie bewerbe EBRT um diese Tumoren in vivo mit minimaler Beschädigung der umgebenden Gewebe gezielt zu beseitigen. Dieser Ansatz ermöglicht eine gezielte Therapie für PSC abgeleitet darum unter Vermeidung der Ziel-Effekte der systemischen Lieferung von biologischen Molekülen und Peptide und die genetische Manipulation der EAP. Für experimentelle Zwecke bieten wir einen optionalen Schritt um transduzieren Stammzellen mit Reporter-Gene ansprechen des Tumors auf Strahlentherapie über Biolumineszenz imaging (BLI) verfolgen.
Dieser Tierversuch wurde genehmigt und unter der Institutional Review Board und die Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care an der Stanford University durchgeführt.
(1) Zellkultur von iPSCs
(2) Transduktion von iPSCs mit einem Doppel-Fusion-Reporter-Gen
(3) Transplantation von EAP in der dorsalen Flanke für Teratom Bildung in immungeschwächte Mäuse
4. Biolumineszenz Imaging (BLI) der transplantierten Zellen Teratom Wachstum und Überleben der Zellen beurteilen
5. Teratom Bestrahlung mit einer präklinischen bildgestützten Brutapparat (Abbildung 1)
Injizierte Mäusen zeigen in der Regel Teratom Wachstum Bildung nach 4 – 8 Wochen bestätigt BLI imaging (Abbildung 2). Tumore werden drastisch schrumpfen, bei der Bestrahlung mit einer kumulativen Dosis von 18 Gy Frist von einem Monat nach Lieferung der Zelle, was zu einem deutlichen Rückgang der Luciferase Signal (Abbildung 2). Wichtig ist, scheinen normale Gewebe 5 mm von der bestrahlten Website genommen nicht erhebliche Sc...
Präklinische Daten und vereinzelte Fälle von Opfern des "Stem Cell Tourismus" bestätigen, dass das Risiko der Entwicklung darum ein gravierender Nachteil PSC Behandlungen23zugeordnet ist. Entwicklung vorsichtig Ansätze zur Vorbeugung und Behandlung von neoplastischen Risikogehalt Stammzelltherapien ist daher ein wichtiger Schritt in die klinische Übersetzung regenerative Stammzelltherapien zu erleichtern. In diesem Artikel wir beschrieb eine Methode des therapeutischen Ausrichtung der PSC-ass...
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Die Autoren möchten danken den nationalen Instituten der Gesundheit R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) und 5F32HL134221 (JWR); Das Howard Hughes Medical Institute (ASL); und die Stanford Herz-Kreislauf-Institut (ASL) für ihre Unterstützung.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
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