Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Исследования по стратегиям тератомы плюрипотентных стволовых клеток лечение имеет важное значение для клинической перевод стволовых клеток. Здесь мы описываем протокол к, во-первых, генерировать стволовых клеток тератомы мышей и, затем, чтобы выборочно целевого и лечить эти опухоли в естественных условиях, с помощью малых животных облучателя.
Растущее число жертв «туризма стволовых клеток, «нерегулируемого трансплантация стволовых клеток по всему миру, выразили обеспокоенность по поводу безопасности трансплантации стволовых клеток. Хотя пересадка продифференцированы вместо недифференцированных клеток является обычной практикой, тератомы могут по-прежнему возникают от присутствия остаточных недифференцированных стволовых клеток во время пересадки или от спонтанных мутаций в продифференцировано клетки. Потому что терапия стволовой клетки часто поставляются в анатомически спецобъектов, даже небольшие опухоли может быть клинически разрушительным, что приводит к слепоте, паралич, когнитивные нарушения и сердечно-сосудистой дисфункции. Хирургический доступ на эти сайты также могут быть ограничены, оставив больных с несколько терапевтические возможности. Контроль за недостойное поведение стволовых клеток, таким образом, решающее значение для клинической перевод стволовых клеток.
Внешний пучка излучения предлагает эффективным средством доставки таргетная терапия уменьшения бремени тератома при сведении к минимуму травмы в окружающие органы. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые связаны с дополнительных клинических безопасности и эффективности. Здесь мы описываем протокол для создания плюрипотентных стволовых клеток тератомы мышей и применять внешние пучка лучевой терапии, чтобы выборочно удалять эти опухоли в естественных условиях.
Развитие терапии стволовой клетки для регенерации тканей столкнулся с рядом барьеров в последние несколько десятилетий, препятствуют усилиям по эффективной клинической развертывания. Эти препятствия включают бедных ячейки хранения на участках поставки, иммуногенность стволовых клеток и неопластические потенциал формы тератомы1. Tumorigenicity вызывает особое беспокойство клинических как он потенциально может нанести вред трансплантации стволовых клеток получателей2. Счетов образования опухоли из-за нерегулируемого стволовых клеток инъекции уже сообщалось в нескольких клинических параметров3,4,5. Потенциал для формирования тератома является наиболее часто цитируется клинических озабоченность в развитии плюрипотентных стволовых клеток (СМБ) и привела к задержки и отмены нескольких громких эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) испытания6,,78,9. Таким образом существует настоятельная необходимость для трансляционного расследования, выделенные на обеспечение надлежащего лечения, следует эти ятрогенные опухоли возникают.
На сегодняшний день, большинство стратегий для управления стволовых клеток проступок были направлены на сокращение числа ЦОНов с онкогенной потенциальных2,10. К сожалению только небольшое количество остаточного клеток (например,., 1 x 10-4 до 1 x 105 клеток11) необходим для формирования тератома, которая значительно ниже предела обнаружения котируется на имеющихся в настоящее время анализы12, 13. другие ограничения использования этих preseparation методы включают низкую эффективность и высокие расходы, зависимость от одноклеточного суспензий, которые не могут быть подходящими для новых подходов тканевой инженерии и потенциального обесценения ячейки выживание и приживления.
Несколько исследований были рассмотрены варианты лечения, после формирования тератома. Возможно наиболее изученной стратегии является включение «самоубийства» генов в стволовые клетки14,15. Этот метод предполагает, генетически манипулировать стволовых клеток для включения индуцибельной апоптоз активации генов, который может быть активирован фармакологических стимуляции postinjection, тем самым обеспечивая спасения подход, если вводили клетки производят тератомы. Этот подход, однако, страдает от существенных недостатков, включая эффекты пробить генетических модификаций ЦОНов и потенциал для постепенного развития наркотиков сопротивления16. Аналогичный подход использует малые молекулы побудить селективного клеточной гибели ЦОНов через ингибирование анти apoptotic пути17. Другие группы были направлены против смерти клетки ЦОНов с использованием антител против плюрипотентности поверхностных маркеров, такие как podocalyxin белка-1 (PODXL)18. Сроки доставки мелкомолекулярных или антитело стоит иметь значительное влияние на терапевтический потенциал Чок, если доставлено слишком рано и может отсутствовать терапевтической эффективности, если доставлен слишком поздно. Кроме того системные эффекты малых молекул и антитела, используемые в этой моде не были изучены.
Альтернативный подход к лечению этих опухолей опирается на использование внешний пучка излучения терапии (ДГТ). ДГТ является одним из основных механизмов, в настоящее время работают в лечении солидных опухолей19. Инновации в ДГТ, включая разработку наведение протонного луча и стереотаксической радиохирургии, позволили расширенной ориентации патологических структур избегая повреждения нормальной ткани, делая конформное ДГТ идеально подходит для решения тератома формирование в анатомически чувствительных структур20. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые оба сопряжено с дополнительных клинических безопасности и эффективности касается15. Наконец достижения в микро Облучатели позволили применение ДГТ в грызунов21.
В этой статье мы продемонстрируем создание малых животных модели формирования тератома путем инъекций человеческого iPSCs в мышах. Затем показано, как применять ДГТ выборочно искоренить эти опухоли в естественных условиях с минимальным ущербом для окружающих тканей. Этот подход обеспечивает таргетная терапия для СМБ производные тератомы избегая пробить последствий системных доставки биологических молекул и пептиды и генетические манипуляции Чок. Для исследуемого целей мы предлагаем необязательный шаг передавать стволовых клеток с генами репортер отслеживать через биолюминесценции изображений (BLI) опухоли ответ к лучевой терапии.
Этот эксперимент животных была одобрена и выполняются институциональных Наблюдательный Совет и административный Группа на лабораторных животных уход в Стэнфордском университете.
1. клеточной культуры iPSCs
2. трансдукции iPSCs с двойной фьюжн Репортер ген
3. трансплантация ЦОНов в спинной бочку для формирования тератома иммунодефицитных мышей
4. биолюминесценции, Визуализация (BLI) пересаженные клетки для оценки выживаемость клеток и рост тератома
5. тератома облучения с помощью доклинических изображение руководствуясь облучателя (рис. 1)
Обычно вводится мышей продемонстрируют тератома роста формирования после 4 – 8 недель, как это подтверждается BLI изображений (рис. 2). Опухоли будет резко сокращаться при облучении с суммарной дозы 18 гр, один месяц после родов клеток, что приводит к значи?...
Доклинические данные и анекдотические случаи от жертв «стволовых клеток туризма» подтверждают, что риск развития тератомы является серьезным недостатком, связанные с лечения PSC23. Таким образом, развитие внимательного подхода для предотвращения и лечения опухолевой риск,...
Авторы не имеют ничего сообщать.
Авторы хотели бы поблагодарить национальных институтов из здравоохранения R01 HL134830 (ПКН), K08 HL135343 (KS) и 5F32HL134221 (микропроцессорный); Говард Хьюз медицинский институт (ASL); и Институт сердечно-сосудистой Стэнфорд (ASL) за их поддержку.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line | Stanford University | Nguyen Lab | Cell culture of iPSC |
Corning matrigel basement membrane matrix 354234 | Fisher Scientific | CB-40234 | Cell culture of iPSC |
Essential 8 culture medium | ATCC-The global bioresource center | 30-2203 | Cell culture of iPSC |
Tryple E | Gibco | 12605-036 | Cell culture of iPSC |
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor) | Fisher Scientific | S104950MG | Cell culture of iPSC |
Lentivirus | Cyagen | P170721-1001cjn | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter | Stanford University | Sam Gambhir lab | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
D-luciferin | Perkin Elmer | 122799 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI |
Flow cytometer (BD FACSARIA III) | BD Biosciences | FACSAria | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System) | Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA | GM2000 | Transduction of iPSC with double fusion reporter gene |
Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | BLI |
Isoflurane | Sigma-Aldrich | CDS019936 | irradiation |
X-Rad SmART image-guided irradiator | Precision X-ray Inc., North Branford, CT | X-Rad SmART | irradiation |
RT_Image software package | Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/) | RT_Image v0.2β | Irradiation |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены