利用外束辐射对小型动物模型的多能干细胞衍生畸胎瘤进行靶向选择性治疗

摘要

多能干细胞衍生畸胎瘤治疗策略的研究对干细胞治疗的临床翻译具有重要意义。在这里, 我们描述了一种协议, 首先, 在小鼠体内产生干细胞衍生的畸胎瘤, 然后, 选择性地靶向和治疗这些肿瘤在体内使用一个小动物辐照器。

摘要

在全球范围内, "干细胞旅游" 这一无管制的干细胞移植的受害者越来越多, 这引起了人们对干细胞移植安全性的担忧。虽然分化而非未分化细胞的移植是常见的做法, 畸胎瘤仍然可以产生于残留的未分化干细胞在移植时的存在或自突变在分化细胞。由于干细胞疗法通常被提供到解剖敏感的部位, 即使是小肿瘤也可能在临床上造成毁灭性的破坏, 导致失明、瘫痪、认知异常和心血管功能障碍。手术进入这些场所的机会也可能有限, 使患者几乎没有治疗选择。因此, 控制干细胞不当行为对干细胞治疗的临床翻译至关重要。

外部光束辐射提供了一种有效的手段, 提供有针对性的治疗, 以减少畸胎瘤的负担, 同时尽量减少对周围器官的伤害。此外, 这种方法避免遗传操作或干细胞的病毒转导-这与额外的临床安全性和疗效问题有关。在这里, 我们描述了一种在小鼠体内创建多能干细胞衍生畸胎瘤的方案, 并应用外束放射治疗在体内选择性地消融这些肿瘤。

引言

在过去几十年里, 组织再生干细胞疗法的发展遇到了一些障碍, 阻碍了有效临床部署的努力。这些障碍包括分娩部位细胞保留不良、干细胞免疫原性和肿瘤形成畸胎瘤¹的可能性。致瘤是特别的临床关注, 因为它可能有潜在的危害干细胞移植受者²。由于不受管制的干细胞注射而形成的肿瘤的说法已经在多个临床环境^中报告了 3^,4,5。畸胎瘤形成的可能性是多能干细胞 (psc) 发展中最经常提到的临床问题, 并导致多个高调胚胎干细胞 (esc) 和诱导多能干细胞 (ipsc) 的延迟和取消试验^6,7,8,9。因此, 有迫切需要一个翻译调查致力于提供适当的治疗, 如果这些医源性肿瘤出现。

到目前为止, 控制干细胞不当行为的大多数策略都集中在减少有致瘤潜力^{为 2,10}的 psc 数量上。遗憾的是, 畸胎瘤的形成只需要少量的残留细胞 (例如, 1 x^{10 4}至 1 x^{10 5}细胞¹¹), 远远低于目前可用的检测 12^所引用的检测限^值,13. 使用这些预分配方法的其他限制包括效率低和费用高、依赖可能不适合较新的组织工程方法的单细胞悬浮液以及细胞的潜在损伤生存和雕刻。

很少有研究涉及畸胎瘤形成后的治疗方案。也许最深入研究的策略是将 "自杀" 基因整合到干细胞中 14^,15。这种方法包括基因操纵干细胞, 以纳入诱导凋亡激活基因, 可通过药物刺激后注射激活, 从而提供一种救援方法, 如果注射细胞产生畸胎瘤。然而, 这种方法存在重大缺陷, 包括私营保安公司基因改造的非目标效应和耐药的逐渐发展的可能性 16.类似的方法利用小分子通过抑制抗凋亡途径^诱导psc 选择性细胞死亡17。其他群体使用多能性表面标记抗体, 如 podocalyxin-like (podxl)¹⁸, 将其靶向 psc 的细胞死亡。小分子或抗体传递的时间如果传递过早, 将对 psc 的治疗潜力产生重大影响, 如果传递得太晚, 可能缺乏治疗效果。此外, 还没有研究以这种方式使用的小分子和抗体的系统性影响。

治疗这些肿瘤的另一种方法依赖于使用外束放射治疗 (ebrt)。ebrt 是目前用于治疗实体肿瘤的主要方法之一.欧洲 brt 的创新, 包括质子束和立体定向放射外科的发展, 使病理结构的目标增强, 同时避免对正常组织的损害, 使保形欧洲爆炸器成为解决畸胎瘤的理想选择在解剖敏感的结构^中形成20。此外, 这种方法避免了基因操纵或病毒转导的干细胞, 这两个充满了额外的临床安全性和有效性的问题¹⁵。最后, 微辐照器的发展使 ebt 在啮齿类动物²¹中的应用成为可能。

在本文中, 我们演示了如何通过在小鼠体内注射人的 ipsc 来创建小动物形成畸胎瘤的模型。然后, 我们展示了如何应用 ebrt 选择性地消除这些肿瘤在体内与最小的损害周围的组织。这种方法为 psc 衍生的畸胎瘤提供了有针对性的治疗, 同时避免了生物分子和肽的系统传递以及 psc 的基因操纵所产生的非目标效应。为了调查目的, 我们提供了一个可选的步骤, 通过生物发光成像 (bri) 来跟踪肿瘤对放射治疗的反应。

研究方案

这项动物实验是在斯坦福大学的机构审查委员会和实验动物护理管理小组下批准和进行的。

1. ipsc 的细胞培养

1. 在涂有基底膜基质 (例如, matrigel, 称为以下基质) 的6孔板上重新编程而获得的人的 ipsc。
2. 每天用在37°c 和 5% co 2 孵育的浓缩培养基 (见材料表) 改变 ipsc 的培养基.
3. 一旦细胞达到80–90% 的融合 (大约每 4天), 每口添加1毫升重组细胞离解酶 (见材料表), 并在37°c 孵育5分钟。
4. 5分钟后, 通过移液将细胞与井中分离, 将其转移到15毫升管中, 离心机以 300 x g.
5. 离心后, 在1:1000 稀释时, 将上清液吸气并重新悬浮到浓缩培养基中 (见材料表)。
6. 对离解的细胞进行细胞计数, 并以 2 x 10 5 至 4 x 10 5 的密度在基质涂层的6孔板上复制细胞.

2. 具有双融合报告基因的 ipsc 的转导

1. 按常规情况在6孔板中通过 ipsc, 并添加含有6μml 己二胺溴的浓缩培养基 (见材料表)。
   请注意:理想的菌落大小为200–400细胞/菌落, 以产生最高的传导效率。
2. 在4°c 下, 采用液相变离心, 用 sw-29 转子在2小时内2小时, 将携带萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白 (fluc-egfp) 的病毒浓缩, 由人类泛素启动子 c 驱动。
3. 在10的多重感染 (moi) 中将病毒精矿添加到6孔板中的 ipsc 中, 并在 5% co 2 的37°c 下孵育过夜。
   请注意:通过荧光活化细胞分选 (facs) 扫描分析的单粒细胞荧光蛋白的表达, 确定了感染的多样性。
4. 第二天, 在室温下, 以 300 x g 离心 ipsc 6 孔板 6分钟, 取出病毒。
5. 每天根据协议使用丰富的培养基 (见材料表) 和段落来改变媒体。利用荧光显微镜测定 egfp 的近似转导效率。
6. 30–40% 的效率足以进行外地资产管理系统的排序。如果至少有30-40% 的细胞表达 egfp, 则继续使用表示 egfp 的高保经济伙伴关系的低收入发展中国家。
7. 为了证实 fluc 在体内的活性, 用 ffp 对表达 gfp 的细胞进行了平板处理, 每口井密度为 5, 000个细胞。
8. 用生物发光记者探针 d-荧光素 (100μmol) 将被转移的细胞和非转染细胞 (将作为负对照) 培养 6小时. 用微板分光计测量生物发光。

3. 免疫缺陷小鼠畸胎瘤形成背侧 psc 的移植

1. 在含有人 ipsc 的6孔板中加入1毫升重组细胞离解酶混合物, 并在培养中使用双融合报告基因 (fluk-gfp) (见第2节) 孵育5分钟。
2. 潜伏期后, 通过移液器抽吸和表达分散细胞。加入相同体积的培养基, 然后在 250 x g的离心机4分钟。
3. 离心完成后, 吸气上清液溶液, 将细胞颗粒重新悬浮在30μl 的基质中, 并将其放在冰上, 以保持其在注射前的活力。使用血细胞仪确认 1 x 10⁶细胞的收获。
4. 如果使用双融合报告基因转染细胞, 将双阳性流式细胞 (从第2节) 悬浮在30μl 的基质中。
5. 在8-10 的胸腺裸鼠中, 用2% 的氟与1L/min 氧进行麻醉, 然后用2% 的异氟醚与氧气的1L/min 进行维持。
6. 使用 28.5 g 注射器, 将细胞基质混合物 (见材料表) 悬浮在侧翼的皮下空间, 目标是总共注射 5 x 10 3 至 5 x^{10 6 个细胞}(每次注射约 100 ul⁾ 。
7. 如果计划长时间维持小鼠, 并预测大的肿瘤生长, 请考虑更有尾端注射的部位。
8. 麻醉动物被允许在加热的垫子上恢复, 直到流动 (通常和 lt;1h) 与呼吸率, 脚趾的肤色监测, 直到流动。

4. 移植细胞的生物发光成像 (bi), 以评估细胞存活和畸胎瘤生长

1. 在接种后的所需时间点, 对小鼠进行腹腔内注射 375 mg kg 的记者探针 d-luciferin。
2. ip 注射10分钟后, 使用1分钟采集窗口, 每隔5分钟对麻醉动物中的生物发光信号进行30分钟的成像 (如步骤3.5 中所述)。
   请注意:建议每周采集映像。麻醉是在成像过程中通过鼻锥输送吸入的异氟醚来维持的。
3. 对于数据分析, 在 bl 信号上绘制感兴趣的区域 (roi), 然后在采集时间内进行归一化, 以每平方厘米 (光子) 的最大光子/秒为单位量化排放量.

5. 使用临床前图像引导的辐照器进行畸胎瘤照射 (图 1)

1. 在1% 的氧气中使用2% 异氟烷的小鼠在 1 l/min 的流量下, 将鼠标放在一个击倒盒中。在鼠标完全麻醉后, 将其转移到图像引导的临床前辐照器的床上 (见材料表)。通过鼻锥持续通过2% 的异氟醚维持麻醉。
2. 使用40kvp、2 ma x 射线光束获取一组360°投影图像, 并将其重建为各向同性像素大小为 0.2 mm 的体积图像。
3. 使用 rt _ image 软件包 (http://rtimage.sourceforge.net/) 规划使用微 ct 图像的放射治疗, 并执行放射治疗。
   请注意:所使用的治疗方案包括两个 225kvp x 射线光束, 定向通过表面的目标畸胎瘤, 同时绕过鼠标其余部分的表面, 并节省底层内脏。根据季度系统校准数据调整光束的曝光时间, 使目标肿瘤中心的剂量为6戈瑞。
4. 连续三天重复治疗过程, 总共向目标肿瘤输送 1 8 戈瑞。
5. 保持对动物的标准治疗后护理。

结果

注射小鼠通常会在4-8周后显示畸胎瘤的生长形成, bli 成像证实了这一点 (图 2)。当细胞分娩一个月后, 用18戈瑞的累积剂量照射, 肿瘤会急剧缩小, 导致荧光素酶信号显著下降 (图 2)。重要的是, 从辐照部位取5毫米的正常组织似乎没有任何重大损伤 (图 3)。

讨论

"干细胞旅游" 受害者的临床前数据和传闻案例证实, 患上畸胎瘤的风险是与 psc 治疗23有关的一个严重缺陷。因此, 制定谨慎的方法来预防和治疗与干细胞疗法相关的肿瘤风险是促进再生干细胞疗法临床翻译的一个重要步骤。在本文中, 我们描述了一种方法的治疗靶向靶向 psc 相关畸胎瘤使用 ebrt 在小鼠模型中, 并显示了动态萎缩的辐照肿瘤使用 bi 成像。

我们?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation