Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño

Resumen

Investigación sobre las estrategias de tratamiento de los teratomas derivados de células madre pluripotentes es importante para la traducción clínica de la terapia de células madre. Aquí, describimos un protocolo para, en primer lugar, generar derivados de células madre de los teratomas en ratones y, luego, selectivamente objetivo y tratar estos tumores in vivo utilizando un irradiador de pequeños animales.

Resumen

El creciente número de víctimas del "Turismo de células madre," el trasplante no regulado de las células madre en todo el mundo, ha generado preocupaciones sobre la seguridad del trasplante de células madre. Aunque el trasplante del distinguido en lugar de células indiferenciadas es práctica común, los teratomas pueden surgir todavía de la presencia de células madre no diferenciadas residual en el momento del trasplante o de mutaciones espontáneas en distinguido células. Porque las terapias con células a menudo se entregan en sitios anatómicamente sensibles, incluso pequeños tumores pueden ser clínicamente devastadoras, resultando en ceguera, parálisis, anormalidades cognitivas y disfunción cardiovascular. Acceso quirúrgico a estos sitios también puede ser limitado, dejando a los pacientes con pocas opciones terapéuticas. Controlar el mal comportamiento de la célula de vástago es, por lo tanto, fundamental para la traducción clínica de la terapia de células madre.

Radioterapia externa ofrece un medio eficaz de ofrecer terapia dirigida a disminuir la carga de teratoma y reducir al mínimo lesión a órganos circundantes. Además, este método evita la manipulación genética o transducción viral de las células madre que están asociados con preocupaciones de eficacia y seguridad clínica adicional. Aquí, describimos un protocolo para crear los teratomas derivados de células madre pluripotentes en ratones y aplicar radioterapia de haz externo para ablar selectivamente estos tumores in vivo.

Introducción

El desarrollo de terapias con células madre para regeneración de tejidos ha encontrado un número de barreras en las últimas décadas, dificultando los esfuerzos para la implementación clínica eficiente. Estos obstáculos incluyen retención de células pobres en los sitios de entrega, inmunogenicidad de células madre y el potencial neoplásico de forma teratomas¹. Colonización es de especial interés clínico como potencialmente puede dañar la célula de vástago trasplante los receptores². Cuentas de la formación de un tumor debido a inyecciones de células madre se han divulgado ya en múltiples escenarios clínicos^3,4,5. El potencial para la formación del teratoma es el más frecuentemente citado preocupación clínica en desarrollo (PSC) de la célula de vástago de pluripotent y ha dado lugar a retrasos y cancelaciones de alto perfil múltiples células madre embrionarias (ESC) e inducida por la célula de vástago de pluripotent (iPSC) ensayos^6,7,8,9. Así, hay una necesidad urgente de una investigación traslacional dedicada a proveer un tratamiento apropiado, estos tumores iatrogénicos se produjese.

Hasta la fecha, más estrategias para controlar el mal comportamiento de la célula de vástago se han centrado en reducir el número de PSCs con potencial tumorígeno del^2,10. Desafortunadamente, sólo un pequeño número de células residuales (por ejemplo., 1 x 10⁴ a 1 x 10⁵ células¹¹) es necesario para la formación del teratoma, que es muy por debajo del límite de detección citada por ensayos actualmente disponibles^{12, 13}. otras limitaciones de la utilización de estos métodos preseparación incluyen baja eficiencia y alto costo, dependencia de suspensiones unicelular que puede no ser apropiado para nuevos enfoques de la ingeniería de tejidos y el deterioro potencial de la célula supervivencia y el engraftment.

Pocos estudios han abordado las opciones de tratamiento tras formación de teratoma. Quizás la estrategia más estudiada es la incorporación de genes de "suicidio" en las células de vástago^14,15. Este método consiste en manipular genéticamente las células para incorporar un gen inducible por activación de apoptosis que puede ser activado por postinjection de estimulación farmacológica, proporcionando así un enfoque de rescate si las células inyectadas producen teratomas. Este enfoque, sin embargo, adolece de importantes inconvenientes, incluidos los efectos off-target de modificaciones genéticas del PSC y la posibilidad de un desarrollo gradual de fármaco resistencia¹⁶. Un enfoque similar utiliza moléculas pequeñas para inducir muerte celular selectiva de PSC a través de la inhibición de la anti-apoptotic caminos¹⁷. Otros grupos han dirigido la muerte celular de PSCs usando los anticuerpos contra marcadores de pluripotencia la superficie, como podocalyxin-like protein-1 (PODXL)¹⁸. El momento de la entrega de moléculas pequeñas o anticuerpo se encuentra tener un impacto significativo en el potencial terapéutico de PSCs si entregado demasiado pronto y puede carecer de eficacia terapéutica si se entrega demasiado tarde. Además, no se han estudiado los efectos sistémicos de pequeñas moléculas y anticuerpos utilizados de esta manera.

Un enfoque alternativo para el tratamiento de estos tumores se basa en el uso de radioterapia de haz externo (EBRT). EBRT es una de las modalidades primarias actualmente empleadas en el tratamiento de tumores sólidos¹⁹. Innovaciones en la EBRT, incluyendo el desarrollo del haz de protones y la radiocirugía estereotáctica, han permitido la selección mejorada de estructuras patológicas evitando daño al tejido normal, lo ideal para abordar teratoma EBRT conformal formación en las estructuras anatómicamente sensibles²⁰. Además, este método evita la manipulación genética o la transducción viral de las células madre, que se llena de seguridad clínica adicional y eficacia refiere a¹⁵. Finalmente, los avances en micro-Irradiadores han permitido la aplicación de la EBRT en roedores²¹.

En este artículo se demuestra cómo crear un modelo de animal pequeño de formación teratoma inyectando iPSCs humano en ratones. A continuación mostramos cómo aplicar EBRT para erradicar selectivamente estos tumores in vivo con un daño mínimo al tejido circundante. Este enfoque proporciona una terapia dirigida para los teratomas derivados de PSC, evitando los efectos off-target de la entrega sistémica de péptidos y moléculas biológicas y de la manipulación genética de los PSCs. Para fines de investigación, ofrecemos un paso opcional para transducir las células madre con genes reporteros para rastrear la respuesta del tumor a la radioterapia mediante bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen.

Protocolo

Este experimento animal fue aprobado y realizado bajo la Junta de revisión institucional y el Panel administrativo de laboratorio cuidado Animal en la Universidad de Stanford.

1. célula cultura de iPSCs

1. Crecimiento humano iPSCs por reprogramación lentivirales en placas de 6 pozos recubiertas con membrana del sótano de la matriz (por ejemplo, matrigel, denominada matriz de aquí en adelante).
2. Cambiar diariamente los medios de comunicación de iPSCs con medio de cultivo enriquecido (véase Tabla de materiales) incubando a 37 ° C y 5% CO₂.
3. Una vez que las células alcanzan confluencia de 80-90% (aproximadamente cada 4 días), agregar 1 mL de enzima recombinante disociación celular (véase Tabla de materiales) por bien e incubar a 37 ° C durante 5 minutos.
4. Después de 5 min, disociar las células desde el pozo mediante pipeteo, transferir a un tubo de 15 mL y centrifugar a 300 x g.
5. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en el medio de cultivo enriquecido (véase Tabla de materiales) enriquecido con Y27632 inhibidor en una dilución de 1:1,000.
6. Realizar un conteo de las células disociadas y replate las células en placas de 6 pozos recubiertos por la matriz a una densidad de 2 x 10⁵ a 4 x 10⁵.

2. transducción de iPSCs con un gen reportero de doble fusión

1. Paso iPSCs en placas de 6 pocillos según rutina y agregar medio de cultivo enriquecido (véase Tabla de materiales) que contiene 6 hexadimethrine bromuro μg/mL.
   Nota: El tamaño ideal de la Colonia es 200-400 células/Colonia para obtener la mayor eficiencia de la transducción de señales.
2. Concentrado inactivador por lentivirus que firefly luciferase y verde fluorescente proteína (FLuc-eGFP) conducida por el promotor ubiquitina humano-C por centrifugación de sedimento con un rotor SW-29 a 50.000 x g durante 2 h a 4 ° C.
3. Añadir el concentrado viral a iPSCs en una placa de 6 pozos en una multiplicidad de infección (MOI) de 10 e incubar durante una noche a 37 ° C en 5% CO₂.
   Nota: La multiplicidad de infección fue determinada por la expresión de proteína monomérica de la fluorescencia por un celular activado por fluorescencia clasificación exploración (FACS).
4. Al día siguiente, eliminar el virus por centrifugación de las placas de 6 pozos de iPSC a 300 x g durante 6 min a temperatura ambiente.
5. Cambiar los medios de comunicación diario con medio de cultivo enriquecido (véase Tabla de materiales) y pasaje según protocolo. Utilizar un microscopio de fluorescencia para determinar la eficacia de transducción aproximada para la eGFP.
6. Una eficiencia del 30-40% es suficiente para la clasificación de FACS. Proceder a la FACS de hiPSCs expresaban eGFP si por lo menos 30-40% de las células expresan eGFP.
7. Para confirmar actividad fluctua ex vivo, las células expresando GFP ordenado por FACS a una densidad de 5.000 células por pocillo de la placa.
8. Incube las células transduced y células no-transduced (que servirán como control negativo) con el reportero de bioluminiscencia sonda D luciferin (100 μmol/L) para 6 h. medir la bioluminiscencia con un spectrofluorometer de microplaca.

3. trasplante de PSCs en el flanco Dorsal para la formación del Teratoma en ratones inmunodeficientes

1. Añadir 1 mL de mezcla de enzima recombinante de disociación de células por placa de 6 pozos que contiene humano iPSCs transduced con un gen reportero de doble fusión (FLuc-GFP) en la cultura (véase sección 2) e incubar durante 5 minutos.
2. Después de la incubación, dispersar las células por la pipeta de aspiración y expresión. Añadir un volumen igual de medio de cultivo y luego centrifugar a 250 x g durante 4 minutos.
3. Vez finalizada la centrifugación, Aspire la solución sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 30 μl de matriz y coloque en hielo para preservar su viabilidad antes de la inyección. Confirman una cosecha de 1 x 10⁶ células usando un hemocitómetro.
4. Si utilizando las células transfectadas por el gen reportero de doble fusión, suspender las células de la FACS de doble positivo (de la sección 2) en 30 μl de matriz.
5. Inducir la anestesia en ratones desnudos athymic de 8-10 semanas con isoflurance 2% de oxígeno de 1L/min y luego mantenimiento 2% isoflurano con 1L/min de oxígeno.
6. Utilizando una jeringa 28,5 G, inyectar la mezcla de células y matrix (véase Tabla de materiales) suspensión en el espacio subcutáneo en el flanco, con el objetivo de una inyección de en total 5 x 10³ a 5 x 10⁶ células (aproximadamente 100 ul por inyección).
7. Considerar un sitio más caudal de la inyección si planea mantener ratones para uso prolongado y previendo el crecimiento de un tumor grande.
8. Animales anestesiados se les permite recuperar en un cojín de calefacción hasta el ambulatorio (típicamente < 1h) con control de frecuencia respiratoria, color de los dedos del pie de la piel hasta el ambulatorio.

4. bioluminiscencia (BLI) la proyección de imagen de las células trasplantadas para evaluar la supervivencia de la célula y el crecimiento de Teratoma

1. En los puntos de tiempo deseado después de la inoculación, realizar una inyección intraperitoneal (IP) de 375 mg/kg de la sonda reportero D Luciferin en los ratones.
2. señal de 10 min después de una inyección del IP, imagen de la bioluminiscencia en los animales anestesiados (realizados como se describe en paso 3.5) por 30 min usando windows de adquisición de 1 minuto a intervalos de 5 minutos.
   Nota: Se recomiendan adquisiciones imagen semanal. La anestesia se mantiene durante la proyección de imagen entregando inhalado isoflurano a través de un cono de nariz.
3. Para el análisis de datos, dibujar una región de interés (ROI) sobre la señal BLI y, luego, normalizar el tiempo de adquisición cuantificar las emisiones en unidades de máxima fotones por segundo por centímetro cuadrado por estereorradián (fotones/s/cm²/sr).

5. teratoma irradiación usando un irradiador preclínico guiada por la imagen (figura 1)

1. Anestesiar un ratón en una caja de precipitación usando 2% isoflurano en oxígeno al 100% con un caudal de 1 L/min. Después de que el ratón está totalmente anestesiado, la transferencia a la cama de un irradiador de la clínica guiada por imágenes (véase Tabla de materiales). Mantener anestesia 2% isoflurano continuamente a través de un cono de nariz.
2. Adquirir imágenes micro-CT como un conjunto de 400 imágenes de proyección más de 360° con una 40 kVp, haz de rayos x de 2 mA y reconstruir aquellos en volumétricas imágenes con un tamaño de pixel isotrópico de 0,2 mm.
3. Planificar un tratamiento de radiación usando las imágenes micro-CT utilizando el paquete de software RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) y realizar el tratamiento.
   Nota: El plan de tratamiento consiste en haces de rayos x de dos 225 kVp, para pasar a través del teratoma objetivo superficial bordeando la superficie del resto del mouse y ahorradores de las vísceras subyacentes. Los tiempos de exposición para las vigas se ajustan en base a datos de la calibración del sistema cada tres meses para que la dosis en el centro del tumor blanco fue de 6 Gy.
4. Repita el proceso de tratamiento en tres días consecutivos para entregar un total de 18 Gy al tumor blanco.
5. Mantener tratamiento estándar posterior cuidado de los animales.

Resultados

Ratones inyectados demuestran típicamente formación de crecimiento de teratoma después de 4 – 8 semanas confirmado por BLI proyección de imagen (figura 2). Los tumores se reducirá dramáticamente cuando es irradiado con una dosis acumulativa de 18 Gy dada un mes después de la entrega de la célula, resultando en una disminución significativa en la señal de la luciferasa (figura 2). Importante, tomados 5 mm en el sitio i...

Discusión

Los datos preclínicos y casos anecdóticos de las víctimas del "Turismo de células madre" confirman que el riesgo de desarrollar teratomas es un serio inconveniente asociado con PSC tratamientos²³. Desarrollo de enfoques de cuidado para prevenir y tratar el riesgo neoplásico asociado a terapias con células madre es, por lo tanto, un paso importante para facilitar la traducción clínica de terapias regenerativas celulares. En este artículo, se describe un método de orientación terapéutica...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation