טיפול ממוקד, סלקטיבי של Teratomas נגזר תאי גזע Pluripotent באמצעות קרינה חיצוני קרן במודל של חיית-קטן

Summary

מחקר על אסטרטגיות טיפול teratomas נגזר תאי גזע pluripotent חשוב התרגום קלינית של טיפול בתאי גזע. כאן, אנו מתארים לפרוטוקול, ראשית, להפיק תאי גזע-derived teratomas בעכברים ולאחר, מכן, ל סלקטיבי היעד ולטפל ויוו שימוש בעוצמה קטנה-חיה של גידולים אלה.

Abstract

המספר הגדל והולך של קורבנות של "תאי גזע תיירות," השתלת ללא פיקוח של תאי גזע ברחבי העולם, העלה חששות לגבי הבטיחות של השתלת תא גזע. למרות השתלת של הבדיל ולא התאים מובחן הוא מנהג נפוץ, teratomas יכול עדיין לנבוע הנוכחות של תאי גזע מובחן שיורית בזמנו של השתלה או של מוטציות ספונטניות הבדיל תאים. כי תאי הגזע טיפולים מועברות לעיתים קרובות לאתרים רגישים מבחינה אנטומית, גידולים קטנים אפילו יכולה להיות הרסנית קלינית, וכתוצאה מכך עיוורון, שיתוק, הפרעות קוגניטיביות, בתפקוד הלב וכלי הדם. גישה כירורגית באתרים אלה עשוי גם להיות מוגבל, עוזב חולים עם כמה אפשרויות טיפוליות. שליטה תאי גזע התנהגות בלתי הולמת, לפיכך, הוא קריטי עבור התרגום קלינית של טיפול בתאי גזע.

קרינה חיצוני קרן מציע אמצעי יעיל של העברת טיפול ממוקד כדי להקטין את הנטל טרטומה תוך מזעור הפגיעה סביב האיברים. בנוסף, שיטה זו מונע מניפולציה גנטית או ויראלי התמרה חושית של תאי גזע-אשר משויכים חששות יעילות ובטיחות קליניים נוספים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליצירת teratomas נגזר תאי גזע pluripotent בעכברים וכדי להחיל חיצוני קרן הקרנות באופן סלקטיבי ablate ויוו גידולים אלה.

Introduction

ההתפתחות של תאי גזע טיפולים התחדשות רקמות נתקל מספר מחסומים בעשרות השנים האחרונות, פוגעות המאמצים לפריסה קליניים יעיל. משוכות אלה כוללים שמירה תא המסכן באתרים של משלוח, תאי הגזע immunogenicity פוטנציאל אמצעים teratomas טופס¹. Tumorigenicity הוא של דאגה קלינית מסוימת כמו זה עלולים להזיק לתאי גזע להשתלות נמענים². חשבונות היווצרות גידול עקב הזרקת תאי גזע ללא פיקוח כבר דווחו מספר הגדרות קליניים^3,4,5. פוטנציאל היווצרות טרטומה הוא ביותר לעתים קרובות ציטט את הדאגה קליניים בהתפתחות תאי גזע (PSC) pluripotent יש הביא עיכובים וביטולים של מספר בעלי פרופיל גבוה בתאי גזע עובריים (ESC) וכן המושרה תא גזע pluripotent (iPSC) ניסויים^6,7,8,9. לפיכך, יש צורך דחוף חקירה translational ייעודי לקראת מתן טיפול מתאים, צריך להיווצר גידולים iatrogenic אלה.

נכון להיום, רוב אסטרטגיות כדי לשלוט התנהגות בלתי הולמת תאי גזע התמקדו הפחתת מספר מגירסה tumorigenic פוטנציאליים^2,10. למרבה הצער, רק מספר קטן של תאים שיורית (למשל., עונה 1 פרק 10⁴ -עונה 1 פרק 10⁵ תאים¹¹) דרוש עבור טרטומה המרמזת, רחוק מתחת לגבול זיהוי צוטט על ידי מבחני זמין כעת^{12, 13}. מגבלות אחרות של באמצעות שיטות preseparation אלה כוללים יעילות נמוכה, הוצאות גבוהות, הסתמכות על המתלים מתא בודד יכול להיות לא מתאימות גישות הנדסת רקמות חדשות יותר, ירידת ערך פוטנציאלית של התא הישרדות, engraftment.

מחקרים מעטים עסקו אפשרויות טיפול בעקבות היווצרות טרטומה. אולי האסטרטגיה ביותר למד היטב הוא שילוב של "התאבדות" גנים לתוך תאי גזע^14,15. שיטה זו כרוכה מניפולציה גנטית תאי גזע לשלב של ג'ין inducible אפופטוזיס-הפעלת כי יכול להיות מופעל על ידי גירוי תרופתי postinjection, ובכך מספק גישה הצלה אם מוזרק מפרישים teratomas. גישה זו, עם זאת, סובל חסרונות משמעותיים, כולל את המטרה השפעות שינויים גנטיים של מגירסה ואת הפוטנציאל התפתחות הדרגתית של ההתנגדות סמים¹⁶. בגישה דומה מנצל מולקולות קטנות כדי לגרום מוות תאי סלקטיבי של מגירסה דרך עיכוב של מסלולים אנטי-מוות¹⁷. קבוצות אחרות בוחר תא מות מגירסה באמצעות נוגדנים נגד סמני פני השטח pluripotency, כגון podocalyxin, כמו חלבון-1 (PODXL)¹⁸. העיתוי של מולקולה קטנה או נוגדן משלוח עומד יש השפעה משמעותית על הפוטנציאל הטיפולי מגירסה אם נמסר מוקדם מדי, אולי חוסר יעילות טיפולית אם נמסר מאוחר מדי. בנוסף, ההשפעות מערכתית של מולקולות קטנות, נוגדנים להשתמש בצורה הזאת לא נחקרו.

גישה אלטרנטיבית לטיפול גידולים אלה מסתמך על באמצעות טיפול קרינתי חיצוני קרן (EBRT). EBRT הוא אחד שהאפנות העיקריים מועסקים כיום הטיפול של גידולים מוצקים¹⁹. חידושים EBRT, כולל הפיתוח של קרן פרוטונים ו סטיאוטטי radiosurgery, אפשרו מיקוד משופרת של מבנים פתולוגי תוך הימנעות נזק הרקמות, שהופך EBRT קונפורמית אידיאלי עבור מיעון תפלצת היווצרות מבנים רגישים מבחינה אנטומית²⁰. בנוסף, שיטה זו מונע את מניפולציה גנטית או ויראלי התמרה חושית של תאי גזע, אשר הם שניהם כרוך בטיחות קלינית נוספת, היעילות נוגע¹⁵. לבסוף, ההתקדמות מיקרו-irradiators הפעלת היישום של EBRT מכרסמים²¹.

במאמר זה נדגים כיצד ליצור מודל קטן-חיה היווצרות טרטומה באמצעות הזרקת iPSCs אנושי בעכברים. ואז נראה איך ליישם EBRT באופן סלקטיבי להשמיד גידולים אלה ויוו עם מינימום נזק לרקמות. גישה זו מספקת טיפול ממוקד teratomas נגזר PSC תוך הימנעות ההשפעות את המטרה של המשלוח מערכתית של מולקולות ביולוגיות, פפטידים מניפולציה גנטית של מגירסה. למטרות לניסויים קליניים, אנו מציעים שלב אופציונלי כדי מגלי תאי גזע עם הגנים כתב כדי לעקוב אחר הגידול בתגובה הקרנות באמצעות ביולומינסנציה הדמיה (בלי).

Protocol

ניסויים בבעלי חיים זו אושרה והופיע תחת ועדת הבדיקה מוסדיים והפאנל ניהול על מעבדה חיה אכפת באוניברסיטת סטנפורד.

1. תא תרבות של iPSCs

1. לגדול iPSCs האדם נגזר על ידי התכנות lentiviral על 6-ובכן צלחות מצופה קרום המרתף מטריקס (למשל, matrigel, המכונה מטריקס לכאן בזמן שנסעתי).
2. מדי יום לשנות את התקשורת של iPSCs מועשר תרבות בינונית (ראה טבלה של חומרים) המקננת-CO 37 ° C ו-5%₂.
3. ברגע התאים להגיע למפגש 80-90% (כ מדי 4 ימים), להוסיף 1 מ"ל של האנזים תא רקומביננטי-דיסוציאציה (ראה טבלה של חומרים) לכל טוב ואני דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
4. לאחר 5 דקות, לנתק את התאים מן הבאר מאת pipetting להעביר אותם ל צינור 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 300 x גרם.
5. לאחר צנטריפוגה, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא לתוך מועשר תרבות בינוני (ראה טבלה של חומרים) מועשר Y27632 מעכב-לדילול 1:1,000.
6. לבצע ספירת תאים של תאי dissociated, replate את התאים על מצופים מטריצה לוחות 6-ובכן-צפיפות של 2 x 10⁵ 4 x 10⁵.

2. התמרה חושית של iPSCs עם גנים כתב כפול-fusion

1. מעבר iPSCs ב 6-ובכן צלחות לפי השגרה ולהוסיף מועשר תרבות בינוני (ראה טבלה של חומרים) המכיל 6 µg/mL hexadimethrine ברומיד.
   הערה: הגודל האידיאלי המושבה הוא 200-400 תאים/המושבה להניב את היעילות הגבוהה של התמרה חושית.
2. להתרכז lentivirus עצמית inactivating נושאת גחלילית לוציפראז וירוק חלבון פלואורסצנטי (FLuc-eGFP) מונע על ידי האדם אוביקוויטין promotor-C על ידי צנטריפוגה משקעים עם הרוטור SW-29 ב x 50,000 g עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס.
3. מוסיפים את תרכיז ויראלי iPSCs בצלחת 6-ובכן-ריבוי של זיהום (MOI) של 10, דגירה בין לילה ב 37 ° C-5% CO₂.
   הערה: הריבוי של זיהום נקבע על-ידי הביטוי של חלבון זריחה monomeric נותחו על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) סריקה.
4. למחרת, להסיר את הווירוס בעזרת צנטריפוגה הלוחיות 6-ובכן iPSC ב x 300 גרם במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר.
5. לשנות את התקשורת מדי יום עם מועשר תרבות בינוני (ראה טבלה של חומרים) ומעבר לפי פרוטוקול. לנצל מיקרוסקופ זריחה כדי לקבוע את היעילות התמרה חושית המשוער עבור eGFP.
6. יעילות של 30-40% מספיקה לצורך מיון FACS. להמשיך FACS של hiPSCs לבטא eGFP אם לפחות 30-40% של התאים אקספרס eGFP.
7. כדי לאשר פעילות FLuc ex-vivo, צלחת התאים לבטא GFP ממוין לפי FACS על צפיפות של תאים 5,000 לכל טוב.
8. דגירה התאים transduced ו- transduced תאים (אשר ישמש הפקד שלילי) עם הכתב ביולומינסנציה בדיקה D-luciferin (μmol 100/L) עבור 6-אייץ למדוד את ביולומינסנציה עם מצלמות-דיגיטליות microplate.

3. השתלת של מגירסה לאגף הגבי של היווצרות טרטומה בעכברים Immunodeficient

1. להוסיף 1 מ"ל של תא רקומביננטי-דיסוציאציה תערובת אנזימים לכל צלחת 6-ובכן המכיל iPSCs האדם transduced עם גנים כפול-fusion כתב (FLuc-GFP) בתרבות (ראה סעיף 2), תקופת דגירה של 5 דקות.
2. לאחר תקופת דגירה, לפזר את התאים על ידי השאיפה פיפטה וביטוי. הוסף אמצעי שווה של תרבות בינוני, ואז צנטריפוגה ב x 250 g למשך 4 דקות.
3. בתום צנטריפוגה, וארוקן את הפתרון supernatant, resuspend בגדר תא ב 30 µL של מטריקס, ומניחים אותו על קרח כדי לשמר את יכולת הקיום שלה לפני ההזרקה. לאשר הקציר של עונה 1 פרק 10⁶ תאים באמצעות של hemocytometer.
4. אם ניצול כפול-fusion כתב-ג'ין-transfected תאים, להשעות את התאים FACS כפול-חיוביות (מתוך סעיף 2) µL 30 של מטריקס.
5. לגרום הרדמה בשבוע 8-10 athymic עירום עכברים באמצעות 2% isoflurance עם חמצן 1 ליטר/דקה, ולאחר מכן השתמש תחזוקה 2% איזופלוריין עם 1 ליטר/דקה של חמצן.
6. באמצעות מזרק 28.5 G, להזריק תא/מטריצה תערובת (ראה טבלה של חומרים) השעיה לחלל תת עורית-האגף, מכוון זריקה של 5 x 10 סה כ³ 5 x 10⁶ תאים (כ-100 ul לכל זריקה).
7. שקול אתר הזרקת יותר סימטרית אם מתכנן לשמור על עכברים הממושכת, מצפה הגידול גדול.
8. מרדימים בעלי חיים מותרים לשחזר על כרית מחוממת עד אמבולטורי (בדרך כלל < 1h) עם ניטור של קצב נשימה, צבע העור של האצבעות עד אמבולטורי.

4. ביולומינסנציה הדמיה (בלי) של התאים המושתלים להעריך הישרדות Cell וצמיחה תפלצת

1. -Timepoints הרצוי לאחר חיסון, לבצע זריקה (IP) בקרום הבטן של 375 מ"ג/ק"ג של המכשיר כתב D-Luciferin לתוך העכברים.
2. 10 דקות לאחר זריקה IP, התמונה ביולומינסנציה אות את החיות anesthetized (מתבצעות כשלב שמתואר 3.5) במשך 30 דקות באמצעות windows רכישה 1דקות במרווחים של 5-מין.
   הערה: רכישות תמונה שבועית מומלצת. הרדמה תישמר במהלך דימות על-ידי אספקת בשאיפה איזופלוריין באמצעות קונוס האף.
3. לניתוח נתונים, לצייר אזור בעל עניין (ROI) מעל האות רבנות בלי ו, אז, לנרמל הפעם הרכישה לכמת פליטות ביחידות של מרבית פוטונים לשניה לסנטימטר מרובע לכל סטרדיאן (פוטונים/s/ס מ²/sr).

5. תפלצת הקרנה באמצעות של פרה תמונה מונחה בעוצמה (איור 1)

1. עזים ומתנגד עכבר בקופסת תמונות ציפורים באמצעות 2% איזופלוריין 100% חמצן בספיקה של 1 ליטר/דקה. אחרי העכבר הוא מורדם לחלוטין, להעביר אותו אל המיטה של תמונה מונחה בעוצמה קליניים (ראה טבלה של חומרים). לשמור על הרדמה על ידי 2% איזופלוריין באופן רציף באמצעות קונוס האף.
2. לרכוש תמונות מיקרו-CT כערכה של הקרנה 400 תמונות מעל 360 מעלות באמצעות של kVp 40, אמא 2 קרן רנטגן, ולשחזר אותם לתוך נפח תמונות עם גודל פיקסל איזוטרופיות של 0.2 מ מ.
3. תוכנית טיפול קרינה באמצעות הדימויים מיקרו-CT באמצעות חבילת התוכנה RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) ולבצע את הטיפול.
   הערה: תוכנית הטיפול נעשה שימוש מורכב kVp 225 שני קרני רנטגן, מונחה לעבור טרטומה היעד שטחית תוך כדי עוקפת את פני השטח של כל של העכבר, ממעט את הקרביים המשמש כבסיס. זמני חשיפה עבור הקורות מותאמים לפי רבעון נתוני כיול המערכת כך המינון במרכז הגידול היעד היה 6 Gy.
4. חזור על תהליך הטיפול ב- 3 ימים רצופים כדי להעביר סך של 18 Gy הגידול היעד.
5. לשמור על סטנדרט שלאחר הטיפול על בעלי החיים.

תוצאות

עכברים מוזרק בדרך כלל תדגים טרטומה היווצרות צמיחה לאחר 4-8 שבועות, כפי שאושר על-ידי מתה על הדמיה (איור 2). גידולים יתכווץ באופן משמעותי כאשר מוקרן עם מנה מצטברת של Gy 18 בהתחשב חודש לאחר הלידה תא, וכתוצאה מכך ירידה משמעותית אות לוציפראז (איור 2). ?...

Discussion

מקרים אנקדוטיים קורבנות של "תאי גזע תיירות" ונתונים פרה לאשר הסיכון לפתח teratomas הוא חיסרון רציני המשויך PSC טיפולים²³. פיתוח של גישות זהיר כדי למנוע ולטפל שהסיכון אמצעים תאי טיפולים, לפיכך, הוא צעד חשוב בקידום התרגום קליני בתאי גזע משובי טיפולים. במאמר זה, אנחנו תיאר שיטה טיפולית פ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation