Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

Resumo

Pesquisa sobre estratégias de tratamento para os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes é importante para a tradução clínica de terapia de células-tronco. Aqui, descrevemos um protocolo para, em primeiro lugar, gerar células-tronco derivadas os teratomas em camundongos e, depois, para seletivamente alvo e tratar estes tumores in vivo usando uma difusora de pequenos animais.

Resumo

O crescente número de vítimas do "turismo de células-tronco," o não regulamentado transplante de células-tronco em todo o mundo, levantou preocupações sobre a segurança do transplante de células-tronco. Embora o transplante de diferenciados ao invés de células indiferenciadas é prática comum, os teratomas ainda podem decorrer da presença de células-tronco indiferenciadas residuais no momento do transplante ou de mutações espontâneas em diferenciados células. Porque muitas vezes, terapias de células-tronco são entregues em locais sensíveis anatomicamente, mesmo pequenos tumores podem ser clinicamente devastadoras, resultando em cegueira, paralisia, anormalidades cognitivas e disfunção cardiovascular. Acesso cirúrgico a esses sites também pode ser limitado, deixando os pacientes com poucas opções terapêuticas. Controlar o mau comportamento de células-tronco é, portanto, fundamental para a tradução clínica de terapia de células-tronco.

Radiação de feixe externo oferece um meio eficaz de fornecer terapia-alvo para diminuir a carga de teratoma, minimizando lesões ao redor de órgãos. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que estão associados com preocupações de eficácia e segurança clínica adicional. Aqui, descrevemos um protocolo para criar os teratomas de células-tronco derivadas de pluripotentes em camundongos e aplicar radioterapia de feixe externo para ablate seletivamente estes tumores in vivo.

Introdução

O desenvolvimento de terapias de células-tronco para regeneração de tecidos encontrou uma série de barreiras nas últimas décadas, prejudicando os esforços para a implantação eficiente de clínica. Estes obstáculos incluem retenção de célula pobre nos locais de entrega, imunogenicidade de células-tronco e o potencial neoplásico como forma os teratomas¹. Tumorigenicidade é de particular preocupação clínica, como isso pode prejudicar de destinatários de transplante de células-tronco². Contas de formação de tumor devido às injeções de células-tronco não regulamentada já foram relatadas em vários ambientes clínicos^3,4,5. O potencial para formação de teratoma é mais frequentemente citada clínica preocupação no desenvolvimento de (PSC) células-tronco pluripotentes e provocou atrasos e cancelamentos de alto perfil Múltiplo células-tronco embrionárias (ESC) e induzida por células-tronco pluripotentes (iPSC) ensaios^6,7,8,9. Assim, há uma necessidade premente de uma investigação translacional dedicada para fornecer o tratamento adequado, estes tumores iatrogênicas surgirem.

Até à data, a maioria das estratégias para controlar o mau comportamento de células-tronco têm-se centrado na redução do número de EPS com^2,de potencial tumorigénico¹⁰. Infelizmente, apenas um pequeno número de células residuais (ex.., 1 x 10⁴ a 1 x 10⁵ células¹¹) é necessário para formação de teratoma, que é muito abaixo do limite de detecção citada por ensaios disponíveis atualmente^{12, 13}. outras limitações de usar esses métodos recipiente incluem baixa eficiência e alta despesa, dependência de suspensões de célula única que podem não ser adequados para novas abordagens de engenharia de tecidos e o prejuízo potencial de célula sobrevivência e enxertia.

Poucos estudos abordaram-se as opções de tratamento, seguindo-se formação de teratoma. Talvez a estratégia mais bem estudada é a incorporação de genes de "suicídio" de células-tronco de^14,15. Este método envolve manipular geneticamente as células-tronco para incorporar um gene de apoptose-ativando inducible que pode ser ativado por postinjection estimulação farmacológica, proporcionando uma abordagem de resgate, se as células injetadas produzem os teratomas. Esta abordagem, no entanto, sofre de desvantagens significativas, incluindo efeitos fora do alvo de modificações genéticas do EPS e o potencial para um desenvolvimento gradual da resistência de droga¹⁶. Uma abordagem semelhante utiliza pequenas moléculas para induzir a morte celular seletiva das EPS através da inibição de anti-apoptotic vias¹⁷. Outros grupos têm como alvo a morte celular das EPS usando anticorpos contra pluripotência marcadores de superfície, tais como podocalyxin, como proteína-1 (PODXL)¹⁸. O timing da pequeno-molécula ou anticorpo entrega significa ter um impacto significativo sobre o potencial terapêutico das EPS se entregue muito cedo e podem não ter efeito terapêutico se entregue muito tarde. Além disso, não foram estudados os efeitos sistêmicos de pequenas moléculas e anticorpos utilizados desta forma.

Uma abordagem alternativa para o tratamento destes tumores baseia-se sobre o uso de terapia de radiação de feixe externo (RT). RT é uma das principais modalidades atualmente empregadas no tratamento de tumores sólidos¹⁹. Inovações em RT, incluindo o desenvolvimento do feixe de próton e radiocirurgia estereotáxica, permitiram a segmentação avançada de estruturas patológicas, evitando danos ao tecido normal, tornando RT conformal ideal para abordar o teratoma formação em estruturas anatomicamente sensível²⁰. Além disso, este método evita a manipulação genética ou transdução viral de células-tronco, que são ambos repleta de clínicos adicionais de segurança e eficácia diz respeito a¹⁵. Finalmente, os avanços na micro-irradiators permitiram a aplicação da RT em roedores²¹.

Neste artigo, demonstramos como criar um modelo pequeno-animal de formação teratoma injetando iPSCs humano em ratos. Então mostramos como aplicar RT para seletivamente erradicar estes tumores in vivo com danos mínimos ao tecido circundante. Essa abordagem fornece uma terapia-alvo para os teratomas PSC-derivado, evitando os efeitos fora do alvo da entrega sistêmica de moléculas biológicas e peptídeos e a manipulação genética, o EPS. Para fins experimentais, oferecemos um passo opcional para transduce células-tronco com genes repórter para controlar a resposta do tumor à radioterapia através de bioluminescência (BLI) de imagem.

Protocolo

Este experimento animal foi aprovado e executado sob o Conselho de revisão institucional e o painel administrativo no cuidado de Animal de laboratório na Universidade de Stanford.

1. células cultura de iPSCs

1. Cresce humano iPSCs derivado pela reprogramação Lentivirus em placas 6-poço revestidas com membrana basal matriz (por exemplo, matrigel, conhecido como matriz aqui).
2. Mudar diariamente os meios das iPSCs com meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) incubar a 37 ° C e 5% de CO₂.
3. Uma vez que as células alcança a confluência de 80-90% (aproximadamente a cada 4 dias), adicionar 1 mL da enzima recombinante célula-dissociação (ver Tabela de materiais) por bem e incubar a 37 ° C por 5 min.
4. Depois de 5 min, dissociar as células do poço por pipetagem, transferi-los para um tubo de 15 mL e centrifugar a 300 x g.
5. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) enriquecido com inibidor de Y27632 a uma diluição de 1:1,000.
6. Realizar uma contagem de células de células dissociadas e replate as células na matriz-revestido de placas de 6-poços em uma densidade de 2 x 10⁵ a 4 x 10⁵.

2. transdução de iPSCs com um Gene repórter do duplo-fusão

1. Passagem iPSCs em placas de 6-bem como por rotina e adicionar o meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) contendo brometo da hexadimethrine de 6 µ g/mL.
   Nota: O tamanho ideal da colônia é 200-400 células/colônia para produzir a mais alta eficiência de transdução.
2. Concentre-se self inactivar lentivirus carregando vagalume luciferase e verde fluorescente da proteína (FLuc-eGFP) conduzida pelo promotor da ubiquitina humana-C por centrifugação do sedimento com um rotor de SW-29 a 50.000 x g durante 2 h a 4 ° C.
3. Adicione o concentrado viral para as iPSCs em uma placa de 6 em uma multiplicidade de infecção (MOI), de 10 e incubar durante uma noite a 37 ° C em 5% CO₂.
   Nota: A multiplicidade de infecção foi determinada pela expressão da proteína monomérica fluorescência analisada por uma célula de fluorescência-ativado classificação varredura (FACS).
4. No dia seguinte, remova o vírus por centrifugação das placas iPSC 6-poços em 300 x g durante 6 min à temperatura ambiente.
5. Mudar a mídia diariamente com meio de cultura enriquecido (ver Tabela de materiais) e passagem conforme protocolo. Utilize um microscópio de fluorescência para determinar a eficiência de transdução aproximada para eGFP.
6. Uma eficiência de 30 – 40% é suficiente para a classificação de FACS. Prossiga para o FACS de hiPSCs expressando eGFP, se pelo menos 30-40% das células express eGFP.
7. Para confirmar a FLuc atividade ex vivo, as células expressando GFP classificado por FACS com uma densidade de 5.000 células por poço da placa.
8. Incube as celulas transduzidas e não transfectadas células (que servirão como o controlo negativo) com o repórter de bioluminescência sonda D-luciferina (100 μmol/L) para 6 h. medir a bioluminescência com um spectrofluorometer de microplacas.

3. transplante de EPS no flanco Dorsal para formação de Teratoma em camundongos imunodeficientes

1. Adicione 1 mL da mistura de enzima recombinante célula-dissociação por 6 placa contendo iPSCs humana transfectadas com um gene repórter duplo-fusão (FLuc-GFP) na cultura (ver secção 2) e incube por 5 min.
2. Após o período de incubação, disperse as células por aspiração de pipeta e expressão. Adicione igual volume de meio de cultura e centrifugar a 250 x g durante 4 min.
3. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 30 µ l de matriz e colocá-lo em gelo para preservar sua viabilidade antes da injeção. Confirme uma colheita de 1 x 10⁶ células usando um hemocytometer.
4. Se utilizando células de fusão dupla repórter-gene-transfectadas, suspenda as células de FACS duplo-positivo (da seção 2) em 30 µ l de matriz.
5. Induzir anestesia na semana de 8-10 modelo camundongos usando 2% isoflurance com oxigênio de 1L/min e em seguida use manutenção 2% de isoflurano com 1L/min de oxigênio.
6. Utilizando uma seringa de 28,5 G, injetar a mistura de célula/matriz (veja a Tabela de materiais) suspensão no espaço subcutâneo no flanco, apontando para uma injeção de no total de 5 x 10³ a 5 x 10⁶ células (aproximadamente 100 ul por injecção).
7. Considere uma injecção mais caudal se tenciona manter ratos por período prolongado e antecipando o crescimento do tumor grande.
8. São permitidos animais anestesiados para recuperar em uma almofada aquecida até ambulatório (tipicamente < 1h) com acompanhamento da frequência respiratória, de pele cor de dedos até ambulatório.

4. a bioluminescência de imagem (BLI) das células transplantadas para avaliar a célula de sobrevivência e crescimento de Teratoma

1. Os desejado momentos após a inoculação, realize uma injeção intraperitoneal de (IP) de 375 mg/kg da sonda repórter D-luciferina em ratos.
2. 10 min após a injeção do IP, imagem a bioluminescência sinal nos animais anestesiados (interpretados como descrito no passo 3.5) por 30 min usando windows de aquisição 1 min em intervalos de 5 min.
   Nota: Aquisições de imagem semanal são recomendadas. Anestesia é mantida durante a imagem latente entregando inalado isoflurano através de um cone de nariz.
3. Para análise de dados, desenhar uma região de interesse (ROI) sobre o sinal BLI e, em seguida, normalizar para o tempo de aquisição para quantificar as emissões em unidades de máximos fótons por segundo por centímetro quadrado por esterradiano (/sr fótons/s/cm²).

5. teratoma irradiação usando uma difusora pré-clínicos guiada por imagem (Figura 1)

1. Anestesia um rato em uma caixa "knockdown" usando 2% de isoflurano em 100% de oxigênio em uma taxa de fluxo de 1 L/min. Depois que o mouse é totalmente anestesiado, transferi-lo para a cama de um irradiador de pré-clínicos guiada por imagem (consulte a Tabela de materiais). Manter a anestesia por 2% de isoflurano continuamente através de um cone de nariz.
2. Adquirir imagens de micro-CT como um conjunto de 400 imagens de projeção superior a 360° usando um 40 kVp, feixe de raio-x 2 mA e reconstruir aqueles em imagens volumétricas, com um tamanho de pixel isotrópico de 0,2 mm.
3. Planejar um tratamento de radiação usando as micro-CT imagens usando o pacote de software de RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) e realizar o tratamento.
   Nota: O plano de tratamento utilizado consiste de feixes de raios-x dois 225 kVp, orientados para passar o teratoma alvo superficial enquanto contornando a superfície do resto do rato e poupando as vísceras subjacentes. Os tempos de exposição para as vigas são ajustados com base em dados trimestrais de calibração do sistema para que a dose no centro do tumor alvo foi de 6 Gy.
4. Repita o processo de tratamento em três dias consecutivos para entregar um total de 18 Gy-o tumor do alvo.
5. Manter o padrão pós-tratamento, cuidar dos animais.

Resultados

Os ratos injetados normalmente irão demonstrar formação de crescimento teratoma após 4-8 semanas, como confirmado pela BLI de imagem (Figura 2). Tumores vão encolher drasticamente quando irradiados com uma dose acumulada de 18 Gy deu um mês após a entrega do celular, resultando em uma diminuição significativa no sinal do luciferase (Figura 2). Importante, retirados do site irradiado 5mm de tecidos normais não parecem te...

Discussão

Dados pré-clínicos e casos anedóticos de vítimas do "turismo de células-tronco" confirmam que o risco de desenvolver os teratomas é uma desvantagem grave associada com tratamentos de PSC²³. Desenvolvimento de abordagens de cuidado para prevenir e tratar o risco neoplásico associado com terapias de células-tronco é, portanto, um passo importante para facilitar a tradução clínica de terapias regenerativas célula-tronco. Neste artigo, nós descrito um método de direcionamento terapêuti...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation