Traitement ciblé et sélectif des tératomes de dérivé de cellules souches pluripotentes à l’aide de radiothérapie externe dans un modèle de petits animaux

Résumé

Recherche sur les stratégies de traitement pour les tératomes de dérivés de cellules souches pluripotentes est importante pour la traduction clinique de la thérapie de cellules souches. Nous décrivons ici un protocole visant, en premier lieu, générer des cellules souches dérivées de tératomes chez la souris et, ensuite, à cible sélectivement et traiter ces tumeurs in vivo à l’aide d’un irradiateur de petits animaux.

Résumé

Le nombre croissant de victimes du « tourisme de cellules souches, » le non réglementée transplantation de cellules souches dans le monde entier, a soulevé des préoccupations concernant la sécurité des cellules souches hématopoïétiques. Bien que la transplantation de différencie plutôt que des cellules indifférenciées est une pratique courante, les tératomes peuvent encore résulter de la présence de résidus des cellules souches indifférenciées au moment de la transplantation ou de mutations spontanées dans différenciés cellules. Parce que les cellules souches sont souvent envoyées dans des sites sensibles anatomiquement, même les petites tumeurs peuvent être cliniquement dévastatrices, aboutissant à la cécité, la paralysie, les anomalies cognitives et trouble cardiovasculaire. Accès aux soins chirurgicaux à ces sites peut également être limitée, laissant les patients avec peu d’options thérapeutiques. Contrôler les débordements de cellules souches est donc critique pour la traduction clinique de la thérapie de cellules souches.

Radiothérapie externe offre un moyen efficace d’offrir la thérapie ciblée d’alléger le fardeau de tératome tout en minimisant les blessures qui entoure les organes. En outre, cette méthode évite la manipulation génétique ou transduction virale des cellules souches, qui sont associées à la sécurité clinique supplémentaire et de l’efficacité. Nous décrivons ici un protocole pour créer des tératomes de dérivés de cellules souches pluripotentes chez la souris et d’appliquer la radiothérapie externe pour sélectivement l’ablation de ces tumeurs in vivo.

Introduction

Le développement de thérapies de cellules souches pour la régénération tissulaire a rencontré un certain nombre d’obstacles dans les dernières décennies, qui entravent les efforts de déploiement clinique efficace. Ces obstacles comprennent rétention cellulaire pauvre sur les sites de livraison, cellules souches immunogénicité et néoplasiques susceptibles de tératomes de formule¹. Tumorigénicité est particulièrement préoccupante clinique car il peut potentiellement nuire à stem cell transplantation destinataires². Comptes de la formation de tumeurs en raison des injections non réglementée des cellules souches ont déjà été signalés dans plusieurs contextes cliniques^3,4,5. Le risque de formation de tératome est le plus fréquemment cité préoccupation clinique dans le développement de cellules souches (CFP) pluripotentes et a entraîné des retards et des annulations de plusieurs prestigieux les cellules souches embryonnaires (CSE) et induite par les cellules souches pluripotentes (iPSC) les essais^6,7,8,9. Ainsi, il y a un besoin pressant pour une enquête translationnelle dédiée à offrir un traitement approprié, ces tumeurs iatrogènes surviendrait.

A ce jour, plus des stratégies pour contrôler les débordements de cellules souches ont mis l’accent sur la réduction du nombre des cotes de sécurité avec tumorigènes potentiel^2,10. Malheureusement, seul un petit nombre de cellules résiduelles (par exemple., 1 x 10⁴ à 1 x 10⁵ cellules¹¹) est requis pour la formation de tératome, qui est bien en dessous du seuil de détection citée par les tests actuellement^{12, 13}. autres restrictions de l’utilisation de ces méthodes de précollecte incluent faible efficacité et les frais élevés, le recours aux suspensions unicellulaires qui peuvent ne pas convenir pour nouvelles approches d’ingénierie tissulaire et l’altération potentielle de cellules survie et la prise de greffe.

Peu d’études ont abordé les options de traitement après formation de tératome. Peut-être la stratégie plus étudiée est l’incorporation de gènes « suicide » des cellules souches^14,15. Cette méthode implique de manipuler génétiquement les cellules souches pour incorporer un gène inductible de-activation de l’apoptose pouvant être activés par post-injection de stimulation pharmacologique, offrant ainsi une approche de sauvetage si produisent des cellules injectées tératomes. Cette approche, a cependant, souffre d’importants inconvénients, y compris les effets des modifications génétiques du PSC et la possibilité d’un développement progressif de la résistance de drogue¹⁶hors cible. Une approche similaire utilise de petites molécules pour induire la mort cellulaire sélective des cotes de sécurité via l’inhibition de l’anti-apoptotique voies¹⁷. Autres groupes ont ciblé la mort cellulaire de PSC en utilisant des anticorps contre la pluripotence marqueurs de surface, tels que podocalyxin-like protein-1 (PODXL)¹⁸. Le moment de la livraison de petites molécules ou d’anticorps est d’avoir un impact significatif sur le potentiel thérapeutique des cotes de sécurité si livrés trop tôt et ne sont pas toujours l’efficacité thérapeutique si livré trop tard. En outre, les effets systémiques des petites molécules et des anticorps utilisés de cette manière n’ont pas été étudiées.

Une autre approche pour traiter ces tumeurs repose sur l’utilisation de radiothérapie externe (radiothérapie externe). Radiothérapie externe est l’une des modalités principales actuellement employées dans le traitement des tumeurs solides¹⁹. Innovations en radiothérapie externe, y compris l’élaboration du faisceau de protons et radiochirurgie stéréotaxique, ont permis le ciblage amélioré des structures pathologiques tout en évitant des dommages aux tissus normaux, rendant la radiothérapie externe conformationnelle idéal pour aborder le tératome formation dans les structures anatomiques sensibles²⁰. En outre, cette méthode évite la manipulation génétique ou la transduction virale des cellules souches, qui sont à la fois lourde de sécurité clinique supplémentaires et l’efficacité porte sur¹⁵. Enfin, les progrès en micro-Irradiateurs ont permis l’application de la radiothérapie externe en rongeurs²¹.

Dans cet article, nous montrons comment créer un modèle de petits animaux de tératome formation en injectant CISP humaine chez la souris. Ensuite, nous montrons comment appliquer la radiothérapie externe pour éliminer sélectivement ces tumeurs in vivo avec un minimum de dommages aux tissus avoisinants. Cette approche fournit une thérapie ciblée pour dérivés CFP tératomes tout en évitant les effets hors-cible de la délivrance systémique des molécules biologiques et de peptides et de la manipulation génétique de la PSC. À des fins expérimentales, nous offrons une étape facultative pour transmettre des cellules de gènes rapporteurs pour suivre la réponse tumorale à la radiothérapie par bioluminescence imaging (BLI).

Protocole

Cette expérimentation animale a été approuvée et réalisée sous l’Institutional Review Board et le Comité administratif de protection des animaux de laboratoire à l’Université Stanford.

1. cellules Culture de CISP

1. Croissance humaine CISP dérivé de reprogrammation des gènes sur plaques 6 puits recouverts de matrice de la membrane basale (p. ex., matrigel, appelé matrice sur le connaissement).
2. Changer tous les jours les médias de la CISP avec milieu de culture enrichi (voir Table des matières) en incubation à 37 ° C et 5 % de CO₂.
3. Une fois les cellules atteignent la confluence de 80 à 90 % (environ tous les 4 jours), ajouter 1 mL d’enzyme recombinante-dissociation cellulaire (voir Table des matières) par puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
4. Après 5 min, dissocier les cellules du puits en pipettant également, transférez-les sur un tube de 15 mL et centrifuger à 300 g.
5. Après la centrifugation, aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans le milieu de culture enrichi (voir Table des matières) enrichie d’un inhibiteur de la Y27632 à une dilution de 1 : 1 000.
6. Effectuer un nombre de cellules des cellules dissociées et replate les cellules de la matrice-enduit de plaques 6 puits à une densité de 2 x 10,⁵ , 4 x 10,⁵.

2. transduction du CISP avec un gène rapporteur de Double-fusion

1. CISP en plaques 6 puits selon la routine de passage et ajouter le milieu de culture enrichi le bromure (voir Table des matières) hexadimethrine contenant 6 µg/mL.
   Remarque : La taille de la colonie idéale est de 200 – 400 cellules/colonie pour donner la plus grande efficacité de transduction.
2. Concentrer l’inactivation lentivirus transportant firefly luciférase et vert fluorescente protéine (FLuc-eGFP) conduite par l’ubiquitine humaine promotor-C par centrifugation de sédiments avec un rotor SW-29 à 50 000 x g pendant 2 h à 4 ° C.
3. Ajouter le concentré de viral de la CISP dans une plaque 6 puits à une multiplicité d’infection (MOI) de 10 et incuber une nuit à 37 ° C à 5 % de CO₂.
   Remarque : La multiplicité d’infection a été déterminée par l’expression de protéine monomérique fluorescence analysé par une cellule activée par fluorescence tri scan (FACS).
4. Le lendemain, enlever le virus par centrifugation des plaques 6 puits iPSC à 300 x g pendant 6 min à température ambiante.
5. Modifier les médias tous les jours en milieu de culture enrichi (voir Table des matières) et passage conformément au protocole. Utiliser un microscope à fluorescence pour déterminer l’efficacité de la transduction approximative pour eGFP.
6. Une efficacité de 30 à 40 % est suffisante pour le tri des FACS. Passez à la FACS de hiPSCs exprimant eGFP si au moins 30 à 40 % des cellules expriment eGFP.
7. Pour confirmer l’activité FLuc ex vivo, plaque les cellules exprimant GFP triée par FACS à une densité de 5 000 cellules par puits.
8. Incuber les cellules transduits et non-transduites cellules (qui serviront de témoin négatif) avec le reporter de bioluminescence sonde D-luciférine (100 µmol/L) pendant 6 h. mesurer la bioluminescence avec un spectrofluorimètre microplaques.

3. transplantation de PSC dans le flanc Dorsal pour la Formation de tératome dans des souris immunodéficientes

1. Ajouter 1 mL de mélange enzyme recombinante-dissociation cellulaire par plaque 6 puits contenant humain CISP transduites avec un gène de fusion double rapporteur (FLuc-GFP) dans la culture (voir chapitre 2) et incuber pendant 5 min.
2. Après la période d’incubation, disperser les cellules par aspiration pipette et d’expression. Ajouter un volume égal de milieu de culture et puis centrifuger à 250 g pendant 4 min.
3. Après centrifugation, aspirer le surnageant, resuspendre le culot dans 30 µL de matrice et placez-le sur la glace afin de préserver sa viabilité avant l’injection. Confirmer une récolte de 1 x 10⁶ cellules utilisant un hémocytomètre.
4. Si utilisant les cellules transfectées journaliste-gène double-fusion, suspendre les cellules de FACS double-positifs (à partir de la section 2) dans 30 µL de matrice.
5. Induire l’anesthésie chez la souris nude de 8 à 10 semaine athymiques avec 1L/min d’oxygène à l’aide de 2 % isoflurance, puis utilisez entretien 2 % isoflurane avec 1L/min d’oxygène.
6. À l’aide d’une seringue de 28,5 G, injecter le mélange de cellule/matrice suspension (voir Table des matières) dans l’espace sous-cutané sur le flanc, visant pour une injection d’au total 5 x 10³ à 5 x 10⁶ cellules (environ 100 ul par injection).
7. Considérons un site d’injection plus caudal si l’intention de maintenir des souris pour période prolongée et d’anticiper la croissance tumorale importante.
8. Animaux anesthésiés est autorisés à récupérer sur une dalle chauffée jusqu’en ambulatoire (typiquement < 1h) avec surveillance de la fréquence respiratoire, la peau couleur des orteils jusqu’au déambulatoire.

4. bioluminescence Imaging (BLI) des cellules transplantées pour évaluer la survie cellulaire et la croissance de tératome

1. Les intervalles désirée après l’inoculation, exécuter une injection intrapéritonéale de (IP) de 375 mg/kg de la sonde de journaliste D-luciférine dans les souris.
2. 10 min après l’injection de la propriété intellectuelle, image la bioluminescence de signaux chez les animaux anesthésiés (interprétées comme décrit dans étape 3.5) pendant 30 min à l’aide de fenêtres d’acquisition de 1 min à 5 min d’intervalle.
   Remarque : Acquisitions d’images hebdomadaires sont recommandées. Anesthésie est maintenue au cours de l’imagerie en livrant inhalation isoflurane via un cône de nez.
3. Pour l’analyse des données, tracez une zone d’intérêt (ROI) sur le signal BLI et, ensuite, normaliser pour le temps d’acquisition quantifier les émissions de photons maximales par seconde et par centimètre carré par stéradian (photons/s/cm²/sr) en.

5. tératome Irradiation à l’aide d’un irradiateur préclinique de guidée par l’Image (Figure 1)

1. Anesthésier une souris dans une boîte défiant l’isoflurane de 2 % à 100 % d’oxygène à un débit de 1 L/min. Après la souris est complètement anesthésiée, transférez-le vers le lit d’un irradiateur préclinique guidée par l’image (voir la Table des matières). Maintenir l’anesthésie par 2 % isoflurane en continu via un cône de nez.
2. Acquisition d’images de micro-CT comme un ensemble de 400 images de projection sur 360° à l’aide d’un 40 kVp, faisceau de rayons x 2 mA et reconstruire les images volumétriques avec une taille de pixel isotrope de 0,2 mm.
3. Planifier une radiothérapie utilisant les images de micro-CT à l’aide du progiciel RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) et effectuer le traitement.
   Remarque : Le plan de traitement utilisé est composé de faisceaux de rayons x de deux 225 kVp, orientés pour passer le tératome superficielle cible tout en longeant la surface du reste de la souris et en épargnant les viscères sous-jacents. Les temps d’exposition pour les poutres sont ajustées en fonction sur chaque trimestre les données de calibration système afin que la dose au centre de la tumeur cible était de 6 Gy.
4. Répétez le processus de traitement sur trois jours consécutifs pour livrer un total de 18 Gy la tumeur cible.
5. Maintenir le post-traitement standard prise en charge des animaux.

Résultats

Les souris injectées généralement démontrera formation croissance tératome après 4 à 8 semaines tel que confirmé par BLI imaging (Figure 2). Les tumeurs seront rétrécira considérablement lors de l’irradiation avec une dose cumulée de 18 Gy administré un mois après l’accouchement de la cellule, ce qui entraîne une diminution significative de signal luciférase (Figure 2). Ce qui est important, les tissus normaux...

Discussion

Des données précliniques et des cas anecdotiques de victimes du « tourisme de cellules souches » confirment que le risque de développer des tératomes est un sérieux inconvénient associé à CFP traitements²³. Développement d’approches prudents pour prévenir et traiter le risque néoplasique associé à des thérapies de cellules souches est donc une étape importante pour faciliter la traduction clinique des thérapies de régénération des cellules souches. Dans cet article, nous a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation