في الوقت الحقيقي في فيفو تتبع الثيموسيه في الغرفة الأمامية للعين بالليزر الفحص المجهري

Summary

وهدف البروتوكول لإظهار تتبع في الوقت الحقيقي إينترافيتال طولية من الثيموسيه بالليزر الفحص المجهري في الغدة الصعترية يزرع في الغرفة الأمامية للعين الماوس. شفافية القرنية والأوعية الدموية للفساد يسمح باستمرار تسجيل السلف خلية التجنيد وخروج تي خلية ناضجة.

Abstract

وغرض الأسلوب الذي تعرض لإظهار زرع ثيمي حديثي الولادة إلى غرفة العين الأمامي من الفئران الكبار اسوي في فيفو طولية في الوقت الحقيقي رصد لديناميات thymocytes´ داخل فاسكولاريزيد، للمرة الأولى، الجزء المتعلق بالغدة الصعترية. وبعد زرع الأعضاء، يسمح الليزر الفحص المجهري (LSM) من خلال القرنية في فيفو موسع التصوير المتكرر على المستوى الخلوي القرار. الأهم من ذلك، يضيف النهج السابق نضج تي خلية إينترافيتال التصوير نماذج إمكانية تجنيد خلية السلف المستمرة وتسجيلات متدفقة تي خلية ناضجة في الحيوان نفسه. مزايا إضافية للنظام شفافية مجال المطعمة، يتيح الرصد السريع العيانية مزروع الأنسجة، وإمكانية الوصول إلى زرع السماح للمترجمة بالإضافة إلى العلاجات الجهازية. القيد الرئيسي يجري حجم الأنسجة التي تناسبها في الفضاء انخفاض الدائرة العين التي تطالب للتشذيب فلقة. سلامة الجهاز مكبراً بتشريح الفصوص الغدة الصعترية في أنماط المبين سابقا يكون جاهزاً للإنتاج تي خلية ناضجة. هذا الأسلوب يحتمل أن تكون مناسبة لاستجواب بيئة ذات الصلة طبيا المسائل المتصلة بوظيفة الغدة الصعترية التي تشمل المناعة الذاتية، ونقص المناعة المكتسب، والتسامح المركزية؛ العمليات التي تظل ميتشانيستيكالي غير المحددة بوضوح. تشريح غرامة آليات توجيه الهجرة ثيموسيتي، والتمايز والتحديد ينبغي أن يؤدي إلى استراتيجيات علاجية رواية استهداف خلايا تي النامية.

Introduction

إينتراثيميك تي خلية المفاضلة والانتقاء يتدنى تي خلية تشكل العمليات الرئيسية لتطوير وصيانة الخلية بوساطة الحصانة في الفقاريات¹. تنطوي هذه العملية على تسلسل معقد من أحكام تنظيم الأحداث بما في ذلك تعيين موروث من مجرى الدم، وتكاثر الخلايا، والهجرة، والتعبير التفاضلية من بروتينات الغشاء، وموت الخلايا المبرمج واسعة النطاق لمجموعات فرعية التحديد. النتيجة هو الإفراج عن ناضجة خلايا تي رد الفعل طائفة وافرة من المستضدات الخارجية أثناء عرض استجابات مصغر للنفس-الببتيدات، هي في نهاية المطاف استعمار الأجهزة الطرفية اللمفاوية الفردية^2،3. اختيار ثيموسيتي الشاذة مرجع αβTCR يؤدي إلى أمراض المناعة الذاتية أو الاختلال المناعي⁴ التي تنشأ أساسا من العيوب خلال عمليات التحديد السلائف سلبية أو إيجابية، على التوالي.

اتجاهات هجرة الثيموسيه عبر الغدة الصعترية الجوهرية في جميع مراحل النضج تي خلية ويتوخى كسلسلة متزامنة أو متتابعة المحفزات متعددة، بما في ذلك المستقطبات، لاصقة، ولاصق إزالة الألغام المصفوفة خارج الخلية (ECM) بروتين تفاعلات^3،5. دراسة الأنسجة الثابتة قدمت معلومات هامة فيما يتعلق بأنماط التعبير بالنسبة للرموز ثيموسيتي المهاجرة في ميكرونفيرونمينتس الغدة الصعترية المعرفة^5،6، بينما كشفت دراسات السابقين فيفو اثنين انتشارا السلوكيات المهاجرة من الثيموسيه في مجالين الأشيع متميزة للجهاز: بطء الحركات العشوائية في القشرة وحركية سريعة، محصورة في لب^7،،من^{89،10 , 11 , 12 , 13}-زيادة معدلات الهجرة ترتبط بالتحديد الإيجابي الغدة الصعترية¹³ والانتقاء السلبي ويرتبط مع سلوك الزحف دعم الفرضية القائلة بأن حركية الرحلة عن طريق الغدة الصعترية يحدد السليم نضوج الثيموسيه. على الرغم من أهميتها، لا تزال طبولوجيا تفاعلات الخلية ثيموسيتي stromal وديناميات حركية ثيموسيتي عبر ميكرونفيرونمينتس الجهاز أثناء نضج تي خلية غير محددة.

معظم السابقين فيفو دراسات أجريت حتى الآن تشمل الجنين أو ريجريجاتي الجهاز الغدة الصعترية الثقافات^14،15، شرائح الأنسجة أو explants الفص الغدة الصعترية سليمة حيث يتم تصور حركات ثيموسيتي قبل يومين-فوتون ليزر المسح الفحص المجهري (تبلسم)⁸، درست أسلوب تصوير إينترافيتال مع حد أقصى مقيدة تعمل عن بعد والتصوير عمق 1 مم وفقا للأنسجة¹⁶. على النقيض من ثقافات الجهاز الغدة الصعترية الشاقة التي تعتمد على أوقات الاحتضان الموسعة لنموذج 3D-الهياكل، على حد سواء، تقنية شريحة الغدة الصعترية ونهج سليمة فص الغدة الصعترية إدخال تصريح الخاضعة لسيطرة مجموعات فرعية معينة من قبل المسمى الثيموسيه إلى بيئة هندسة أنسجة أصلية. ومع ذلك، نظراً لتدفق الدم غائبة في هذه النماذج، فمحدودة ومن الواضح لدراسة عملية التوظيف للغدة الصعترية تسوية موروث (TSPs) حمة الغدة الصعترية أو ديناميات اجريسيون الغدة الصعترية من الخلايا التائية الناضجة.

وتشمل في فيفو نماذج لدراسة فسيولوجيا نضوج تي خلية الغدة الصعترية في الفئران الطعوم من الشظايا أو الفصوص الجهاز كامل وضعها أما داخل كبسولة الكلي¹⁷ أو¹⁸إينتراديرمالي. على الرغم من أن هذه الخيارات قد أظهرت فائدتها استجواب engraftment الوظيفية النظامية للأنسجة، موقف الطعوم الغدة الصعترية العميق داخل الحيوان أو مغطاة بطبقات من الأنسجة المعتمة يقيد استعمالها للفحص في فيفو يزرع بها تبلسم.

الغرفة الأمامية للعين يوفر مساحة يمكن الوصول بسهولة للرصد المباشر لأي الأنسجة المطعمة بحكم شفافية طبقات القرنية. ميزة، قاعدة الدائرة التي شكلتها قزحية العين الغنية بالأوعية الدموية ونهايات الأعصاب اللاإرادي، تمكين عودة التوعي السريع ورينيرفيشن ل ترقيع^19،20. الدكتور كايسيدو قد استخدمت بنجاح هذه المساحة التشريحية للصيانة ودراسة طولية من جزيرات البنكرياس في الماضي²¹. هنا، نحن تبين أن هذه الاستراتيجية لا يشكل نهجاً سليما لدراسة ديناميات نمو داخل هيكل الجهاز الأصلي، ولكن أيضا شكل فريد يسمح تمديد في فيفو تسجيلات طولية لدراسة التوظيف السلف و الخطوات اجريسيون تي خلية ناضجة في الماوس.

Protocol

رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميامي وافق جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية إياكوك.

1-العزلة والتشذيب لحديثي الولادة تيمي

1. تحضير جميع المواد الكاشفة والصكوك بالتعقيم أو بطرق أخرى، ضمان ظروف معقمة.
2. للتقليل من التلوث، إجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء الاندفاق الصفحي.
3. قبل يوثانيزينج المانحة الفئران، ملء طبق عقيمة 60 ملم مع العقيمة 1 بريشيليد x مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) ووضعه على الجليد. أنها ستستخدم الشطف وتخزين ثيمي قصت من الفئران المانحة قبل زرع الأعضاء.
4. انتقل إلى euthanize الفئران حديثي الولادة المانحين بقطع الرأس، وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية.
5. ضع الماوس على مناشف ورقية ماصة معقمة في وضع مستقيم الظهرية والرذاذ، ومسح في وقت لاحق، البطن الماوس مع الإيثانول 70%.
6. كشف التجويف الصدري عن طريق إجراء شق على شكل V سطحية على مستوى أسفل البطن وقطع الجلد مع زوج من 10 سم على التوالي تشريح المقص أثر خط الوسط البطني لترك فتح حوالي 0.5-1 سم على مستوى الصدر. أمثال الجلد على كل جانب من الصدر لفضح تجويف الصدر.
7. جعل اثنين أعمق من 0.5-1 سم شقوق جانبية من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري مع نفس النوع من المقص الوصول إلى منصف متفوقة في تجويف الصدر الأمامي. يجب أن تظهر الغدة الصعترية الفصوص بالي اثنين الحق فوق القلب.
8. وضع مجموعة من الملقط منحنية تحت الغدة الصعترية وسحب عمودياً لاستخراج الجهاز كاملة. منع foldback من القفص الصدري مع زوج من الملقط. إذا لزم الأمر، استخدم الملقط غرامة لعناية تمزق النسيج الضام المحيطة الجهاز دون تعطيل الكبسولة قبل استخراج الجهاز.
   ملاحظة: هذه الخطوة يسهل استخدام نطاق تشريح.
9. غمر الغدة الصعترية معزولة في PBS الباردة العقيمة x 1 (الرقم الهيدروجيني 7.4) سابقا عرض في صحن معقم 60 ملم، وقطع البرزخ الضام مع مشرط لفصل الفصوص الغدة الصعترية. إزالة أي حطام من الطبق دون الأضرار بالكبسولة. لتقليل الوقت ويتعرض تيمي، تقليم الفصوص الزعتر الحق قبل عملية الزرع.
   ملاحظة: كل الغدة الصعترية الوليد معزولة عادة ستؤدي إلى ستة قطاعات من حوالي 1 مم بحد أقصى ثلاثة المضيف الفئران عند تلقي يزرع في كلتا العينين.
10. كرر الخطوات من 1.4-1.9 لكل المانحين الماوس. لتقليل الوقت ويتعرض تيمي، عزل الغدة الصعترية واحد في وقت واحد.

2-الغدة الصعترية غرس في الغرفة الأمامية للعين

1. قبل زرع الأعضاء، العلامة وتزن كل الماوس المتلقية.
2. استخدام جرعة بين 1-2% الأبخرة إيسوفلوراني تخدير الماوس المتلقية. ضمان أنيسثيتيزيشن السليم بسبب غياب منعكس قرصه تو التالية قبل بدء العملية الجراحية.
3. المضي قدما في زرع أجزاء الغدة الصعترية كما يلي:
   1. ضع الماوس في جانب أفقي راقد وضع حيث أن العين واحد هو مواجهة يتعرض مباشرة لعدسة نطاق تشريح.
   2. المكوس أحد الفصوص الغدة الصعترية معزولة الكذب في برنامج تلفزيوني الباردة x 1 (الرقم الهيدروجيني 7.4)-مليئة تصل إلى 1 مم عرض لزرع طبق 60 مم إلى قطع. اتباع نمط التعرج لضمان أن كل قطعة تحتوي على قشرة الغدة الصعترية ولب. استخدام مقص فاناس لاقتطاع وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في الرقم 1 أ.
      ملاحظة: ينبغي أن يتم اقتطاع من الغدة الصعترية الحق قبل عملية الزرع لتحسين انجرافتمينت الأنسجة.
   3. بدءاً من قاعدة القرنية المقابلة لمنطقة العمليات الجراحية، يعرض تلميح إبرة 40 مم G18 لإجراء شق صغير في طبقات القرنية الخارجية بحيث يمكن إدخال تلميح مقص تشريح.
   4. تجعل من 5-10 ملم الجناح شق مباشرة حول القاعدة القرنية استخدام مقص vannas أثناء إجراء فتح القرنية بحزم لمنع إعادة ختم. استخدام الملقط مع نهايات المسطح لتجنب تلف الأنسجة.
   5. فهم ظهارة القرنية قطع وفضح فتح بعقد القرنية مع زوج من الملقط انتهت مسطحة بينما يدفع قطعة الغدة الصعترية من خلال فتح. الرطب العين مع العقيمة 1 x برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4) أو الدموع الصناعية حسب الحاجة لمنع جفاف الأنسجة حتى يتم التلاعب بالكامل.
   6. اضغط بهدوء على سطح العين الشريحة الجزء الأنسجة أدخلت إلى موضع أفقي فيما يتعلق بالتلميذ للحفاظ على وظيفة eye´s. تأكد من أن تقع الاختلاس في مكان مقابل العين الافتتاحية لمنع التدخل اللاحق مع التصوير بالعقاب الشديد.
   7. مع معونة الملقط مسطحة، اضغط بحزم، لحوالي 3-5 ق، بين الجانبين لفتح القرنية ضد بعضها البعض لتشجيع الختم الذاتي. لا تتطلب عملية جراحية أي التدبيس أو الخياطة.
4. إذا كان يتم تنفيذ الزرع على كلتا العينين، اقلب الماوس الجانب الأفقي المقابل فضح العين الثانية إلى عدسة مجهر تشريح مباشرة وكرر الخطوات 2.3.2-2.3.7.
5. بعد اكتمال عملية جراحية، العودة الماوس إلى قفص فارغ بريوارميد مع مصباح حرارة.
6. تأكد من أن يستعيد كل الماوس زرع التنقل الكاملة ووعيه قبل وضعه في قفص مشتركة مع غيرها من الحيوانات. وهذا يجري عادة ضمن ح 1 بعد الجراحة.
7. عند زرع الأعضاء، علاج الفئران مع مسكنات الألم عند الحاجة، وتوفير الفئران مع أسيتامينوفين في تركيز من 1.6 ملغ/مل في مياه الشرب.
8. كرر الخطوات من 2، 2-2.9 لكل مستلم الماوس.
9. مراقبة نشاط الحيوان بعد العمليات الجراحية، فضلا عن مظهر العيون مزروع للكشف عن المضاعفات الصحية المحتملة.

3-[كنفوكل] تصوير "تيمي مزروع" استخدام 3D "وحيدة فوتون Fluorescence [كنفوكل] مجهرية"

1. تخدير الماوس المستلم باستخدام جرعة بين 1-2% الأبخرة إيسوفلوراني. ضمان أنيسثيتيزيشن السليم بسبب غياب منعكس قرصه تو التالية قبل البدء في عملية التصوير
2. ضع الماوس على منصة مجهر مرحلة ثابتة القادرة على جانب أفقي راقد حتى هو مواجهة ذلك عين واحدة. لوحة حرارة يوضع على منصة المجهر لضمان درجة حرارة الجسم ثابتة من الفئران خلال التسجيلات.
   ملاحظة: انظر التكميلية الرقم 1 لمزيد من التفاصيل.
3. إدراج رأس الماوس هيدهولدير ستيريوتاكسيك وضبط مقبض لكبح جماح رأس الماوس على موقف جانب أفقي السماح بالوصول المباشر الهدف مجهر العين عقد الاختلاس الغدة الصعترية.
4. مكان الآنف الماوس إلى قناع غاز للحفاظ على الحيوان تخديره طوال الإجراءات. يسمح هذا تعديل الأبخرة إيسوفلوراني حسب الحاجة.
5. لتسهيل تحقيق الاستقرار في العين خلال التسجيلات مع تجنب سحب الجفون، سحب الجفون حين عقد العين في الهامش القرنية مع زوج من ملاقط التي تحتوي على نصائح مشمولة بأنبوب البوليثين الذي يتم إرفاقه أوست-2 الصلبة المشترك العالمي. هذا الترتيب يسمح تثبيت مطرد للرأس والعين، ويوفر المرونة دون انقطاع تدفق الدم في العين، كما هو موضح سابقا²².
   ملاحظة: تظهر الأرقام التكميلية 1B، ج الجمعية كاملة.
6. إضافة بضع قطرات من الدموع المالحة أو اصطناعية العقيمة كالسائل الغمر بين القرنية والعدسة، قبل وضع الهدف المجهر على العين الماوس.
   ملاحظة: يتم الاستغناء عن قطرات إضافية على الحاجة طوال فترة الإجراءات الحفاظ على مسار مجهر ومنع جفاف العين.
7. أولاً استخدام عدسة التكبير المنخفض (5 X) لتحديد موقع الغدة الصعترية في ميدان المجهر. قم بالتبديل إلى القرار (10 و 20 و 40 س) أعلى الماء الغمر غمس الأهداف مع المسافة العمل منذ فترة طويلة. تجنب د LSM وتبيض من زرع الغدة الصعترية بتطبيق قوة الليزر الحد الأدنى وتقليل وقت المسح، قدر الإمكان. ويتحقق ذلك باستخدام الماسح الضوئي مدوية من المجهر.
   ملاحظة: المجهر [كنفوكل] نستخدم مجهزة بمرايا المسح الرنانة القادرة على جمع الصور في 25 إطارات/ثانية. العلامات التجارية الأخرى قد المجاهر الخاصة بهم مع الماسحات الضوئية الرنانة.
8. حدد وضع الحصول على استخدام البرمجيات مجهر وبدء وضع الماسح الضوئي رنانة. ثم اختر طريقة التصوير إكسيزت وتكوين إعدادات الحصول على النحو التالي:
   1. تشغيل ليزر الأرجون وضبط السلطة إلى 30% للإثارة الأسفار.
   2. اختر خط ليزر إثارة وتعيين عنصر التحكم أكوستو الضوئية شعاع الخائن (أوبس) لأطوال موجية مختلفة للانبعاثات. وبالإضافة إلى ذلك، للكشف عن تشتت ارتدادي وتحدد بنية الأنسجة، استخدام الكشف عن التفكير في أن واحد.
      ملاحظة: عند اختيار مجموعة من الألوان للإثارة (التجارة والنقل وطلب تقديم العروض)، أوبس تلقائياً مبرمجة لتوجيه هذه الخطوط الإثارة على العينة ويحيل انبعاث بينهما. على سبيل المثال، للتجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ونحن استخدام نطاقات ضيقة التفكير للإثارة الخفيفة حوالي 488 نانومتر و 561 نيوتن متر، على التوالي. وهذا يترك النطاقات الواسعة لجمع الفوتونات المنبعثة من الأسفار، مما يقلل من الحاجة لليزر السلطة واكتساب الوقت. في طريقة التفكير، أوبس كتقسيم المتساوي شعاع لصورة الضوء المنعكس في الطول الموجي أي بعيداً عن تلك المستخدمة للكشف عن انبعاث الأسفار.
   3. جمع الانبعاثات في الطول الموجي المحدد، ثم حدد قرار 512 × 512 بكسل وبدء يعيش التصوير بالضغط على زر حية ، ضبط مستويات الربح حسب الحاجة (كسب نموذجي هو حوالي 600 V).
   4. تحديد بداية ونهاية z-المكدس بالتركيز على رأس زرع الغدة الصعترية وحدد البدء، ثم الانتقال إلى آخر الطائرة التي يمكن أن تركز في الغدة الصعترية مزروع وحدد نهاية. استخدام حجم z-خطوة 5 ميكرومتر. سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب عدد الطائرات [كنفوكل].
   5. اختر الفاصل الزمني للحصول على كل كومة z (عادة 1.5 إلى 2 ثانية) وحدد خيار الحصول على حين توقف للتصوير المستمر.
9. اضغط على زر بدء التهيئة.
10. صورة ترقيع مرارا وتكرارا في أوقات مختلفة من الحيوان نفسه بتكرار الخطوات من 3، 1-3، 9.
    ملاحظة: إذا كان هذا الحيوان يحمل الطعوم في كلتا العينين، يمكن اتخاذها التسجيلات من العين أما بتكرار الخطوات من 3، 2-3.9 بعد التحول إلى جانب وضع مستقيم الرأس الماوس.

النتائج

الغدة الصعترية من الفئران حديثي الولادة كانت معزولة من B6. الفريق الاستشاري--Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/جاس الفئران كما هو موضح في هذا البروتوكول (خطوات 1.1-1.9). في هذه الفئران المعدلة وراثيا، يوجه المروج أكتين بيتا دجاج التعبير عن المتغير البروتين الفلورسنت الأحمر دسريد. MST تحت تأثي?...

Discussion

نظراً لأهمية عملية نضج تي خلية للكفاءات الفردية المناعي⁴ وأثر المفترضة لديناميات السلائف الخلية في الخلايا التائية الناضجة التي تنتجها الغدة الصعترية^2،3، وقد استثمرت جهودا مكثفة تطوير بدائل للنهج اللقطة الأنسجة الثابتة الكلاسيكية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA