레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

요약

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

초록

제시 되는 방법의 목적은 쇼, 처음으로, vivo에서 경도 실시간 모니터링를 vascularized 내에서 thymocytes´ 역학의 isogenic 성인 쥐의 앞쪽 눈 챔버로 신생아 thymi의 이식 thymus 세그먼트입니다. 이식, 다음 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 각 막 통해 비보에 비 침 투 적인 반복된 이미징을 셀룰러 해상도 수준에서 수 있습니다. 중요 한 것은, 접근에 추가 이전 intravital T 세포 성숙 모델 이미징 연속 조상 세포 모집 및 성숙한 T 세포 출구 녹음에 대 한 가능성 같은 동물에서 합니다. 시스템의 추가 장점은 이식 조직의 거시적인 신속한 모니터링 허용 이식할 영역의 투명도 그리고 조직의 치료 뿐만 아니라 지역화 된 임 플 란 트에 대 한 허용에 대 한 접근. 주요 제한 되 고 조직의 볼륨을 엽 트리밍에 대 한 요구는 눈 챔버의 감소 된 공간에 맞는. 기관 무결성 패턴 이전 성숙한 T 세포 생산에 대 한 기능 표시 thymus 돌출부를 해 부하 여 최대화 됩니다. 기술은은 잠재적으로 환경 의학 관련 질문 thymus 함수에 관련 된 면역, 면역 결핍, 중앙 허용;의 적합 하다 프로세스 mechanistically 가난 하 게 정의 된 남아 있는입니다. 지도 thymocyte 마이그레이션, 차별화 및 선택 메커니즘의 미세 해 부 소설 치료 전략 개발 T 세포를 대상으로 지도 해야 한다.

서문

Intrathymic T-세포 분화 및 T 세포 부분 모집단 선택 개발 및 척추 동물¹셀 중재 면역의 유지 보수에 대 한 핵심 프로세스를 구성합니다. 이 과정에서 혈액, 세포 증식 및 마이그레이션 창시자의 채용, 막 단백질, 그리고 하위 집합에 대 한 대규모 프로그램 된 세포 죽음의 차동 식 등 긴밀 하 게 조직 된 이벤트의 복잡 한 순서를 포함 선택입니다. 결과 T-세포로 성숙 외국 항 원의 넓은 스펙트럼에 반응의 출시 자체-펩 티 드, 최소화 된 응답을 표시 하는 동안 주변 림프 기관 개별^2,3의 식민지는 끝낼. ΑβTCR 레 퍼 토리의 탈 선 thymocyte 선택 자가 면역 질환 또는 면역 불균형⁴ 주로에서 파생 되는 결함의 음수 또는 양수 전조 선택 프로세스 동안 각각 이끌어 낸다.

Thymus 걸쳐 thymocytes의 방향 이동 T 세포 성숙의 모든 단계에 본질적인 것 이며 그것은 일련의 동시 또는 순차적으로 발산, 접착제를 포함 하 여 여러 자극을 상상 하 고 드 접착제 세포 외 기질 (ECM) 단백질 상호 작용^3,5. 고정 조직의 연구는 렌더링 정의 thymic microenvironments^5,6, thymocyte 철새 단서에 대 한 표현의 패턴에 관한 중요 한 정보 ex vivo 연구 두 계시는 동안 널리 장기의 2 개의 조직학 명백한 지역에서 thymocytes의 철새 행동: 느린 피 질에서 확률적 움직임과 빠른, 한정 된 운동 성 정도^{7,8,,910 , 11 , 12 , 13}. thymic 긍정적인 선택¹³ 연관 증가 철새 요금 및 부정적인 선택 가설 thymus 통해 여행의 활동 적절 한 결정을 지 원하는 크롤링 동작와 연결 된 thymocytes 성숙 그들의 관련성에도 불구 하 고 thymocyte stromal 세포 상호 작용의 토폴로지 및 기관 microenvironments T 세포 성숙 동안에 걸쳐 thymocyte 운동 역학 병이 정의 유지.

대부분의 비보 전 날짜를 수행 연구 태아 포함 또는 thymic 기관 문화^14,15, 조직 조각 또는 그대로 thymic 엽 explants thymocyte 움직임 2 광자 레이저 스캔 하 여 시각화는 reaggregate 현미경 검사 법 (TPLSM)⁸을 제한 된 최대 작동 거리 및 조직에 따라 1 mm의 깊이 이미징 intravital 이미징 기술¹⁶를 검사 합니다. 3D 구조 형성을 연장된 보육 시간에 따라 달라 지는 힘 드는 thymic 기관 문화, 달리 thymic 조각 기술과 그대로 thymic 엽 접근 허가 제어 소개의 특정 하위 집합의 모두, 사전 분류 thymocytes 네이티브 조직 건축 환경에. 그러나, 혈액 흐름은 이후 결 석이 모델은 명확 thymus thymus 실질 또는 성숙한 T 세포의 thymic egression 역학 창시자 (TSPs) 정착의 채용 과정을 공부에 대 한 제한.

Vivo에서 모델 쥐에서 thymic T 세포 성숙 생리학의 연구에 대 한 조각 또는 중 신장 캡슐¹⁷ 또는 intradermally¹⁸안으로 배치 하는 전체 기관 돌출부의 이식 포함 됩니다. 비록 이러한 옵션 보여 조직의 조직 기능 engraftment가 그들의 유틸리티, thymic 이식 동물 내에서 깊은 또는 불투명 직물의 층에 의해 덮여의 위치 비보에 의해 임 플 란 트의 시험에 대 한 그들의 사용 제한 TPLSM입니다.

눈의 앞쪽 챔버 각 막 레이어의 투명도 덕택으로 어떤 이식할 조직을 직접 모니터링을 위한 쉽게 접근할 수 있는 공간을 제공 합니다. 이점의 홍 채에 의해 형성 된 챔버의 혈관과 자율 신경 엔딩, 빠른 revascularization 및 이식^19,20reinnervation 풍부 하다. 박사 Caicedo 성공적으로 유지 보수 및 지난²¹에서 췌 장 독도의 종 적 연구에 대 한이 해 부 공간을 사용 하고있다. 자, 우리 보여이 전략 뿐만 아니라 네이티브 기관 구조 내에서 thymocytes의 역학을 공부 하는 유효한 접근을 구성 하지만 또한 고유 하 게 확장 하는 비보에 조상 모집의 연구에 경도 기록을 허용 하 고 성숙한 T 세포 egression 단계 마우스입니다.

프로토콜

기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 마이애미 대학의 IACUC 지침에 따라 모든 실험을 승인 했다.

1. 격리와 신생아 Thymi의 조정

1. 모든 시 약 및 압력가 마로 소독 또는 멸 균 상태를 보장 하는 다른 방법으로 악기를 준비 합니다.
2. 오염 최소화, 층 류 두건 아래 모든 수술 절차를 수행 합니다.
3. Euthanizing 기증자 마우스, 이전 60 m m 메 마른 접시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) x 살 균 prechilled 1를 얼음에 그것을 배치. Rinsing 하 고 기증자는 이식 전에 마우스에서 삭제 thymi를 저장 하기 위해 사용 됩니다.
4. 윤리 지침에 따라 잘린 여 신생아 기증자 마우스를 안락사를 진행 합니다.
5. 등 수직 위치에 스프레이, 멸 균 흡수 성 종이 타 올에 마우스를 놓고 나중에 닦 고, 70% 에탄올과 마우스 복 부.
6. 낮은 복 부의 수준에서 피상적 V 자형 절 개 하 여 흉 강을 노출 하 고 직선 10cm 약 0.5-1의 개통을 두고 복 부 정중 선 다음가 위를 해 부 한 켤레와 함께 피부를 잘라 cm 가슴 수준에서. 흉 강 노출 가슴의 양쪽에는 피부를 접어.
7. 막과 같은 유형의 앞쪽 흉 강에 우수한 mediastinum 액세스할 수가 위 흉 곽을 통해 확인 두 깊이 0.5-1 c m 측면 절 개. Thymus 심장 바로 위에 두 창백 엽으로 나타납니다.
8. Thymus와 완벽 한 장기를 추출 수직으로 당겨 아래 곡선된 겸 자 집합 장소. 집게의 쌍으로 흉 곽의 폴드를 방지 합니다. 필요한 경우 미세 집게를 사용 하 여 신중 하 게 장기를 추출 하기 전에 캡슐을 방해 하지 않고 장기를 둘러싼 결합 조직 찢.
   참고:이 단계는 해 범위를 사용 하 여 촉진 된다.
9. 차가운 멸 균 1 x PBS (pH 7.4) 이전 60 m m 메 마른 그릇에 표시 하 고 메스와 연결 지협 잘라 thymic 돌출부를 분리 하에 격리 thymus 잠수함. 캡슐을 해치지 않고 접시에서 모든 파편을 제거 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 임 플 란 트 하기 전에 바로 백 리 향 엽 트림.
   참고: 각 격리 된 신생아 thymus 양쪽 눈에 이식 받을 때 약 3 호스트 마우스의 최대 폭 1 m m의 6 세그먼트를 렌더링 됩니다 일반적으로.
10. 각 기증자 마우스에 대 한 1.4-1.9 단계를 반복 합니다. Thymi 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 한 번에 한 thymus를 격리 합니다.

2. thymus 이식으로 눈의 앞쪽 챔버

1. 이식, 이전 태그와 각 받는 사람 마우스 무게.
2. 받는 사람 마우스 anesthetize에 isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 합니다. 수술 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.
3. Thymus 세그먼트 이식으로 다음과 같이 하십시오.
   1. 장소 마우스 측면 측면 기댄 위치에는 한쪽 눈 직면 하 고 그래서 해 범위의 렌즈에 직접 노출.
   2. 감기 1 x PBS (pH 7.4)에 누워 격리 thymic 돌출부 중 소비 세-임 플 란 트에 대 한 최대 1 mm 폭 60 m m 접시 조각으로 가득. 각 세그먼트 thymic 피 질과 수 질 포함 되도록 지그재그 패턴을 따릅니다. 욕실이 위를 사용 하 여 그림 1A에 제공 된 지침에 따라 트리밍에 대 한.
      참고: thymus의 트리밍은 이식 조직 engraftment를 최적화 하기 전에 행해져야 한다.
   3. 외과 영역에 해당 하는 각 막의 기지에 starting, 해가 위 팁 소개 될 수 있도록 외부 각 막 층으로 작은 절 개를 만들기 위해 40 mm G18 바늘의 팁을 소개 합니다.
   4. 5-10 m m 각 막 여 잡고 단단히 resealing 방지 하기 위해 전용 욕실이 위를 사용 하는 각 막의 기초의 주위에 직접 절 개 측면을 확인 합니다. 편평한 끝 집게를 사용 하 여 조직 손상을 방지.
   5. 잘라 각 막 상피를 파악 하 고 개방을 통해 thymic 세그먼트를 추진 하는 동안 평면 종단 집게의 쌍을 가진 각 막 눌러 여 노출. 조작이 완료 될 때까지 조직을 건조를 방지 하기 위해 필요에 따라 살 균 1 PBS (pH 7.4) 또는 인공 눈물으로 눈을 젖은.
   6. 부드럽게 눈 표면에 eye´s 함수를 유지 하기 위해 학생에 관하여 측면 위치를 소개 조직 세그먼트를 누릅니다. 그는 이식 거짓말 눈 반대 위치에 골 탕 먹 여 이미징 후부 간섭 방지 하 여 확인 합니다.
   7. 플랫 포 셉의 도움으로 눌러 단단히, 대 한 약 3-5 s, 서로 자기 봉인 홍보에 대 한 각 막 여의 두 측면. 스테이플링 또는 재 수술 필요 하지 않습니다.
4. 양쪽 눈에 이식 수행, 마우스를 직접 해 현미경 렌즈에 두 번째 눈을 노출 하 고 반복 단계 2.3.2-2.3.7 측면 반대편 넘겨.
5. 수술 완료 되 면, 열 램프와 prewarmed는 빈 케이지를 마우스를 반환 합니다.
6. 각 이식된 마우스 차릴 다른 동물 들과 함께 공유 하는 감 금 소에 배치 하기 전에 완전 한 성과 의식 하는 것을 확인 하십시오. 이 일반적으로 수술 후 1 시간 이내에 자리를 걸립니다.
7. 이식 시 필요에 따라 진통제와 쥐를 치료 하 고 식 수에 1.6 mg/mL의 농도에서 아 세트 아미노 펜을 쥐를 제공 합니다.
8. 각 받는 사람 마우스에 대 한 2.2 2.9 단계를 반복 합니다.
9. 잠재적인 건강 합병증을 감지 하는 이식된 눈의 모양 뿐만 아니라 수술 동물 활동을 모니터링 합니다.

3. confocal 영상 3D 단일 광자 형광 Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 이식 Thymi의

1. Isofluorane 증기의 1-2% 사이의 복용량을 사용 하 여 받는 사람 마우스 anesthetize 적절 한 anesthetization 이미징 절차를 시작 하기 전에 반사 다음 발가락 핀치의 부재에 의해 보장
2. 그래서 그 하나의 눈 위로 향하도록 사이드 측면 휴식 위치에서 고정된 단계 현미경 플랫폼에 마우스를 놓습니다. 열 패드는 녹음 하는 동안 마우스의 일정 한 체온을 보장 하기 위해 현미경 플랫폼에 배치 됩니다.
   참고: 자세한 내용은 보충 그림 1 을 참조 하십시오.
3. Stereotaxic headholder에 마우스의 머리를 삽입 하 고 노브 thymus 이식 들고 눈에 현미경 목표의 직접 접근 측면 사이드 위치에 마우스 머리 억제를 조정 합니다.
4. 절차에 걸쳐 취 동물을 유지 하는 가스 마스크에 마우스 주 둥이 놓습니다. Isofluorane 증기 필요에 따라 조정 수 있습니다.
5. 눈 꺼 풀의 철회를 피하 면 서 녹음 하는 동안 눈의 안정화를 촉진 하기 위하여 철수 눈 꺼 풀에 붙어 있는 그들의 팁을 폴 리 에틸렌 관으로 덮여 있는 핀셋의 쌍을 가진 각 막 여백에 눈의 상태를 UST-2 솔리드 범용이 음. 이 머리와 눈의 안정적인 정착을 허용 하 고 앞에서 설명한²²로 눈에 혈액 흐름의 중단 없이 유연성을 제공 합니다.
   참고: 보조 그림 1B, C는 전체 어셈블리 표시.
6. 마우스 눈에 현미경 목표를 배치 하기 전에 각 막과 렌즈 사이 침수 액체도 멸 균 식 염 수 나 인공 눈물 몇 방울을 추가 합니다.
   참고: 추가 상품 현미경 경로 유지 하 고 눈의 건조를 방지 하는 절차를 통해 필요에 적절 하 게 됩니다.
7. 먼저 낮은 배율 (X 5) 렌즈를 사용 하 여 현미경 필드에서 thymus를 찾습니다. 다음 더 높은 해상도 (10, 20 및 40 X) 물 침수 긴 작동 거리와 목표를 찍기로 전환. LSM photodamage와 최소한의 레이저 파워를 적용 하 여 thymic 플 표백을 방지 하 고 가능한 스캔 시간을 단축. 이 현미경의 공명 스캐너를 사용 하 여 이루어집니다.
   참고: 우리가 사용 하는 confocal 현미경 공명 검사 거울 25 프레임/s에서 이미지를 수집 능력을 갖추고 있다. 다른 브랜드는 공명 스캐너와 함께 자신의 현미경.
8. 현미경 소프트웨어를 사용 하 여 수집 모드를 선택 하 고 공명 스캐너 모드 시작. 다음 XYZT 이미징 모드를 선택 하 고 인수 설정을 다음과 같이 구성:
   1. 아르곤 레이저를 켜고 형광 여기 30% 전력 조정.
   2. 여기 레이저 라인을 선택 하 고 다른 방출 파장 acousto 광 빔 스플리터 (AOBS) 제어를 설정 합니다. 또한, 후방 산란 검출 및 조직 구조를 나타내는, 사용 반사 탐지 동시에.
      참고: 여기 (GFP와 RFP)에 대 한 색상의 세트를 선택할 때는 AOBS는 자동으로 프로그래밍이 여기 라인 표본에와 그들 사이의 방출 전송. 예를 들어, GFP와 RFP, 우리를 사용 하 여 좁은 반사 밴드 여기 빛 약 488 nm 및 561 nm, 각각. 이것은 내보낸된 형광 광자, 레이저 파워 및 수집 시간에 대 한 필요성 감소의 컬렉션에 대 한 광범위 한 밴드. 반사 모드에서는 AOBS 형광 방출 감지에 사용 하는 것 들에서 어떤 파장에서 반사 된 빛의 이미지를 50: 50 빔 스플리터로 사용 됩니다.
   3. 선택 된 파장에서 방출 수집 다음 512 × 512 픽셀의 해상도 선택 하 고 필요에 따라 이득 레벨을 조정 하는 라이브 버튼을 눌러 이미징 라이브 시작 (일반적인 이득은 약 600 V).
   4. Thymic 임 플 란 트 위에 초점을 맞춤 으로써 시작 및 z 스택의 끝을 정의한 고 시작, 선택 다음 마지막 이식된 thymus에서 집중 될 수 있는 최종선택 평면 이동 합니다. 5 µ m의 z 단계 크기를 사용 합니다. 소프트웨어 자동으로 confocal 비행기의 수를 계산 합니다.
   5. 각 z-스택 (일반적으로 2 초에 1.5)의 수집에 대 한 시간 간격을 선택 하 고 연속 이미징 멈출 때까지 취득 옵션 선택.
9. 초기화를 시작 버튼을 누릅니다.
10. 이미지는 이식 반복적으로 같은 동물에서 서로 다른 시간에 단계 3.1 3.9를 반복 하 여 합니다.
    참고: 동물 이식 양쪽 눈에 좋다면 어느 눈에서 녹음 단계 3.2 3.9 마우스 머리의 수직 위치 측을 전환 후 반복 하 여 이동 수 있습니다.

결과

Thymus 신생아 쥐에서 b 6에서에서 격리 했다. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas 쥐가이 프로토콜 (단계 1.1-1.9)에 설명 된 대로. 이러한 유전자 변형 쥐에서 닭 베타 걸 발기인 빨간 형광 단백질 변형 DsRed의 식을 지시합니다. 임 플 란 트의 추적을 촉진 세포 (CMV) 즉시 초기 증강의 영향 아래 산악 표준시.

조직 제거, 유전자와 isogenic 개?...

토론

개별 면역 능력⁴ T 세포 성숙 과정의 중요성 및 성숙한 T 세포 thymus^2,3에 의해 생산에 선구자 세포 역학의 추정된 영향, 광범위 한 노력이 투자 되었습니다. 대안 클래식 고정된 조직 스냅샷 접근을 개발 하십시오.

조직 조각과 다른 explants는 분명히 우수한 재현 monolayers 또는 집계 thymic 기관 문화¹⁴

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA