Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

Özet

Lazer fare gözün ön odasında timik implantlar mikroskobu tarama timositleri boyuna intravital gerçek zamanlı izleme göstermek için protokol hedefidir. Kornea saydamlığını ve vaskülarizasyon greft sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kaydetmek için izin verir.

Özet

Gösterilmek yöntemin amacı, ilk kez, yeni doğan thymi in vivo boyuna gerçek zamanlı thymocytes´ dinamiği içinde bir bozukluklarına izleme için isogenic yetişkin mice ön göz odasına nakli göstermektir timus kesimi. Ekimi mikroskobu (LSM) kornea ile tarama Lazer vivo içinde noninvaziv tekrarlanan düşsel vasıl hücresel çözümleme düzeyi sağlar. Önemlisi, yaklaşım modelleri görüntüleme önceki intravital T hücre olgunlaşma için aynı hayvan sürekli progenitör hücre işe alım ve olgun T hücreli çıkış kayıtları için olasılığı ekler. Sistem Şeffaflık aşılı çevrenin makroskopik hızlı implante dokusunun izleme izin ek avantajları ve erişilebilirlik için izin implant için ek olarak sistemik tedaviler yerelleştirilmiş. Doku hacmi olmak ana sınırlama lob kırpma için talepleri göz odasının azaltılmış uzayda sığar. Organ bütünlük timus loblar olgun T-hücre üretimi için işlevsel olması için daha önce gösterilen şekillerindeki dissekan tarafından kaplamış. Otoimmünite, immün yetmezlik ve merkezi dayanıklılık içeren tıbben timus fonksiyonu ile ilgili sorular bir ortamın sorguya çekmek için potansiyel olarak uygun bir tekniktir; mechanistically kötü tanımlanmış kalır süreçleri. Thymocyte geçiş, farklılaşma ve seçim rehberlik mekanizmaları ince diseksiyon gelişmekte olan T hücreleri hedefleme roman tedavi stratejileri için götürür.

Giriş

İntrathymic T-hücre farklılaşma ve T-hücre subpopulation seçimini temel süreçleri geliştirme ve bakım hücre-aracılı bağışıklık omurgalıların¹için oluşturur. Bu işlem sıkı bir şekilde organize olaylar ataları kan dolaşımına, hücre çoğalması ve geçiş alımı, zar proteinleri ve büyük programlanmış hücre ölümü alt kümeleri için fark ifade dahil olmak üzere karmaşık bir dizi içerir seçimi. Sonuç olgun T-hücreleri yabancı antijenleri geniş bir spektrum için reaktif öz-peptidler, simge durumuna küçültülmüş yanıt görüntülerken sürümüdür periferik lenfoid organlar bireysel^2,3kolonileşmesi hangi sonuna kadar. Anormal thymocyte seçim αβTCR repertuar otoimmün hastalık veya esas olarak kusurları olumlu ya da olumsuz habercisi seçimi, işlemler sırasında sırasıyla türetmek bağışıklık dengesizlik⁴ yol açar.

Timositleri timus genelinde yönlü geçiş T-hücre olgunlaşma tüm aşamalarında içsel ve birden çok uyaranlara kemokinler, yapışkan-dahil olmak üzere, bir dizi eşzamanlı veya sıralı olarak öngörülen ve hücre dışı matriks (ECM) de-yapışkan protein etkileşimleri^3,5. Ex vivo çalışmalar ortaya koymuştur iken iki çalışma sabit dokuların tanımlanmış timik microenvironments^5,6, thymocyte göçmen yardımlar için ifade kalıpları ile ilgili kritik bilgi yaygın hale timositleri organ iki histolojik olarak ayrı alanda göç davranışlarını: yavaş Stokastik hareketleri korteks ve medulla^7,8,9,10 hızlı, sınırlı hareketliliği ^{, 11 , 12 , 13}. artan göç oranları timik pozitif seçim¹³ ile ilişkilendirmek ve negatif seçim timus yolculuk kinetik uygun belirler hipotezi destekleyen gezinme davranışını ile ilişkili timositleri olgunlaşma. Kendi alaka rağmen thymocyte-stromal hücre etkileşimleri topoloji ve thymocyte hareketliliği arasında organ microenvironments T hücre olgunlaşma sırasında dinamikleri kötü tanımlanmış kalır.

Bugüne kadar gerçekleştirilen en ex vivo çalışmalar fetal eklemek veya timik organ kültürler^14,15, dokusu dilimlerin veya nerede thymocyte hareketleri iki fotonlu lazer tarama tarafından görüntülenmiştir sağlam timik lob explants reaggregate mikroskobu (TPLSM)⁸, intravital bir görüntüleme tekniği mesafe çalışma ve doku uygun olarak 1 mm derinliği görüntüleme sınırlandırılmış maksimum¹⁶inceledi. Genişletilmiş kuluçka kez form 3D-yapılarına bağlıdır zahmetli timik organ kültürler aksine, timik dilim tekniği hem de belirli alt kümelerine sağlam timik lob yaklaşım kontrol izni getirilmesi önceden etiketli timositleri yerel doku Mimarlık ortamı içine. Ancak, kan akışı olduğundan yok bu modellerinde, onlar ataları (TSPs) timus parankimi veya olgun T-hücrelerinin timik egression dinamikleri yerleşme timus işe alım sürecinin eğitimi için açıkça sınırlıdır.

Vivo modelleri timik T-hücre olgunlaşma Fizyoloji farelerde incelenmesi için Greftler parçaları veya ya böbrek kapsül¹⁷ veya intradermally¹⁸içine yerleştirilen tüm organ loblar içerir. Bu seçenekler dokusunun sistemik fonksiyonel engraftment sorguya çekmek için onların yardımcı olsa da, timik Greftler derin içinde hayvan veya opak doku katmanları tarafından kapalı konumunu kullanımları vivo içinde implantlar tarafından incelenmesi için kısıtlar TPLSM.

Gözün ön odası kornea katman saydamlığını sayesinde aşılı herhangi bir doku doğrudan izlenmesi için kolayca erişilebilir bir alan sağlar. Avantajı, Iris tarafından kurulan odası Bankası kan damarları ve otonomik sinir uçları, olanaklı kılmak hızlı revaskülarizasyon ve greft^19,20reinnervation zengindir. Dr Caicedo başarıyla anatomik bu alanı bakım ve son²¹pankreas adacıkları boyuna incelenmesi için kullandı. İşte, bu strateji sadece yerel organ yapısı içinde timositleri dynamics eğitim için geçerli bir yaklaşımı kabul ettiğiniz anlamına gelir, ama aynı zamanda benzersiz olarak vivo içinde yaratıcı işe alım çalışmanın boyuna kayıtları genişletmek için izin verir göstermektedir ve Olgun T-hücre egression adımda fare.

Protokol

Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi IACUC esaslarına göre tüm deneylerin onayladı.

1. yalıtım ve yeni doğan Thymi Düzeltme

1. Tüm reaktifler ve araçlar tarafından ısıyla ya da diğer yöntemlerle Steril koşullar sağlanması, hazır olun.
2. Contaminations en aza indirmek için laminar akış başlık altında tüm cerrahi işlemler gerçekleştirmek.
3. Donör fareler ötenazi önce steril prechilled 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) x 60 mm Steril çanak doldurmak ve buz üzerinde yerleştirin. Durulama ve donör fareler nakli önce gelen eksize thymi saklamak için kullanılır.
4. Etik kurallara uygun olarak işten çıkarma tarafından yeni doğan donör fareler ötenazi için devam edin.
5. Steril emici kağıt havlu dorsal dik pozisyonda ve sprey üzerine fareyi getirin ve daha sonra silin, fare karın % 70 etanol ile.
6. Göğüs boşluğuna alt karın düzeyinde bir yüzeysel V şeklinde kesi yaparak ortaya çıkarmak ve bir çift düz 10 cm bir açılış yaklaşık 0,5-1 bırakmak ventral bir orta hat takip makas diseksiyon ile deriyi kesme cm göğüs düzeyinde. Cilt göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için göğüs her iki tarafında katlayın.
7. Yapmak iki derin 0,5-1 cm yanal insizyon diyafram ve göğüs kafesi makas ön göğüs boşluğuna üstün mediasten erişmek için aynı tip. Timus iki soluk loblar kalp üzerinde doğru olarak görüntülenmesi gerekir.
8. Dikey olarak tam organ ayıklamak için bir yer eğri forseps timus ve çekme altında bir dizi. Göğüs kafesi foldback forseps bir çift ile önlemek. Gerekirse, iyi forseps organ organ çıkarma önce belgili tanımlık kapsül bozmadan çevreleyen bağ dokusu altını dikkatle kullanın.
   Not: Bir diseksiyon kapsamı kullanarak bu adım kolaylaştırılmıştır.
9. İzole timus timik loblar ayırmak için daha önce bir 60 mm Steril tabak içine görüntülenen ve bağ berzah bir neşter ile kesme soğuk steril 1 x PBS (pH 7,4) daldırın. Herhangi bir enkaz yemek kapsül zarar vermeden kaldırmak. Thymi maruz süresini en aza indirmek için kekik loblar implant önce kırpın.
   Not: İzole her yeni doğan timus genellikle altı yaklaşık 1 mm en fazla üç ana bilgisayar fare için geniş kesimlerinin implantlar gözlerinden alırken hale getirecek.
10. 1.4-1.9 her donör fare için yineleyin. Thymi maruz süresini en aza indirmek için bir defada bir timus yalıtmak.

2. timus implantasyon gözün ön odasına

1. Önce nakli, etiket ve her alıcı fare tartmak.
2. Bir doz isofluorane buharlar alıcı fare anestezi % 1-2 arasında kullanın. Cerrahi işlem başlamadan önce refleks aşağıdaki ayak çimdik yokluğunda tarafından uygun anesthetization olun.
3. Timus kesimleri nakli ile aşağıdakileri yapın:
   1. Bu bir göz yukarı bakacak şekilde fare yan yatay yatay konumda doğrudan diseksiyon kapsam lens maruz yerleştirin.
   2. Bir soğuk 1 x PBS (pH 7,4) yalan izole timik lob tüketim-60 mm çanak implant için en fazla 1 mm genişlik parçalar halinde dolu. Her kesimi timik korteks ve medulla içerir emin olmak için bir zikzak yol izler. Şekil 1A' sağlanan yönergelere göre düzeltme için kenasen makas kullanın.
      Not: Kırpma timus doku engraftment optimize etmek için önce Şu implant yapılması gerekir.
   3. Cerrahi alan karşılık gelen kornea Bankası başlayarak, böylece diseksiyon makası ipucu tanıttı dış kornea katmanları içine küçük bir kesi yapmak için 40 mm G18 iğne ucu tanıtmak.
   4. Kenasen makas kornea açılış tutarken sıkıca yeniden mühürlemeden önlemek için kullanırken kornea doğrudan tabanı etrafında kesi kanattan bir 5-10 mm olun. Forseps ile düz biter doku hasarı önlemek için kullanın.
   5. Kesme kornea epitel kavramak ve açılış delikten timik bir kesimi iterek sırasında kornea bir çift düz uçlu forseps ile tutarak bulaşmasına neden. Steril 1 x PBS (pH 7,4) veya Suni gözyaşları gözle manipülasyon tamamlanana kadar doku kuruma önlemek için gerektiği gibi ıslak.
   6. Usulca göz yüzeyinde yanal bir konuma eye´s işlevi korumak için öğrenci ile ilgili olarak tanıtılan doku segment slayt için tuşuna basın. Greft göz ters bir yerde arka görüntüleme ile lamamas tarafından etkilenmemesi için açılış yatıyor emin olun.
   7. Düz forseps yardımıyla, basın sıkıca, için hakkında 3-5 s, kornea açılış kendinden contalı tanıtmak için birbirlerine karşı iki yüzü. Ameliyat herhangi bir zımbalama veya dikiş gerektirmez.
4. Nakilden her iki gözünü gerçekleştirilmesi durumunda fare doğrudan ikinci göz diseksiyon mikroskop objektif ortaya çıkarmak ve adımları 2.3.2-2.3.7 tekrar ters yan yan tarafa dönün.
5. Ameliyat tamamlandıktan sonra fare ile a ısı lamba prewarmed boş bir kafes dönün.
6. Transplante her fare tam taşınabilirlik ve bilinç diğer hayvanlar ile paylaşılan bir kafes içine yerleştirmeden önce kavuşur olduğunu emin olun. Bu genellikle ameliyattan sonra 1 saat içinde yer alır.
7. Organ nakli, üzerine gerektiği gibi ağrı kesici ile fareler tedavi ve asetaminofen 1.6 mg/mL içme suyundaki bir konsantrasyon, fareler sağlayın.
8. 2.2-2,9 her alıcı fare için yineleyin.
9. Ameliyat sonrası hayvan etkinliğini izleme yanı sıra olası sağlık komplikasyonlar algılamak için implante gözleri görünümünü.

3. 3D tek foton floresan Confocal mikroskobu kullanılarak Thymi implante confocal görüntüleme

1. Bir doz isofluorane buharı % 1-2 arasında kullanarak alıcı fare anestezi. Görüntüleme yordamına başlamadan önce refleks aşağıdaki ayak çimdik yokluğunda tarafından uygun anesthetization emin olmak
2. Bir gözünü karşı karşıya olduğu bu yüzden bir yan yan yatay konumda sabit sahne mikroskop platformda fareyi getirin. Bir ısı yastık kayıtları sırasında fareler sürekli vücut sıcaklığını sağlamak için mikroskop platformda yer alıyor.
   Not: Ayrıntılı bilgi için bkz. ek Şekil 1 .
3. Fare Başkanı stereotaksik headholder yerleştirin ve mikroskop amacın timus greft holding göz için doğrudan erişim sağlayan bir yan yan pozisyon fare kafasına tutmaya topuzu ayarlayın.
4. Fare burun yordam anestezi hayvan tutmak için bir gaz maskesi içine koyun. Bu gerektiği gibi isofluorane buharlar ayarlanmasını sağlar.
5. Göz kapaklarının retraksiyon kaçınırken göz istikrar kayıtları sırasında kolaylaştırmak için geri çekmek için bağlı olan bir çift polietilenler tüp tarafından kapalı onların ipuçları var cımbız ile kornea kenar boşluğunda göz tutarken göz kapakları bir UST-2 katı evrensel ortak. Bu düzenleme kafa ve göz sabit bir fiksasyon izin verir ve yukarıda açıklanan²²olarak kan akımı gözde, kesinti olmadan esneklik sağlar.
   Not: Ek Şekil 1B, C tam derleme göster.
6. Mikroskop objektif fare göz kulak yerleştirmeden önce kornea ve objektif arasında daldırma sıvı olarak steril serum fizyolojik veya Suni gözyaşları birkaç damla ekleyin.
   Not: ek damla mikroskop yolu tutmak ve göz kurutma önlemek için bu yordamı boyunca gereği reçete.
7. İlk düşük büyütme (5 X) lens timus içinde mikroskop alanı bulmak için kullanabilirsiniz. O zaman daha yüksek çözünürlük (10, 20 ve 40 X) su daldırma objektif kadar çalışma mesafesi ile daldırma geçin. LSM duyarlilik ve en az lazer güç uygulayarak timik implantın ağartma önlemek ve scanning zaman mümkün olduğu kadar azaltmak. Bu mikroskop rezonans tarayıcı kullanılarak elde edilir.
   Not: kullandığımız confocal mikroskop rezonans tarama ayna görüntü 25 kare/s hızında toplayabilir bulunuyor. Diğer markalar kendi mikroskoplar rezonans tarayıcılar ile var.
8. Belgili tanımlık mikroskop bilgisayar yazılımı kullanarak satın alma modunu seçin ve rezonans tarayıcı modunda başlatın. O zaman XYZT görüntüleme modunu seçin ve aşağıdaki gibi satın alma ayarlarını yapılandırın:
   1. Argon lazer açmak ve floresan uyarma için % 30 iktidara ayarlayın.
   2. Bir uyarma lazer çizgi seçin ve farklı emisyon dalga boylarında acousto optik ışın splitter (AOBS) denetimi ayarlayın. Buna ek olarak, backscatter algılamak ve doku yapısı betimlemek için yansıma algılama aynı anda kullanabilir.
      Not: renkleri uyarma (GFP ve RFP) için seçilmesi üzerine, AOBS otomatik olarak bu uyarma satırları örnek üzerine yönlendirmek ve aralarında emisyon iletmek için programlanmıştır. Örneğin, GFP ve RFP için dar yansıma bantları için uyarma ışık civarında 488 kullandığımız nm ve 561 nm, anılan sıraya göre. Bu geniş bant verilmiş floresans fotonlar, böylece lazer güç ve satın alma zaman ihtiyacını azaltarak toplanması için bırakır. Yansıma modunda AOBS bir 50/50 ışın ayırıcı herhangi bir dalga boyu olanlar floresans emisyon algılama için kullanılan uzak yansıyan ışık görüntü için kullanılır.
   3. Seçili dalga boyu, emisyon toplamak sonra 512 × 512 piksel çözünürlüğü seçin ve gerektiği gibi kazanç düzeylerini ayarlamayla Live düğmesine basarak Imaging canlı (tipik kazanç ise yaklaşık 600 V).
   4. Başında ve sonunda z yığının üst kısmında timik implant odaklanarak tanımlamak ve başlamakseçin, ardından son implante timus içinde odaklanmış ve Endselect uçak gider. 5 mikron z-adım boyutunu kullanın. Yazılım otomatik olarak confocal uçak sayısını hesaplar.
   5. Her z-yığın (genellikle 1.5 2 saniye) edinimi için zaman aralığı seçin ve sürekli görüntüleme durdurulana kadar elde seçeneğini belirleyin.
9. Başlatmak için Başlat düğmesine basın.
10. Greftler tekrar tekrar aynı hayvandan farklı zamanlarda 3.1-3,9 adımları tekrar ederek görüntü.
    Not: hayvan her iki gözünü Greftler tutuyorsa, her iki göz kayıtları adımları 3.2-3,9 fare kafası dik pozisyonda tarafına geçtikten sonra tekrar ederek alınabilir.

Sonuçlar

Yeni doğan farelere timus B6 izole edildi. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas bu Protokolü (adım 1.1-1.9) açıklandığı gibi fareler. Bu transgenik farelerde tavuk beta aktin organizatörü kırmızı floresan protein değişken DsRed ifade yönlendirir. MST implantlar izlenmesini kolaylaştırmak sitomegalovirüs (CMV) hemen erken artırıcı etkisi altında.

Doku reddi, isogenic bireylerin genotip ile önlemek için...

Tartışmalar

T-hücre olgunlaşma sürecinin bireysel bağışıklık yetkinlik⁴ için önemi ve öncü hücre dinamikleri üzerinde timus^2,3tarafından üretilen olgun T-hücreleri tahmin ediliyor etkisi nedeniyle yoğun çabaları yatırım seçimli-e doğru klasik sabit doku anlık görüntü yaklaşım geliştirmek için.

Dokusu dilimlerin ve diğer explants doku mimari monolayers veya toplama timik organ kültürler

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA