Echtzeit- In Vivo Verfolgung von Thymozyten in die Vorderkammer des Auges durch Laser-Scanning-Mikroskopie

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist längs intravitalen Echtzeitverfolgung der Thymozyten durch Laser-scanning-Mikroskopie in der zebrafischembryonen Implantate in die Vorderkammer des Auges Maus zeigen. Die Transparenz der Hornhaut und Vaskularisierung des Transplantats ermöglicht kontinuierlich aufzeichnen Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg.

Zusammenfassung

Die vorgestellte Methode soll zeigen, zum ersten Mal die Transplantation von Neugeborenen Thymi in die vorderen Auge Kammer isogenen Erwachsener Mäuse für in Vivo längs Echtzeit-Überwachung der Thymocytes´ Dynamik innerhalb einer vaskularisierte Thymus-Segment. Nach der Transplantation kann Laser-scanning-Mikroskopie (LSM) durch die Hornhaut in Vivo nicht-invasive wiederholte Bildgebung auf zelluläre Auflösung Ebene. Wichtig ist, verleiht der Ansatz vorherigen intravitalen T-Zell-Reifung imaging-Modelle die Möglichkeit für die kontinuierliche Stammvater Zelle Rekrutierung und Reife T-Zell-Ausstieg-Aufnahmen im gleichen Tier. Weitere Vorteile des Systems sind die Transparenz der transplantierten Bereich makroskopische schnelle Überwachung des implantierten Gewebes, bei schönem und der Zugriff auf das Implantat, so dass für lokalisierte neben systemischen Behandlungen. Die Haupteinschränkung wird das Volumen des Gewebes, das passt im reduzierten Raum der Auge Kammer die Forderungen nach Lappen trimmen. Orgel-Integrität wird maximiert durch Sezieren Thymus Lappen in den Mustern, die zuvor gezeigt, dass funktional für Reife T-Zell-Produktion. Die Technik eignet sich möglicherweise um ein Milieu der medizinisch relevanten Fragen im Zusammenhang mit Thymus-Funktion zu verhören, die Autoimmunität, Immunschwäche und zentrale Toleranz enthalten; Prozesse, die mechanisch schlecht definierten bleiben. Die feinere Zerlegung des Mechanismen führen Thymocyte Migration, Differenzierung und Auswahl sollte für neue therapeutische Strategien zielen entwickelnde T-Zellen führen.

Einleitung

Intrathymic T-Zell-Differenzierung und T-Zell Subpopulation Auswahl bilden wichtige Prozesse für die Entwicklung und Wartung von zellvermittelte Immunität in Wirbeltieren¹. Dieser Prozess beinhaltet eine komplexe Abfolge von straff organisierten Veranstaltungen, einschließlich der Rekrutierung von Vorfahren aus Blut, Zell-Proliferation und Migration, differentielle Expression der Membranproteine und massive programmierten Zelltod für Teilmengen Auswahl. Das Ergebnis ist die Freisetzung von Reifen T-Zellen reagiert auf eine ausreichend Bandbreite an fremde Antigene während der Anzeige minimierter Antworten auf selbst-Peptide, welche enden besiedeln die peripheren lymphatischen Organen der einzelnen^2,3. Aberranten Thymocyte Auswahl des Repertoires αβTCR führt zur Autoimmunerkrankung oder immun Ungleichgewicht⁴ , die vor allem von Mängeln während der Prozesse des negativen oder positiven Vorläufer Auswahl bzw. abgeleitet werden.

Gerichtete Migration von Thymozyten in den Thymus ist untrennbar mit allen Phasen der T-Zell-Reifung und es ist geplant als eine Reihe von gleichzeitige oder sequentielle mehrere Reize, einschließlich Chemokine, Klebstoff, und de-Kleber extrazellulären Matrix (ECM) Protein-Interaktionen^3,5. Die Studie von festen Geweben hat wiedergegeben, kritische Informationen über die Muster des Ausdrucks für Thymocyte wandernden Cues in definierten zebrafischembryonen Mikroumgebungen^5,6, während Ex-Vivo -Studien ergab zwei weit verbreitet wandernde Verhalten der Thymozyten in zwei histologisch verschiedene Bereiche der Orgel: langsame stochastische Bewegungen im Kortex und schnelle, engen Motilität in der Medulla^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. erhöhte wandernden Preise korrelieren mit zebrafischembryonen Positivauswahl¹³ und negative Auslese krabbelverhalten unterstützen die Hypothese, dass die Kinetik der Reise durch die Thymusdrüse richtig bestimmt zugeordnet ist Reifung der Thymozyten. Trotz ihrer Relevanz bleiben die Topologie des Thymocyte Stromazellen Zell-Interaktionen und die Dynamik der Thymocyte Motilität über Orgel Mikroumgebungen während der T-Zell-Reifung nicht ausreichend geregelt.

Die meisten ex Vivo -Studien durchgeführt, um Datum gehören fetalen oder reaggregate zebrafischembryonen Orgel Kulturen^14,15, Gewebe-Scheiben oder intakte zebrafischembryonen Lappen Explantaten wo Thymocyte Bewegungen von zwei-Photonen-Laser-scanning visualisiert werden Mikroskopie (TPLSM)⁸, untersucht ein intravitalen bildgebendes Verfahren mit einem eingeschränkten Maximum Arbeitsabstand und imaging-Tiefe von 1 mm im Einklang mit dem Gewebe¹⁶. Im Gegensatz zu den mühsamen zebrafischembryonen Orgel Kulturen die längere Inkubationszeiten zu 3D-Strukturen abhängen, vorab mit der Bezeichnung zebrafischembryonen Slice-Technik sowohl die intakte zebrafischembryonen Lappen Ansatz Genehmigung kontrolliert Einführung von bestimmten Teilmengen von Thymozyten in einer nativen Gewebe Architektur Umgebung. Jedoch fehlt da Blutfluss ist in diesen Modellen sind sie für das Studium des Recruiting-Prozesses der Thymus Ansiedlung Stammväter (FDA), Thymus Parenchym oder die Dynamik von zebrafischembryonen heraustreten von Reifen T-Zellen deutlich begrenzt.

In-Vivo -Modelle für das Studium der zebrafischembryonen T-Zell-Reifung-Physiologie in den Mäusen gehören die Transplantate Fragmente oder ganze Organ Lappen gelegt, entweder innerhalb der Niere Kapsel¹⁷ oder mikrodialysemembranen¹⁸. Obwohl sich diese Optionen ihre Nützlichkeit, systemische funktionale Engraftment des Gewebes zu befragen, schränkt die Position des zebrafischembryonen Transplantate tief in das Tier oder durch undurchsichtige Gewebeschichten ihre Verwendung zur in-Vivo -Untersuchung von Implantaten durch TPLSM.

Die Vorderkammer des Auges bietet eine leicht zugängliche Raum zur direkten Überwachung der transplantierten Gewebe aufgrund der Transparenz der Hornhaut Schichten. Von Vorteil ist die Basis der Kammer durch die Iris gebildet reich an Blutgefäßen und autonomen Nervenendigungen, ermöglicht rasche Revaskularisation und Reinnervation der Transplantate^19,20. Dr. Caicedo wurde erfolgreich diesen anatomischen Raum für die Wartung und Längsschnittstudie des Pankreas Inseln in den letzten²¹verwendet. Hier zeigen wir, dass diese Strategie nicht nur einen gültigen Ansatz ist um Thymozyten Dynamik innerhalb der nativen Orgel-Struktur zu studieren, sondern auch eindeutig erlaubt, um die in Vivo längs Aufnahmen zum Studium der Stammvater Rekrutierung zu erweitern und Reife T-Zell-heraustreten Schritte bei der Maus.

Protokoll

Die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt die Experimente nach IACUC Richtlinien.

1. Isolierung und Trimmen des Neugeborenen Thymi

1. Bereiten Sie alle Reagenzien und Instrumente durch Autoklavieren oder andere Methoden, sterile Bedingungen zu gewährleisten.
2. Um Verunreinigungen zu minimieren, führen Sie alle chirurgischen Eingriffe unter einem Laminar-Flow-Haube.
3. Füllen Sie vor euthanizing Spender Mäuse einen sterile 60 Millimeter-Teller mit sterilen prechilled 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und auf Eis. Es wird zum Spülen und speichern die ausgeschnittenen Thymi von Spender-Mäuse vor der Transplantation verwendet werden.
4. Fahren Sie mit Neugeborenen Spender Mäuse durch Enthauptung, im Einklang mit ethischen Richtlinien einschläfern.
5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf sterile saugfähiges Küchenpapier in einen dorsalen aufrecht und Spray, und später wischen Sie, die Maus Bauch mit 70 % Ethanol.
6. Aussetzen der Brusthöhle durch eine oberflächliche v-förmigen Einschnitt auf der Ebene des Unterleibs und schneiden Sie die Haut mit einem Paar von gerade 10 cm präparierscheren nach einer ventralen Mittellinie lassen Sie eine Öffnung von ca. 0,5-1 cm auf der Brust-Ebene. Falten Sie die Haut auf jeder Seite der Brust, der Brusthöhle verfügbar zu machen.
7. Machen zwei tiefer 0,5-1 cm seitliche Einschnitte durch das Zwerchfell und Brustkorb mit der gleichen Art der Schere auf die überlegene Mediastinum in der vorderen Brusthöhle zugreifen. Der Thymus sollte als zwei blasse Lappen direkt über dem Herzen erscheinen.
8. Legen Sie die gebogene Pinzetten unter dem Thymus und ziehen vertikal um die komplette Orgel zu extrahieren. Verhindern Sie die Foldback des Brustkorbs mit ein paar Zangen. Wenn nötig, feine Pinzette verwenden, um das Bindegewebe rund um die Orgel ohne Unterbrechung die Kapsel vor dem Extrahieren der Orgel sorgfältig auseinander zu reißen.
   Hinweis: Dieser Schritt ist durch die Verwendung eines sezierenden Bereichs erleichtert.
9. Tauchen Sie die isolierten Thymus in kalten sterilen 1 X PBS (pH 7,4) zuvor in eine sterile Schale 60 mm angezeigt, und die verbindende Landenge mit einem Skalpell schneiden die zebrafischembryonen Lappen zu trennen. Entfernen Sie jeglichen Schmutz aus der Schale ohne Schädigung der Kapsel. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, schneiden Sie Thymian Lappen vor dem Implantat.
   Hinweis: Jede isolierte Neugeborenen Thymus in der Regel sechs Segmente von ca. 1 mm breit für ein Maximum von drei Mäusen, Host rendert beim Empfang Implantate in beiden Augen.
10. Wiederholen Sie die Schritte 1.4-1.9 für jede Spender-Maus. Zur Minimierung der Zeit Thymi ausgesetzt sind, isolieren Sie eine Thymus zu einem Zeitpunkt.

(2) Thymus Implantation in die Vorderkammer des Auges

1. Taggen Sie vor der Transplantation und wiegen Sie jeder Empfänger Maus.
2. Verwenden Sie eine Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe um die Empfänger Maus zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor dem chirurgischen Eingriff zu gewährleisten.
3. Mit Thymus-Segmente-Transplantation wie folgt vorgehen:
   1. Platzieren Sie den Mauszeiger in eine seitliche Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben direkt auf die Linse des Bereichs sezierenden ausgesetzt.
   2. Verbrauchssteuern eines isolierten zebrafischembryonen Lappen liegen mit der kalten 1 X PBS-Puffer (pH 7,4)-60 Millimeter-Teller in Stücke mit bis zu 1 mm Breite für Implantat gefüllt. Folgen Sie einem Zick-Zack-Muster um sicherzustellen, dass jedes Segment zebrafischembryonen Cortex und Medulla enthält. Verwenden Sie Vannas Schere zum Zuschneiden nach Richtlinien in Figur 1A.
      Hinweis: Trimmen des Thymus sollte vor Implantat Gewebe Engraftment Optimierung erfolgen.
   3. Beginnend in der Basis der Hornhaut, der OP-Bereich entspricht, stellen Sie eine 40 mm G18 Nadelspitze einen kleinen Schnitt in externen Hornhaut Schichten, so dass die sezierenden Schere Tipp eingeführt werden kann.
   4. Machen Sie eine 5-10 mm Einschnitt direkt um die Basis der Hornhaut mit Vannas Schere halten Sie die Hornhaut Öffnung fest um zu verhindern Wiederverschließen flankieren. Verwenden Sie Zange mit flachen enden, um Gewebeschäden zu vermeiden.
   5. Fassen Sie die geschnittenen Hornhaut-Epithel und setzen Sie die Öffnung durch die Hornhaut mit einem Paar der Wohnung beendet Zange halten, während ein zebrafischembryonen Segment durch die Öffnung schieben. Befeuchten Sie das Auge mit sterilen 1 x PBS (pH 7,4) oder künstliche Tränen Bedarf Gewebe Austrocknung zu verhindern, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist.
   6. Drücken Sie sanft auf die Augenoberfläche gleiten Segment eingeführten Gewebe zu einer seitlichen Position in Bezug auf die Pupille zu Archiv-Funktion zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Transplantat an einem Standort gegenüber dem Auge öffnenden hinteren Störungen mit Bildgebung durch Trübung liegt.
   7. Mit Hilfe der flachen Zange, drücken Sie fest, für ca. 3-5 s, die beiden Seiten der Hornhaut Eröffnung gegeneinander selbstdichtend zu fördern. Die Operation erfordert kein Heften oder nähen.
4. Wenn die Transplantate an beiden Augen durchgeführt werden, schalten Sie die Maus über die seitlichen Gegenseite direkt aussetzen des zweiten Auges zu sezierenden Mikroskop-Objektiv und wiederholen die Schritte 2.3.2-2.3.7.
5. Nachdem die Operation abgeschlossen ist, zurück die Maus auf einen leeren Käfig mit einer Wärmelampe vorgewärmt.
6. Stellen Sie sicher, dass jeder transplantierte Maus komplette Mobilität und Bewusstsein wiedererlangt, bevor sie in einen Käfig geteilt mit anderen Tieren platziert. Dies erfolgt in der Regel innerhalb von 1 h nach der Operation.
7. Nach Transplantation behandeln Sie die Mäuse mit Schmerzmitteln zu, je nach Bedarf und liefern Sie die Mäuse mit Paracetamol in einer Konzentration von 1,6 mg/mL im Trinkwasser.
8. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,9 für jede Empfänger Maus.
9. Monitor postoperative tierische Aktivität sowie das Erscheinungsbild der implantierten Augen, potenzielle gesundheitliche Komplikationen zu erkennen.

(3) Confocal Imaging implantiert Thymi mit 3D Single Photon konfokale Fluoreszenzmikroskopie

1. Die Empfänger Maus mit einer Dosis zwischen 1-2 % des Isofluorane Dämpfe zu betäuben. Richtige Anesthetization durch das Fehlen von reflex folgende Zehe Prise vor Beginn der bildgebenden Verfahrens zu gewährleisten
2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine fest installierte Bühne-Mikroskop-Plattform in einem seitlichen Liegerad Seitenlage, dass ein Auge nach oben. Ein Wärmekissen befindet sich auf der Mikroskop-Plattform um konstante Körpertemperatur von Mäusen während der Aufnahmen zu gewährleisten.
   Hinweis: Weitere Informationen ergänzende Abbildung1 .
3. Stecken Sie den Kopf der Maus in einer stereotaktischen Headholder und passen Sie den Regler, um die Maus-Kopf auf der lateralen Seitenlage erlaubt Direktzugriff auf das Mikroskopobjektiv für das Auge hält der Thymus-Transplantats zurückhalten.
4. Setzen Sie die Maus-Schnauze in eine Gasmaske, das Tier während des gesamten Verfahrens betäubt zu halten. Dies ermöglicht die Anpassung der Isofluorane Dämpfe nach Bedarf.
5. Um die Stabilisierung des Auges bei Aufnahmen unter Vermeidung der Retraktion der Augenlider zu erleichtern, nach hinten ziehen die Augenlider halten Sie das Auge auf die Hornhaut-Marge mit einer Pinzette, die haben ihre Spitzen bedeckt von einem Polyethylen-Rohr die beigefügt sind eine UST-2 feste Kreuzgelenk. Diese Anordnung ermöglicht eine stabile Fixierung des Kopfes und des Auges und Flexibilität ohne Unterbrechung des Blutflusses im Auge, wie zuvor beschrieben²².
   Hinweis: Zusätzliche Figuren 1 b, C zeigen die Komplettmontage.
6. Fügen Sie einige Tropfen der sterilen Kochsalzlösung oder künstliche Tränen wie die Immersion Flüssigkeit zwischen die Hornhaut und die Linse vor dem Inverkehrbringen der Maus Auge das Mikroskopobjektiv.
   Hinweis: zusätzliche Tropfen entfallen auf Notwendigkeit während des Verfahrens zu den Mikroskop Weg und verhindern, dass Auge trocknen.
7. Zuerst verwenden Sie geringer Vergrößerung (5 X) Objektiv, um Thymus im Mikroskop-Bereich zu finden. Wechseln Sie dann zu höheren Auflösung (10, 20 und 40 X) Eintauchen in Wasser eintauchen Ziele mit langem Arbeitsabstand. Vermeiden Sie LSM lichtbedingten und Bleichen von zebrafischembryonen Implantat durch die Anwendung minimal Laserleistung und reduzieren Sie Scan-Zeit so weit wie möglich. Dies wird erreicht durch die Verwendung des resonanten Scanners des Mikroskops.
   Hinweis: Die confocal Mikroskop verwenden wir ist mit resonanten Scan Spiegel in der Lage, Sammeln von Bildern bei 25 Frames/s ausgestattet. Andere Marken haben ihre eigenen Mikroskope mit resonanten Scanner.
8. Wählen Sie den Kauf-Modus mit der Mikroskop-Software und starten Sie die resonante Scanner-Modus zu. Dann wählen Sie den XYZT-imaging-Modus und konfigurieren Sie die Übernahme Einstellungen wie folgt:
   1. Den Argon-Laser einschalten und Einstellen der Leistung um 30 % für Fluoreszenzanregung.
   2. Wählen Sie eine Laserlinie Erregung und den Akusto-optischen Beam Splitter (AOBS) Regler für verschiedene Emission Wellenlängen. Zusätzlich zur Erkennung Backscatter und Gewebestruktur abzugrenzen, verwenden Sie Reflexion Erkennung gleichzeitig.
      Hinweis: Wenn Sie eine Reihe von Farben zur Anregung (GFP und RFP) auswählen, ist die AOBS automatisch programmiert leiten diese Erregung Linien auf die Probe und die Emission zwischen ihnen übertragen. Zum Beispiel für GLP und RFP, verwenden wir schmale Reflexion Bänder für Anregungslicht rund 488 nm und 561 nm, beziehungsweise. Dadurch Breite Bändern für die Sammlung von Fluoreszenz emittierten Photonen, wodurch die Notwendigkeit für Laser macht und Erwerb. Im reflektionsmodus dient der AOBS als ein 50/50 Strahlteiler reflektiertes Licht in jede Wellenlänge vom für Fluoreszenz-Emission-Erkennung verwendet Image.
   3. Sammeln die Emission bei ausgewählten Wellenlänge, dann wählen Sie eine Auflösung von 512 × 512 Pixel und starten live imaging durch Drücken der Schaltfläche " Live ", das Gewinn-Niveau anpassen, je nach Bedarf (typische Gewinn beträgt rund 600 V).
   4. Definieren Sie Beginn und Ende der Z-Stapel durch die Konzentration auf die Oberseite der zebrafischembryonen Implantats zu und wählen Sie beginnen, dann verschieben Sie zur letzten Ebene, die im implantierten Thymus konzentriert werden und wählen Sie Ende. Verwenden einer Z-Schrittweite von 5 µm. Die Software berechnet automatisch die Anzahl der konfokalen Flugzeuge.
   5. Wählen Sie das Zeitintervall für den Erwerb von jedem Z-Stapel (in der Regel 1,5 bis 2 Sekunden) und wählen Sie die Option bis zum Stillstand gekommen zu erwerben , für die kontinuierliche Bildgebung.
9. Drücken Sie die Starttaste zu initialisieren .
10. Bild der Grafts wiederholt zu verschiedenen Zeitpunkten aus dem gleichen Tier durch Wiederholen der Schritte 3.1-3.9.
    Hinweis: Wenn das Tier Transplantate an beiden Augen hält, können durch Wiederholung der Schritte 3.2-3.9 nach dem Einschalten der aufrechten Position Seite der Maus Aufnahmen aus beiden Augen genommen werden.

Ergebnisse

Thymus von Neugeborenen Mäusen wurden isoliert von B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas Mäuse wie in diesem Protokoll (Schritte 1.1-1.9) beschrieben. In diesen transgenen Mäusen leitet Huhn Beta-Actin Promotor den Ausdruck der roten fluoreszierenden Proteins Variante DsRed. MST unter dem Einfluss von unmittelbaren frühen Enhancer Cytomegalovirus (CMV) Erleichterung der Verfolgung von Implantaten.

Zu verhindern Gewebe ...

Diskussion

Aufgrund der Bedeutung der T-Zell-Reifung für individuelle immun-Kompetenz⁴ und die mutmaßlichen Auswirkungen der Vorläufer Zelldynamik auf Reifen T-Zellen produziert die Thymusdrüse^2,3wurden umfangreiche Bemühungen investiert Alternativen zu den klassischen fixierte Gewebe Snapshot Ansatz zu entwickeln.

Obwohl Gewebe Scheiben und andere Explantaten deutlich überlegen bei der Reproduktion Gewebearchitektur...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA