激光扫描显微术实时跟踪眼球前室胸腺细胞

摘要

该协议的目的是通过激光扫描显微镜在小鼠眼前腔的胸腺植入物中显示胸腺细胞的纵向活体实时跟踪。角膜的透明度和移植的血管化允许持续记录祖细胞的招募和成熟的 T 细胞出口。

摘要

所提出的方法的目的是首次显示, 新生儿 thymi 移植到等基因系成年小鼠的前眼室,在体内纵向实时监测 thymocytes´动态在血管内胸腺段。在移植后, 激光扫描显微镜 (LSM) 通过角膜允许在体内无创重复成像的细胞分辨率水平。重要的是, 该方法增加了以前的活体 T 细胞成熟成像模型的可能性, 连续祖细胞招募和成熟的 T 细胞出口记录在同一动物。该系统的额外优点是移植区的透明度, 允许对植入组织进行宏观的快速监测, 以及植入物的可移植性, 除了系统治疗外, 还可以进行局部化处理。主要的限制是组织的体积, 适合在减少的空间的眼睛室, 要求裂片修剪。通过解剖胸腺裂片, 在先前显示为成熟 T 细胞生产功能的模式中, 器官完整性最大化。该技术可能适合于询问与胸腺功能相关的医学相关问题的环境, 包括自身免疫、免疫机能丧失和中枢耐受;仍然机械化的过程。对诱导胸腺细胞迁移、分化和选择的机制进行精细的解剖, 将会导致新的治疗策略以发展 T 淋巴细胞为目标。

引言

胸腺 t 细胞分化和 t 细胞亚群选择是发展和维持细胞介导免疫在脊椎动物¹的关键过程。这一过程涉及复杂有序的活动序列, 包括从血液中招募祖细胞, 增殖和迁移, 膜蛋白的差异表达, 以及大规模程序性细胞死亡的子集选择。其结果是, 成熟的 T 细胞的释放反应到丰富的外国抗原, 同时显示最小的反应, 自肽, 最终殖民的外围淋巴器官的个体^2,3。αβTCR 的异常胸腺细胞选择导致自身免疫性疾病或免疫失衡⁴ , 主要来源于在阴性或阳性前体选择过程中的缺陷。

胸腺胸腺的定向迁移是 T 细胞成熟的所有阶段的内在特性, 它被设想为一系列同时或连续的多重刺激, 包括趋化因子、粘合剂和脱粘细胞外基质 (ECM)。蛋白质相互作用^3,5。对固定组织的研究为胸腺微环境^5、6中胸腺细胞迁移线索的表达模式提供了关键信息, 而活体研究揭示了两种常见的胸腺细胞在两个组织学不同区域的迁移行为: 皮质缓慢随机运动, 髓质^{7,8,9,10,11,12,13}. 移徙率增加与胸腺阳性选择¹³相关, 阴性选择与爬行行为有关, 这一假说表明, 通过胸腺进行的旅程的动力学决定适当的胸腺细胞的成熟。尽管它们的相关性, 胸腺细胞间质细胞相互作用的拓扑结构和胸腺组织运动的动力学在器官微环境期间在 T 体细胞成熟仍然是未定义的。

迄今进行的大多数活体研究包括胎儿或 reaggregate 胸腺器官培养^14、15、组织切片或完整的胸腺叶外植体, 在那里胸腺细胞运动通过双光子激光扫描可视化。显微术 (TPLSM)⁸, 活体成像技术, 限制最大工作距离和成像深度1毫米根据组织检查¹⁶。与依赖于延长潜伏期形成3维结构的艰苦的胸腺器官培养相比, 胸腺切片技术和完整的胸腺叶方法允许控制引入预先标记的特定子集胸腺细胞进入一个本土的组织建筑环境。然而, 由于这些模型中没有血流, 它们显然仅限于研究胸腺沉降祖 (TSPs) 对胸腺实质的招募过程或成熟 T 细胞胸腺 egression 的动力学。

在活体模型中研究胸腺 T 细胞成熟生理学的小鼠包括移植的片段或整个器官裂片放置在肾囊¹⁷或 intradermally¹⁸。虽然这些选择显示了他们的效用, 以询问组织的系统性功能植入, 胸腺移植的位置在动物深处或覆盖层的不透明组织限制其使用在体内检查植入物TPLSM。

由于角膜的透明度, 眼睛的前腔提供了一个容易接近的空间, 直接监测任何接枝组织。的优势, 虹膜形成的室的基础是丰富的血管和自主神经的结局, 使移植的快速重建和神经^19,20。凯塞多博士在过去²¹成功地利用这个解剖空间进行胰岛的维持和纵向研究。在这里, 我们表明, 这一策略不仅是研究胸腺细胞在原生器官结构中的动力学的有效方法, 而且是唯一允许将体内纵向记录扩展到祖招募研究和成熟的 T 细胞 egression 的步骤在小鼠。

研究方案

迈阿密大学的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 根据 IACUC 指南批准了所有的实验。

1. 新生儿 Thymi 的分离和修整

1. 用热处理或其他方法制备所有试剂和仪器, 确保无菌条件。
2. 为了减少污染, 执行所有的手术程序在层流罩下。
3. 在 euthanizing 捐赠小鼠之前, 用无菌 prechilled 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 值 7.4) 填充60毫米无菌皿, 并将其放在冰上。它将用于冲洗和储存在移植前的捐赠小鼠切除 thymi。
4. 根据道德准则, 进行斩首, 弄死新生捐献小鼠。
5. 将鼠标放在无菌吸水纸巾上, 在背直立的位置和喷雾, 后擦拭, 鼠标腹部与70% 乙醇。
6. 通过在下腹部的水平上做一个表面的 V 形切口, 并用一对直10厘米的解剖剪刀在腹中线下切开皮肤, 在胸部水平处留下大约 0.5-1 厘米的开口, 从而暴露胸腔。折叠胸部两侧的皮肤, 以暴露胸腔。
7. 通过隔膜和胸腔用相同类型的剪刀使两个更深的 0.5-1 厘米侧切口进入前胸腔的上纵隔。胸腺应该出现在心脏上方的两个苍白的裂片上。
8. 将一组弯曲钳置于胸腺下方, 垂直拉拔, 提取完整的器官。用一副镊子防止胸腔保护。如有需要, 使用细钳在提取器官前, 小心撕除周围的结缔组织, 而不干扰胶囊。
   注意: 使用解剖范围有助于此步骤。
9. 将孤立的胸腺浸入冷不育的 1x PBS (pH 7.4), 以前显示为60毫米无菌皿, 并用手术刀切开连接峡, 以分离胸腺裂片。除去盘子里的杂物, 不伤害胶囊。为了尽量减少 thymi 暴露的时间, 在植入前修剪百里香裂片。
   注意: 每个孤立的新生儿胸腺通常会呈现六段约1毫米宽, 最多三宿鼠在接受植入物的两眼。
10. 对每个捐献者鼠标重复步骤 1.4-1.9。为了尽量减少 thymi 暴露的时间, 一次分离一个胸腺。

2. 胸腺植入眼前腔

1. 在移植之前, 标记并称每个收件人鼠标。
2. 使用 1-2% isofluorane 蒸气之间的剂量来麻醉接收鼠标。在开始手术前, 在脚趾捏后没有反射, 确保正确的麻醉。
3. 进行胸腺段移植术如下:
   1. 将鼠标置于侧侧卧位, 使一只眼睛面对直接接触到解剖范围的透镜。
   2. 在寒冷的 1x PBS (pH 7.4) 中, 一个孤立的胸腺裂片, 填充60毫米的盘子成片, 1 毫米宽度用于种植体。遵循一个曲折的模式, 以确保每个部分包含胸腺皮质和髓质。根据图 1A中提供的指南, 使用 vannas 剪刀进行修剪。
      注意: 应在植入前对胸腺进行修整, 以优化组织植入。
   3. 从与手术区对应的角膜基底开始, 引入40毫米 G18 针的尖端, 使小切口进入外角膜层, 从而可以介绍解剖剪刀尖端。
   4. 用 vannas 剪刀直接在角膜基底周围进行5-10 毫米侧切口, 同时保持角膜开放, 以防止重新封装。使用平端钳, 避免组织损伤。
   5. 抓住切口角膜上皮, 用一双平端钳抱住角膜, 并通过开口推胸腺段, 从而暴露开口。用无菌 1x PBS (pH 7.4) 或人工泪湿眼, 以防止组织干燥直到操作完成。
   6. 在眼睛表面轻轻按压, 将所介绍的组织段滑向侧向位置, 以保持 eye´s 功能。确保移植物位于眼睛开口对面的位置, 以防止因受欺负而产生的后向干扰。
   7. 借助扁钳, 按压牢固, 约3-5 秒, 两侧角膜张开互相促进自密封。手术不需要任何装订或缝纫。
4. 如果两只眼睛进行移植, 将鼠标翻转到相反的侧面, 直接将第二只眼睛暴露在解剖显微镜透镜上, 重复步骤 2.3. 2-2. 3.7。
5. 手术完成后, 用热灯将鼠标返回空笼 prewarmed。
6. 确保每只被移植的老鼠在把它放进与其他动物共享的笼子之前, 恢复完全的机动性和意识。这通常发生在1小时之内在手术以后。
7. 在移植时, 根据需要治疗小鼠止痛药, 并为小鼠在饮用水中浓度为1.6 毫克/毫升的乙酰氨基酚。
8. 对每个收件人鼠标重复步骤 2.2-2.9。
9. 监测术后动物活动以及植入的眼睛的外观, 以检测潜在的健康并发症。

3. 用3D 单光子荧光共聚焦显微镜对植入 Thymi 的共焦成像

1. 使用 1-2% isofluorane 蒸气之间的剂量麻醉接收鼠标。在开始成像过程前, 在脚趾捏后没有反射, 确保正确的麻醉
2. 将鼠标放在一个固定的舞台显微镜平台上, 在一侧的侧卧位置, 使一只眼睛朝上。在显微镜平台上放置一个热垫, 以确保在录音过程中小鼠的体温恒定。
   注: 有关详细信息, 请参阅辅助图 1 。
3. 将鼠标的头部插入一个立体定向的 headholder, 并调整旋钮, 以抑制鼠标头部在侧侧位置, 使显微镜的目标直接进入眼睛持有胸腺移植。
4. 将鼠标的鼻子放进防毒面具, 使动物在整个过程中被麻醉。这可以根据需要调整 isofluorane 蒸气。
5. 为了便于在录音过程中保持眼睛的稳定, 同时避免眼睑退缩, 在角膜边缘用一双镊子将眼睛拉回眼睑, 并将其贴在聚乙烯管上, 并附有UST-2 实心万向节。这种安排可以稳定的头部和眼睛的固定, 并提供灵活性, 不扰乱血液流动的眼睛, 如前所述²²。
   注:补充图 1B, C显示完整的组装。
6. 添加几滴不育的生理盐水或人工泪作为浸泡液之间的角膜和晶状体, 在把显微镜的目标放在鼠标的眼睛。
   注: 在整个过程中需要额外滴液, 以保持显微镜的路径和防止眼部干燥。
7. 首先使用低放大 (5X) 透镜定位胸腺在显微镜领域。然后切换到更高的分辨率 (10, 20 和 40X) 水浸泡浸渍目标与长的工作距离。使用最小激光功率, 尽量减少扫描时间, 避免光损伤和漂白胸腺植入物。这是通过使用显微镜的共振扫描仪来实现的。
   注: 我们使用的共焦显微镜配备有能够在25帧/秒内采集图像的共振扫描镜。其他品牌有自己的显微镜与共振扫描仪。
8. 使用显微镜软件选择采集模式, 并启动谐振扫描仪模式。然后选择 XYZT 成像模式并按如下方式配置采集设置:
   1. 旋转氩激光, 并调整功率为30% 的荧光激发。
   2. 选择励磁激光线, 并设置不同发射波长的声光分束器 (AOBS) 控制。此外, 为了检测背向散射和描绘组织结构, 同时使用反射检测。
      注: 选择一组用于励磁 (GFP 和 RFP) 的颜色时, AOBS 自动编程, 将这些励磁线引导到试样上, 并传输它们之间的发射。例如, 对于 GFP 和 RFP, 我们分别使用 488 nm 和561纳米的励磁光的窄反射带。这为发射荧光光子的收集提供了广泛的波段, 从而减少了对激光功率和采集时间的需求。在反射模式下, AOBS 被用作50/50 光束分配器, 用于在任何波长之外的图像反射光, 用于荧光发射检测。
   3. 收集在选定波长的发射, 然后选择一个分辨率的512×512像素, 并开始实时成像通过按下实时按钮, 调整增益水平, 根据需要 (典型的增益约 600 V)。
   4. 定义 z 堆栈的开始和结束, 重点放在胸腺种植体的顶端, 然后选择 "开始", 然后移动到最后一个可以聚焦在植入胸腺中的平面, 然后选择 "末端"。使用 z 步骤大小为5µm。该软件将自动计算共焦平面的数目。
   5. 选择获取每个 z 堆栈的时间间隔 (通常为1.5 到2秒), 然后选择 "获取",直到停止以进行连续成像。
9. 按 "开始" 按钮进行初始化。
10. 重复步骤 3.1-3.9, 在不同的时间从同一动物中反复成像移植物。
    注意: 如果动物在两只眼睛上都持有移植物, 可以通过重复步骤 3.2-3.9 在鼠标头部的直立位置一侧进行记录。

结果

从 B6 中分离出新生小鼠胸腺。Cg-Tg (CAG-DsRed * MST) 1 纳吉/雅小鼠如本议定书所述 (步骤 1.1-1.9)。在这些转基因小鼠中, 鸡β肌动蛋白启动子引导红荧光蛋白质变体 DsRed 的表达。MST 的影响下, 巨细胞病毒 (CMV) 立即早期增强促进跟踪植入物。

为防止组织排斥, 等基因系个体的基因型: C57BL/6-Tg (不列颠哥伦比亚荧光蛋白) 30 scha...

讨论

由于 T 细胞成熟过程对个体免疫能力⁴的重要性以及前体细胞动力学对胸腺^2、3所产生的成熟 T 细胞的推定影响, 已经投入了大量的努力。开发替代传统的固定组织快照方法。

虽然组织切片和其他外植体在再生组织结构上明显优于单分子膜或胸腺^14、15的总器官培养, 但由?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA