No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

Resumo

O objetivo do protocolo é mostrar longitudinal intravital acompanhamento em tempo real de timócitos por laser, microscopia em implantes do timo na câmara anterior do olho do rato. A transparência da córnea e vascularização do enxerto permitem gravar continuamente recrutamento de células progenitoras e egresso de células T maduro.

Resumo

O objetivo do método a ser apresentado é para mostrar, pela primeira vez, o transplante de recém-nascido thymi na câmara anterior do olho do isogénicas ratos adultos na vivo longitudinal monitoramento em tempo real da dinâmica de thymocytes´ dentro de um vascularizado segmento de timo. Após o transplante, laser, microscopia (LSM) através da córnea permite na vivo não invasiva imagens repetidas no nível celular resolução. Importante, a adiciona a maturação de células T intravital anterior modelos de imagem a possibilidade de recrutamento de células progenitoras contínua e gravações de egresso de células T maduras no mesmo animal. Vantagens adicionais do sistema são a transparência da área enxertada, permitindo monitoramento rápido macroscópico do tecido implantado, e a acessibilidade ao implante permitindo localizadas além de tratamentos sistémicos. A principal limitação, sendo o volume do tecido que se encaixa no espaço reduzido da câmara do olho que exige para o aparamento de lobo. Integridade do órgão é maximizada dissecando lobos do timo em padrões mostrados anteriormente para ser funcional para a produção de células T madura. A técnica é potencialmente adequada para interrogar um meio de clinicamente relevantes questões relacionadas com a função do Timo que incluem auto-imunidade, imunodeficiência e tolerância central; processos que permanecem mecanicamente mal definidos. A dissecação bem dos mecanismos orientadores timócitos migração, diferenciação e seleção deve levar a novas estratégias terapêuticas, visando o desenvolvimento de células T.

Introdução

Diferenciação de células T intratímica e seleção de subpopulação de células T constituem processos-chave para o desenvolvimento e a manutenção da imunidade mediada por células de vertebrados¹. Esse processo envolve uma sequência complexa de eventos firmemente organizados, incluindo o recrutamento de progenitores da corrente sanguínea, migração e proliferação celular, expressão diferencial de proteínas de membrana e morte celular programada maciça para subconjuntos seleção. O resultado é a liberação de T-células maduras reativas para um amplo espectro de antígenos estranhos ao exibir respostas minimizadas para autopeptídeos, que acabar-se colonizar os órgãos linfoides secundários do individual^2,3. Seleção de timócitos aberrante do repertório αβTCR leva à doença auto-imune ou desequilíbrio imune⁴ que derivam principalmente de defeitos durante os processos de seleção de precursor negativo ou positivo, respectivamente.

Migração direcional de timócitos através do timo é intrínseca a todas as fases de maturação de células T e é previsto como uma série de simultânea ou sequencial a vários estímulos, incluindo quimiocinas, adesivas, e adesivo de matriz extracelular (ECM) ^3,de interações proteína⁵. O estudo dos tecidos fixos tornou a informação crítica sobre os padrões de expressão de pistas migratórias de timócitos no microambiente tímico definidos^5,6, enquanto estudos ex vivo revelou dois prevalente comportamentos migratórios de timócitos em duas áreas histologicamente distintas do órgão: lento movimentos estocásticos no córtex e motilidade rápida, confinada na medula^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. aumento taxas migratórias correlacionam com selecção positiva do Timo¹³ e seleção negativa é associada com o comportamento de rastreamento apoiam a hipótese de que a cinética da viagem através do Timo determina o próprio maturação dos timócitos. Apesar de sua relevância, a topologia de interações de células estromais de timócitos e a dinâmica da motilidade de timócitos em microambiente do órgão durante a maturação de células T continua mal definida.

A maioria dos ex vivo estudos realizados até à data incluem fetais ou reaggregate órgão tímico culturas^14,15, fatias de tecido ou explantes lóbulo tímico intacta, onde os movimentos de timócitos são visualizados por varredura a laser de dois fotões microscopia (TPLSM)⁸, uma técnica de imagem intravital com um máximo restrito trabalhando a distância e profundidade de 1 mm de acordo com o tecido de imagem examinou¹⁶. Em contraste com as culturas de laborioso órgão do Timo que dependem de tempos de incubação prolongado para formar estruturas de 3D, ambos, a técnica de fatia do Timo e a introdução de autorização controlada de abordagem lóbulo tímico intacta de subconjuntos específicos de pre-rotulado timócitos em um ambiente de arquitetura do tecido nativo. No entanto, desde que o fluxo sanguíneo é ausente nestes modelos, eles são claramente limitados para estudar o processo de recrutamento de Timo resolução progenitores (TSPs) para o parênquima do timo ou a dinâmica de egression do timo de células T maduras.

Modelos in vivo para o estudo da fisiologia de maturação de células T do timo em ratos incluem os enxertos de fragmentos ou lóbulos de todo órgão colocados tanto no interior do rim cápsula¹⁷ ou¹⁸por via intradérmica. Embora essas opções mostraram sua utilidade para interrogar a enxertia funcional sistêmica do tecido, a posição dos enxertos tímicos profundamente dentro do animal ou cobertos por camadas de tecido opaco restringe seu uso para exame na vivo de implantes pela TPLSM.

Câmara anterior do olho fornece um espaço facilmente acessível para monitoramento direto de qualquer tecido enxertado em virtude da transparência das camadas da córnea. De vantagem, a base da câmara formada pela íris é rica em vasos sanguíneos e terminações nervosas autonômicas, permitindo rápida revascularização e reinervação dos enxertos^19,20. Dr. Caicedo tem utilizado com sucesso este espaço anatômico para a manutenção e o estudo longitudinal de ilhotas pancreáticas nos últimos²¹. Aqui, nós mostramos que esta estratégia não só constitui uma abordagem válida para estudar a dinâmica dos timócitos dentro da estrutura do órgão nativo, mas também excepcionalmente permite estender o na vivo gravações longitudinais para o estudo do recrutamento de progenitor e egression de células T madura passos em mouse.

Protocolo

O cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os experimentos de acordo com as diretrizes IACUC.

1. isolamento e corte de recém-nascido Thymi

1. Prepare todos os reagentes e instrumentos por autoclavagem ou outros métodos, garantindo condições estéreis.
2. Para minimizar as contaminações, execute todos os procedimentos cirúrgicos sob uma capa de fluxo laminar.
3. Antes da eutanásia ratos doador, encha um prato estéril de 60 mm com estéril prechilled 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4) e coloque-o no gelo. Ele irá ser usado para enxaguar e armazenar o thymi extirpado de ratos doador antes do transplante.
4. Proceda à eutanásia de ratos recém-nascido doador por decapitação, em conformidade com as diretrizes éticas.
5. Coloque o mouse sobre toalhas de papel absorvente estéril em uma posição ereta dorsal e spray e depois limpe, o abdômen de rato com etanol a 70%.
6. Expor a cavidade torácica, tornando-se uma incisão em forma de V superficial ao nível da parte inferior do abdome e cortar a pele com um par de reta 10cm dissecando a tesoura seguindo uma linha mediana ventral para deixar uma abertura de cerca de 0,5-1 cm no nível do peito. Dobre a pele ao longo de cada lado do peito para expor a cavidade torácica.
7. Faça dois mais profunda 0,5-1 cm incisões laterais através do diafragma e caixa torácica com o mesmo tipo de tesoura para acessar o mediastino superior na cavidade torácica anterior. O Timo deve aparecer como dois lóbulos pálidos bem acima do coração.
8. Coloque um conjunto de pinças curvas debaixo do Timo e puxar verticalmente para extrair os órgãos completa. Evitar a foldback da caixa torácica com um par de pinças. Se necessário, use a pinça fina cuidadosamente em pedaços o tecido conjuntivo em torno do órgão sem interromper a cápsula antes de extrair o órgão.
   Nota: Este passo é facilitado por meio de um escopo de dissecação.
9. Mergulhe o Timo isolado no frio estéril 1X PBS (pH 7,4) anteriormente exibidos em um prato de estéril de 60 mm e cortar o istmo conjuntivo com um bisturi para separar os lóbulos tímicos. Remova todos os restos do prato sem prejudicar a cápsula. Para minimizar o tempo thymi são expostos, aparar lóbulos de tomilho antes do implante.
   Nota: Cada isolado Timo recém-nascido normalmente processará seis segmentos de cerca de 1 mm de largura para um máximo de três ratos do anfitrião ao receber implantes em ambos os olhos.
10. Repita as etapas de 1,4-1,9 para cada rato do doador. Para minimizar o tempo thymi são expostos, isole um timo de cada vez.

2. Timo implantação em Câmara Anterior do olho

1. Antes do transplante, tag e pesar cada destinatário do mouse.
2. Use uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano para anestesiar o destinatário do mouse. Assegure a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
3. Prosseguir com o transplante de Timo segmentos como segue:
   1. Posicione o mouse em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima exposto diretamente para a lente do escopo dissecação.
   2. Um dos lóbulos tímicos isolados mentindo na frio 1X PBS (pH 7,4) impostos especiais de consumo-encheu o prato de 60 mm em pedaços com até 1 mm de largura para implante. Seguem um padrão zig-zag para garantir que cada segmento contém tímico córtex e medula. Use tesoura vannas para o aparamento de acordo com as orientações fornecidas na figura 1A.
      Nota: A remoção do Timo deve ser feita antes do implante para otimizar a enxertia de tecido.
   3. Começando na base da córnea correspondente à área cirúrgica, introduza a ponta de uma agulha de 40mm G18 tornar-se uma pequena incisão em camadas externas córnea para que a ponta de uma tesoura a dissecação pode ser introduzida.
   4. Fazer um 5-10 mm flanco incisão diretamente ao redor da base da córnea usando tesoura vannas, mantendo a abertura da córnea firmemente para impedir que efectuou. Use pinça com as extremidades planas para evitar danos aos tecidos.
   5. Segure o epitélio corneano corte e expor a abertura mantendo a córnea com um par de pinças de cerdas chatas, enquanto empurrando um segmento do Timo através da abertura. Molhe o olho com estéril 1X PBS (pH 7,4) ou lágrimas artificiais como necessário para evitar a dessecação do tecido até a manipulação está completa.
   6. Pressione suavemente na superfície do olho para deslizar o segmento de tecido introduzido para uma posição lateral em relação ao aluno a preservar a função eye´s. Garantir que o enxerto se encontra em uma posição oposta do olho abertura para impedir a interferência posterior com imagem latente, trote.
   7. Com o auxílio de pinça plana, pressione com firmeza, para aproximadamente 3-5 s, os dois lados da abertura da córnea uns contra os outros para promover Auto-selante. A cirurgia não requer qualquer grampeamento ou costura.
4. Se os transplantes são realizados em ambos os olhos, vire o mouse do lado lateral oposto diretamente expor o segundo olho para a lente do microscópio dissecação e repita etapas 2.3.2-2.3.7.
5. Após a cirurgia está concluída, retorne o mouse para uma gaiola vazia pré-aquecido com uma lâmpada de calor.
6. Certifique-se de que cada rato transplantado recupera a mobilidade completa e consciência antes de colocá-lo em uma gaiola, compartilhada com outros animais. Isto normalmente ocorre dentro de 1h após a cirurgia.
7. Após transplante, tratar os ratos com analgésicos conforme necessário e fornecer os ratos com paracetamol em uma concentração de 1,6 mg/mL na água potável.
8. Repita as etapas 2.2-2,9 para cada destinatário do mouse.
9. Monitor de atividade animal no pós-operatório, bem como a aparência dos olhos implantados para detectar possíveis complicações de saúde.

3. confocal Imaging de Thymi implantado usando 3D único fóton fluorescência microscopia Confocal

1. Anestesia o mouse destinatário usando uma dose entre 1-2% dos vapores isofluorano. Assegurar a adequada anesthetization pela ausência de reflexo seguinte pitada de dedo do pé antes de iniciar o procedimento de imagem
2. Posicione o mouse na plataforma de microscópio palco fixo em uma posição reclinada lateral de lado para que um olho é virado para cima. Uma almofada de calor é colocada na plataforma do microscópio para assegurar a temperatura corporal constante de ratos durante as gravações.
   Nota: Consulte complementar Figura 1 para obter detalhes.
3. Insira a cabeça do rato um headholder estereotáxica e ajuste o botão para conter a cabeça de rato em uma posição lateral lado permitindo o acesso directo do objectivo microscópio de olhos segurando o enxerto do timo.
4. Coloque o focinho de rato em uma máscara de gás para manter o animal anestesiado durante todo o processo. Isto permite a regulagem de vapores isofluorano conforme necessário.
5. Para facilitar a estabilização do olho durante as gravações, evitando a retração das pálpebras, puxe para trás as pálpebras, mantendo o olho à margem da córnea com um par de pinças que têm suas dicas cobertas por um tubo de polietileno, que estão ligados a um UST-2 sólida junção universal. Esta disposição permite uma fixação firme da cabeça e do olho e fornece flexibilidade sem interrupção do fluxo de sangue no olho, como descrito anteriormente,²².
   Nota: Complementar figuras 1B, C mostrar o conjunto completo.
6. Adicione algumas gotas de lágrimas artificiais ou Salinas estéril como o líquido de imersão entre a córnea e a lente, antes de colocar o objetivo do microscópio no olho do rato.
   Nota: gotas adicionais são dispensadas na necessidade durante todo o procedimento para manter o caminho de microscópio e impedir a secagem do olho.
7. Primeiro use lente de baixa ampliação (5x) para localizar o Timo no campo do microscópio. Em seguida, alternar para imersão de água mais alta resolução (10, 20 e 40 X) mergulhando objectivos com longa distância de trabalho. Evite LSM Fotodano e branqueamento do implante do timo, aplicando o poder do laser mínima e reduzir o tempo de digitalização tanto quanto possível. Isto é conseguido usando o scanner de ressonância do microscópio.
   Nota: O microscópio confocal que usamos é equipado com espelhos de varredura ressonantes capazes de recolher imagens em 25 frames/s. Outras marcas têm seus próprios microscópios com scanners de ressonância.
8. Selecione o modo de aquisição, utilizando o software do microscópio e iniciar o modo de scanner ressonante. Em seguida, escolher o modo de imagem XYZT e configurar as configurações de aquisição como segue:
   1. Ligar o laser de argônio e ajustar o poder de 30% para a excitação da fluorescência.
   2. Escolha uma linha de laser de excitação e definir o controle de splitter (AOBS) feixe óptico-acústico para comprimentos de onda de emissão diferentes. Além disso, para detectar retroespalhamento e delinear a estrutura do tecido, use a detecção de reflexão simultaneamente.
      Nota: Ao selecionar um conjunto de cores para a excitação (GFP e RFP), o AOBS é automaticamente programado para direcionar estas linhas de excitação para o espécime e transmitir a emissão entre eles. Por exemplo, para as boas práticas agrícolas e RFP, usamos bandas estreitas de reflexão para luz de excitação em 488 nm e 561 nm, respectivamente. Isto deixa grandes bandas para a coleção de fótons fluorescência emitida, reduzindo assim a necessidade de tempo de poder e aquisição do laser. No modo de reflexão, o AOBS é usado como um divisor de feixe 50/50 para luz refletida em qualquer comprimento de onda longe aqueles utilizados para a detecção de emissão de fluorescência da imagem.
   3. Coletar a emissão no comprimento de onda selecionado, em seguida, selecione uma resolução de 512 × 512 pixels e começar ao vivo de imagem pressionando o botão Live , ajustando os níveis de ganho, conforme necessário (ganho típico é de cerca de 600 V).
   4. Definir o início e fim da z-pilha, centrando-se no topo do implante do Timo e selecione Iniciare, em seguida, mover para o último avião que pode ser focado no timo implantado e selecione final. Use um tamanho de passo-z de 5 µm. O software automaticamente irá calcular o número de aviões confocal.
   5. Escolher o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha-z (normalmente 1,5 a 2 segundos) e selecione a opção de adquirir, até que parou para a imagem latente contínua.
9. Pressione o botão Iniciar para inicializar.
10. Imagem os enxertos repetidamente em momentos diferentes do mesmo animal, repetindo as etapas 3.1-3.9.
    Nota: Se o animal possui enxertos em ambos os olhos, gravações do olho também podem ser tomadas por repetir passos 3.2-3.9 após a mudança do lado da posição ereta da cabeça do rato.

Resultados

Timo de camundongos recém-nascidos foram isoladas a partir B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas ratos, conforme descrito no presente protocolo (etapas 1,1-1,9). Nestes ratos transgénicos, o promotor do frango beta actina direciona a expressão da variante da proteína fluorescente vermelha DsRed. MST sob a influência do realçador início imediato citomegalovírus (CMV), facilitando o rastreamento dos implantes.

Para e...

Discussão

Devido a importância do processo de maturação de células T de competência imunológica individual⁴ e o presumível impacto da dinâmica de célula precursora na T-células maduras, produzidas pela Timo^2,3, grandes esforços foram investidos desenvolver alternativas para a abordagem de instantâneo clássico tecido fixo.

Apesar de fatias de tecido e outros explantes são claramente superiores em reproduzir a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA