Real Time In Vivo suivi des Thymocytes dans la chambre antérieure de le œil par microscopie à balayage Laser

Résumé

L’objectif du protocole est de montrer longitudinale intravitale suivi en temps réel des thymocytes par laser, microscopie dans les implants du thymus dans la chambre antérieure de l’oeil de la souris. La transparence de la cornée et la vascularisation du greffon permettant pour l’enregistrement en continu de recrutement de cellules progénitrices et évacuation des lymphocytes mature.

Résumé

L’objectif de la méthode présentée est de montrer, pour la première fois, la greffe du nouveau-né thymi dans le compartiment antérieur de le œil de souris adultes isogéniques pour in vivo longitudinal suivi en temps réel de thymocytes´ dynamique dans un vascularisé segment du thymus. Après la transplantation, laser, microscopie (LSM) à travers la cornée permet en vivo imagerie répétés non invasive au niveau cellulaire de la résolution. Ce qui est important, l’approche ajoute au précédente maturation des lymphocytes intravitale imagerie modèles la possibilité pour le recrutement de cellules progénitrices continu et enregistrements de sortie lymphocytes matures chez le même animal. Avantages supplémentaires du système sont la transparence de la zone greffée, permettant une surveillance rapide macroscopique des tissus implantés, et l’accessibilité à l’implant permettant localisés en plus de traitements systémiques. La principale limite est le volume du tissu qui s’inscrit dans l’espace réduit de la chambre de le œil qui exige pour que la suppression du lobe. Intégrité de l’organe est maximisée en disséquant des lobes de thymus chez les patrons déjà montrés pour être fonctionnel pour la production de lymphocytes T mature. La technique est potentiellement adaptée pour interroger un milieu de médicalement des questions liées à la fonction du thymus qui incluent l’auto-immunité, l’immunodéficience et tolérance centrale ; processus qui restent mécaniquement mal définis. La dissection fine des mécanismes guidant la sélection, la différenciation et la migration des thymocytes devrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les cellules T en développement.

Introduction

Intrathymique différenciation des lymphocytes T et sélection de sous-populations de lymphocytes T constituent des processus clés pour le développement et le maintien de l’immunité à médiation cellulaire dans les vertébrés¹. Ce processus implique une séquence complexe d’événements étroitement organisés y compris le recrutement des progéniteurs de circulation sanguine, la prolifération cellulaire et migration, expression différentielle des protéines membranaires et la mort cellulaire programmée massives pour des sous-ensembles sélection. Le résultat est la libération des lymphocytes T matures réactives à un ample spectre d’antigènes étrangers tout en affichant les réponses réduites aux auto-peptides, dont fin-up coloniser les organes lymphoïdes périphériques des individuels^2,3. Sélection de thymocytes aberrante du répertoire αβTCR mène à une maladie auto-immune ou de déséquilibre immunitaire⁴ qui dérivent principalement de défauts au cours du processus de sélection positive ou négative précurseur, respectivement.

Migration directionnelle des thymocytes dans le thymus est inhérente à tous les stades de la maturation des lymphocytes T et il est envisagé comme une série de simultanée ou séquentielle des stimuli multiples, y compris les chimiokines, adhésif, et colle la matrice extracellulaire (ECM) interactions de protéine^3,5. L’étude des tissus fixés a rendu les informations essentielles concernant les modes d’expression pour les piles migrateurs thymocyte microenvironnements thymique défini^5,6, tandis que des études ex vivo a révélé deux répandu les comportements migratoires des thymocytes dans deux zones distinctes sur le plan histologique de l’organe : ralentir les mouvements stochastiques dans le cortex et la motilité rapide, confinée dans le bulbe rachidien^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. augmentation taux migratoires sont en corrélation avec la sélection positive du thymus¹³ et une sélection négative est associé au comportement rampant supporte l’hypothèse que la cinétique du voyage à travers le thymus détermine propre maturation des thymocytes. Malgré leur importance, la topologie des interactions entre les cellules stromales-thymocyte et la dynamique de la motilité des thymocytes travers microenvironnements orgue durant la maturation des lymphocytes reste mal définie.

La plupart ex vivo études réalisées à ce jour incluent foetales ou regroupement d’organe thymique cultures^14,15, tranches de tissu ou des explants de lobe thymique intacte où les mouvements de thymocytes sont visualisées par deux photons laser à balayage microscopie (TPLSM)⁸, une technique d’imagerie intravitale restreint maximum distance de travail et d’imagerie profondeur de 1 mm selon le tissu examiné¹⁶. Par contraste avec les cultures d’organe thymique laborieux qui dépendent du temps d’incubation prolongée pour former des structures 3D-, fois, la technique de la tranche du thymus et l’introduction de permis contrôlé approche lobe thymique intact des sous-ensembles spécifiques du pré étiquetés thymocytes dans un environnement d’architecture native de tissu. Toutefois, étant donné que le débit sanguin est absent dans ces modèles, ils sont clairement limitées pour l’étude du processus de recrutement du thymus décantation progéniteurs (FST), le parenchyme du thymus ou la dynamique de l’égression thymique des lymphocytes T matures.

In vivo modèles pour l’étude de la physiologie de la maturation lymphocytes thymique chez les souris comprennent les greffons de fragments ou lobes organe entier placés soit à l’intérieur de la capsule rénale¹⁷ ou par voie intradermique¹⁸. Bien que ces options ont montré leur utilité pour interroger systémique fonctionnelle greffe des tissus, la position des greffes thymiques profonds au sein de l’animal ou recouverts par des couches de tissu opaque limite leur utilisation pour l’examen in vivo des implants par TPLSM.

La chambre antérieure de le œil offre un espace facilement accessible pour un contrôle direct de n’importe quel tissu greffé en vertu de la transparence des couches de la cornée. D’avantage, la base de la cavité formée par l’iris est riche en vaisseaux sanguins et les terminaisons nerveuses autonomes, permettant une revascularisation rapide et la réinnervation des greffes^19,20. Dr. Caicedo a utilisé avec succès cet espace anatomique pour l’entretien et l’étude longitudinale des îlots pancréatiques dans le passé²¹. Ici, nous montrons que cette stratégie constitue non seulement une approche valable pour étudier la dynamique des thymocytes au sein de la structure native orgue, mais également unique permet d’étendre l' in vivo des enregistrements longitudinales à l’étude du recrutement de l’ancêtre et égression de lymphocytes T mature étapes chez la souris.

Protocole

L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et d’institutionnels animalier a approuvé toutes les expériences conformément aux lignes directrices IACUC.

1. isolement et rasage de nouveau-né barigoule

1. Préparer tous les réactifs et les instruments par autoclavage ou d’autres méthodes, en s’assurant des conditions stériles.
2. Pour minimiser les contaminations, effectuer toutes les interventions chirurgicales sous une hotte à flux laminaire.
3. Avant d’euthanasier les souris donneur, remplir un récipient stérile de 60 mm avec stérile prérefroidies 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) et placez-le sur la glace. Il servira pour le rinçage et stocker la thymi excisé chez des souris de donateurs avant la transplantation.
4. Passez à euthanasier des souris nouveau-nées donneur par décapitation, conformément aux lignes directrices éthiques.
5. Placez votre souris sur des serviettes en papier absorbant stérile dans une dorsale en position verticale et de pulvérisation et plus tard essuyer, l’abdomen de la souris avec l’éthanol à 70 %.
6. Exposer la cavité thoracique par une incision superficielle en forme de V au niveau du bas-ventre et couper la peau avec une paire de droite 10 cm dissection ciseaux après une médiane ventrale à laisser une ouverture d’environ 0,5 à 1 cm au niveau de la poitrine. Repliez la peau de chaque côté de la poitrine pour exposer la cavité thoracique.
7. Faire deux profondes 0,5-1 cm incisions latérales à travers la membrane et de la cage thoracique avec le même type de ciseaux pour accéder le médiastin supérieur dans la cavité thoracique antérieure. Le thymus doit apparaître comme deux lobes pâles juste au-dessus du cœur.
8. Place un ensemble de pince courbée sous le thymus et la traction verticale pour extraire l’organe complet. Prévenir le repli de la cage thoracique avec une paire de pinces. Si nécessaire, utilisez des pinces fines pour soigneusement déchirer le tissu conjonctif qui entoure l’organe sans perturber la capsule avant l’extraction de l’organe.
   Remarque : Cette étape est facilitée en utilisant une dissection étendue.
9. Submerger le thymus isolé dans froid stérile 1 x PBS (pH 7,4) précédemment affichées dans un récipient stérile de 60 mm et couper l’isthme conjonctive avec un scalpel pour séparer les lobes thymiques. Enlever tous les débris de la capsule sans nuire à la capsule. Pour réduire le temps thymi affleurent, garniture lobes thym juste avant l’implant.
   Remarque : Chaque isolés thymus nouveau-né rendra généralement six segments d’environ 1 mm de large pour un maximum de trois souris hôte lors de la réception des implants dans les deux yeux.
10. Répétez les étapes 1,4 à 1,9 pour la souris de chaque donateur. Pour réduire le temps thymi affleurent, isoler un thymus à la fois.

2. thymus Implantation dans la chambre antérieure de l’oeil

1. Avant la transplantation, tag et peser chaque souris destinataire.
2. Utilisez une dose entre 1 et 2 % des vapeurs d’isofluorane à anesthésier la souris destinataire. Assurer la bonne anesthetization par l’absence de réflexe pincée d’orteil suivantes avant de commencer l’intervention chirurgicale.
3. Procéder à la greffe de thymus segments comme suit :
   1. Placez votre souris dans une position couchée latérale côté afin qu’un oeil vers le haut directement exposés à l’objectif de l’étendue de la dissection.
   2. L’accise un des lobes thymiques isolées se trouvant dans du PBS 1 x contre le rhume (pH 7,4)-rempli plat 60 mm en morceaux jusqu'à 1 mm de largeur pour l’implant. Suivent un modèle zigzag pour s’assurer que chaque segment contienne la médulla et le cortex thymique. Utiliser des ciseaux de vannas pour tailler selon les directives fournies dans la Figure 1 a.
      NOTE : Parage du thymus devrait être fait juste avant l’implant afin d’optimiser la prise de greffe de tissus.
   3. À partir de la base de la cornée correspondant à la zone chirurgicale, introduire la pointe d’une aiguille de 40 mm G18 pour faire une petite incision dans les couches de la cornée externe pour que la pointe de ciseaux dissection peut être introduite.
   4. Faire un 5-10 mm incision directement autour de la base de la cornée à l’aide de ciseaux de vannas tout en maintenant l’ouverture de la cornée fermement prévient-on rescellement de flanc. Utiliser des pinces avec extrémités plates afin d’éviter des lésions tissulaires.
   5. Saisir la coupe de l’épithélium cornéen et exposer l’ouverture par la tenue de la cornée avec une paire de pinces à plat tout en poussant un segment thymique par l’ouverture. Mouillez le œil avec stérile 1 x PBS (pH 7,4) ou des larmes artificielles au besoin pour empêcher la dessiccation des tissus jusqu'à ce que la manipulation est terminée.
   6. Appuyez doucement sur la surface de le œil pour glisser le segment tissu introduites à une position latérale par rapport à l’élève pour préserver la fonction eye´s. Veiller à ce que la greffe se trouve à un emplacement en face de l’oeil ouverture pour éviter les interférences postérieur avec l’imagerie de bizutage.
   7. À l’aide d’une pince plate, appuyez fermement, pour environ 3-5 s, les deux côtés de l’ouverture de cornée uns contre les autres pour promouvoir auto-obturant. La chirurgie ne nécessite pas d’agrafage ou couture.
4. Si les greffes sont effectuées sur les deux yeux, tourner la souris sur le côté latéral opposé directement exposer le deuxième œil à l’objectif de microscope dissection et répéter les étapes 2.3.2-2.3.7.
5. Une fois l’opération terminée, retourner la souris à une cage vide préchauffée avec une lampe chauffante.
6. Assurez-vous que chaque souris transplantées retrouve une mobilité complète et conscience avant de le placer dans une cage, partagée avec d’autres animaux. Ceci a généralement lieu à 1 h après la chirurgie.
7. Lors de la transplantation, traiter les souris avec des analgésiques, selon les besoins et fournir les souris avec de l’acétaminophène à une concentration de 1,6 mg/mL dans l’eau potable.
8. Répétez les étapes 2,2 à 2,9 pour la souris de chaque destinataire.
9. Suivi post-opératoire activité animale ainsi que l’apparence des yeux implantés pour détecter les complications potentielles de santé.

3. confocal imagerie de barigoule implantés à l’aide de 3D unique Photon Fluorescence microscopie confocale

1. Anesthésier la souris destinataire en utilisant une dose entre 1 et 2 % des vapeurs isofluorane. Assurer le bonne anesthetization par l’absence de réflexe pincée d’orteil suivantes avant de commencer la procédure d’imagerie
2. Placez votre souris sur une plate-forme de microscope de scène fixe en position couchée latérale côté afin qu’un oeil vers le haut. Une bouillote est placé sur la plate-forme de microscope pour température corporelle constante des souris lors des enregistrements.
   Remarque : Voir figure1 supplémentaire pour plus de détails.
3. Insérer la tête de la souris dans un headholder stéréotaxique et réglez le bouton pour retenir la tête de la souris sur une position latérale permettant un accès direct de l’objectif de microscope à l’oeil, tenant la greffe de thymus.
4. Placez le museau de la souris dans un masque à gaz pour garder l’animal anesthésié tout au long de la procédure. Cela permet l’ajustement des vapeurs d’isofluorane selon les besoins.
5. Afin de faciliter la stabilisation de l’oeil pendant les enregistrements tout en évitant la rétraction des paupières, tirez les paupières tout en maintenant le œil à la marge de la cornée avec une paire de pincettes qui ont leur extrémité couverte par un tube de polyéthylène qui sont attachés à un UST-2 cardan solide. Cette disposition permet une fixation stable de la tête et les yeux et offre une souplesse sans interruption de la circulation sanguine dans les yeux, comme précédemment décrit²².
   NOTE : Les chiffres supplémentaires 1 b, C montrent l’ensemble complet.
6. Ajouter quelques gouttes des larmes artificielles ou de solution salines stériles comme le liquide d’immersion entre la cornée et la lentille, avant de placer l’objectif de microscope sur l’oeil de la souris.
   Remarque : autres pentes sont dispensés sur nécessité tout au long de la procédure pour garder le chemin de microscope et éviter le dessèchement des yeux.
7. Utilisez d’abord la lentille de faible grossissement (X 5) pour localiser le thymus dans le champ du microscope. Basculez ensuite sur l’immersion en eau supérieure résolution (10, 20 et 40 X) trempage des objectifs à longue distance de travail. Éviter le photovieillissement de la LSM et le blanchiment de l’implant thymique en appliquant la puissance du laser minime et réduire le temps de balayage autant que possible. Ceci est réalisé à l’aide de l’analyseur de résonance du microscope.
   Remarque : La microscopie confocale, que nous utilisons est équipée de miroirs de balayage résonants capables de recueillir des images à 25 images/s. D’autres marques ont leurs propre microscopes avec les scanners de résonance.
8. Sélectionnez le mode d’acquisition en utilisant le logiciel de microscope et démarrez le mode scanner résonance. Puis choisissez le mode d’imagerie XYZT et configurer les paramètres d’acquisition comme suit :
   1. Le laser à Argon et régler la puissance à 30 % pour l’excitation de fluorescence.
   2. Choisissez une excitation laser ligne et définir le contrôle splitter (AOBS) de faisceau acousto-optique pour les longueurs d’onde d’émission différents. En outre, afin de détecter la rétrodiffusion et définissent la structure des tissus, utiliser la détection de réflexion en même temps.
      Remarque : Lorsque vous sélectionnez un jeu de couleurs pour l’excitation (GFP et DP), le AOBS est automatiquement programmé pour diriger ces lignes d’excitation sur l’échantillon et de transmettre les émissions entre eux. Par exemple, pour GFP et DP, nous utilisons des bandes étroites de réflexion pour la lumière d’excitation environ 488 nm et 561 nm, respectivement. Cela laisse de larges bandes pour la collecte des photons de fluorescence émise, réduisant ainsi le besoin pour laser de puissance et l’acquisition de temps. En mode de réflexion, le AOBS est utilisé comme un séparateur de faisceau 50/50 à l’image de la lumière réfléchie dans toute longueur d’onde de ceux utilisés pour la détection par fluorescence d’émission.
   3. Recueillir l’émission à longueur d’onde sélectionnée, puis sélectionnez une résolution de 512 × 512 pixels et commencer direct imaging en appuyant sur le bouton Live , en ajustant les niveaux de gain au besoin (gain typique est environ 600 V).
   4. Définir le début et la fin de la z-pile en mettant l’accent sur le haut de l’implant thymique et sélectionnez commencer, puis passer au dernier plan peut se concentrer dans le thymus implanté et sélectionnez fin. Utilisez une taille de z-étape de 5 µm. Le logiciel calculera automatiquement le nombre d’avions confocale.
   5. Choisir l’intervalle de temps pour l’acquisition de chaque pile-z (en général, 1,5 à 2 secondes) et sélectionnez l’option d’acquérir jusqu'à l’arrêt pour imagerie continu.
9. Appuyez sur la touche Start pour initialiser.
10. Image à plusieurs reprises les greffons dans le temps le même animal en répétant les étapes 3.1 à 3.9.
    Remarque : Si l’animal possède des greffes sur les deux yeux, enregistrements de chaque œil peuvent être prises en répétant les étapes 3.2 à 3.9 après le passage du côté de la position verticale de la tête de la souris.

Résultats

Thymus des souris nouveau-nées ont été isolés de B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas souris comme décrit dans le présent protocole (étapes 1.1 à 1.9). Chez ces souris transgéniques, le promoteur de l’actine beta poulet dirige l’expression de la variante de la protéine fluorescente rouge DsRed. MST sous l’influence de l’enrichisseur début immédiat de cytomégalovirus (CMV) facilitant le suivi des implants.

Discussion

En raison de l’importance du processus de maturation des lymphocytes pour chaque compétence immunitaire⁴ et de l’impact présumé de dynamique cellule précurseur sur les T-cellules matures produites par le thymus^2,3, des efforts considérables ont été investis pour développer des solutions de rechange à l’approche ponctuelle classique tissu fixe.

Bien que les tranches de tissus et autres explants son...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA