Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

Riepilogo

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Abstract

Lo scopo del metodo viene presentato è quello di mostrare, per la prima volta, il trapianto del neonato thymi nella camera anteriore dell'occhio di topi adulti isogeniche per in vivo longitudinale monitoraggio in tempo reale di thymocytes´ dinamiche all'interno di un vascolarizzato segmento di timo. Dopo il trapianto, microscopia (LSM) attraverso la cornea a scansione laser permette in vivo imaging ripetuti non invadente a livello cellulare ad alta risoluzione. D'importanza, l'approccio aggiunge alla maturazione delle cellule T videomicroscopia precedenti modelli di imaging la possibilità per il reclutamento di cellule progenitrici continuo e maturo della T-cellula egress registrazioni nello stesso animale. Ulteriori vantaggi del sistema sono la trasparenza dell'area innestata, permettendo il monitoraggio rapido macroscopica del tessuto impiantato, e l'accessibilità all'impianto consentendo localizzati oltre ai trattamenti sistemici. La limitazione principale essendo il volume del tessuto che si inserisce nello spazio ridotto della camera occhio che esige per il taglio del lobo. L'integrità dell'organo è massimizzata da lobi del timo in modelli precedentemente indicati per essere funzionale per la produzione di T-cellula matura di dissezione. La tecnica è potenzialmente adatta per interrogare un milieu di clinicamente rilevanti questioni relazionati alla funzione del timo che includono l'autoimmunità, immunodeficienza e tolleranza centrale; processi che rimangono meccanicistico scarsamente definiti. La raffinata dissezione dei meccanismi guida timociti migrazione, differenziazione e selezione dovrebbe portare a nuove strategie terapeutiche in via di sviluppo le cellule di T di targeting.

Introduzione

Intratimica differenziazione a cellula T e selezione sottopopolazione di cellule T costituiscono processi chiave per lo sviluppo e la manutenzione di immunità cellulo-mediata in vertebrati¹. Questo processo coinvolge una complessa sequenza di eventi strettamente organizzati, tra cui il reclutamento dei progenitori dal flusso sanguigno, la proliferazione e la migrazione, l'espressione differenziale di proteine di membrana e la morte cellulare programmata massiccia per sottoinsiemi selezione. Il risultato è il rilascio di cellule T mature reattive ad un ampio spettro di antigeni estranei durante la visualizzazione ridotta a icona risposte a self-peptidi, che finiscono colonizzare gli organi linfoidi periferici delle singole^2,3. Selezione di timociti aberrante del repertorio αβTCR conduce alla malattia autoimmune o squilibrio immunitario⁴ che derivano principalmente da difetti durante i processi di selezione precursore positivo o negativo, rispettivamente.

Migrazione direzionale di timociti attraverso il timo è intrinseco a tutte le fasi di maturazione delle cellule T ed è concepito come una serie di simultanea o sequenziale stimoli multipli, tra cui chemochine, adesive, e de-adesivo della matrice extracellulare (ECM) proteina interazioni^3,5. Lo studio dei tessuti fissi ha reso informazioni critiche per quanto riguarda i modelli di espressione per stecche migratori timociti in microambienti timica definiti^5,6, mentre gli studi ex vivo ha rivelato due prevalente i comportamenti migratori dei timociti in due aree istologicamente distinte dell'organo: slow stochastic movimenti nella corteccia e motilità veloce, confinate nel midollo^{7,8,9,10 , 11 , 12 , 13}. aumento tassi migratori correlano con selezione timica positiva¹³ e selezione negativa è associato con comportamento strisciante, supportando l'ipotesi che la cinetica del viaggio attraverso il timo determina il corretto maturazione dei timociti. Nonostante la loro rilevanza, la topologia delle interazioni delle cellule stromal timociti e le dinamiche della motilità di timociti attraverso microambienti organo durante la maturazione delle cellule T rimangono mal definite.

Maggior parte degli studi ex vivo eseguita fino ad oggi includono fetale o ricongiungessero organo timico culture^14,15, fettine di tessuto o espianti di lobo timico intatto cui movimenti di timociti sono visualizzati da scansione laser del due-fotone microscopia (TPLSM)⁸, una tecnica di imaging videomicroscopia con un massimo limitato, distanza di lavoro e profondità di 1 mm in conformità con il tessuto di imaging ha esaminato¹⁶. In contrasto con le culture di organo timico laborioso che dipendono dai tempi di incubazione estesa a formare 3D-strutture, entrambi, la tecnica di fetta timica e l'introduzione di permesso controllata di approccio lobo timico intatto di sottoinsiemi particolari dei pre-etichettata timociti in ambienti dall'architettura tessuto nativo. Tuttavia, poiché il flusso sanguigno è assente in questi modelli, sono chiaramente limitati per lo studio del processo di reclutamento del timo sedimentazione dei progenitori (TSPs) al parenchima del timo o le dinamiche di egression timica dei linfociti T maturi.

Modelli in vivo per lo studio della fisiologia di maturazione delle cellule T timica in topi includono gli innesti di frammenti o lobi intero organo collocati sia all'interno della capsula renale¹⁷ o per via intradermica¹⁸. Anche se queste opzioni hanno mostrato la loro utilità per interrogare engraftment sistemico funzionale del tessuto, la posizione degli innesti timici profondi all'interno dell'animale o coperti da strati di tessuto opaco limita il loro uso per esame in vivo degli impianti di TPLSM.

La camera anteriore dell'occhio fornisce uno spazio facilmente accessibile per il monitoraggio diretto di qualsiasi tessuto innestato in virtù della trasparenza di strati corneali. Di vantaggio, la base della camera formata dall'iride è ricca di vasi sanguigni e terminazioni nervose autonomiche, consentendo la rapida rivascolarizzazione e reinnervazione del innesti^19,20. Dr. Caicedo ha utilizzato con successo questo spazio anatomico per la manutenzione e lo studio longitudinale degli isolotti pancreatici nel passato²¹. Qui, indichiamo che questa strategia non solo costituisce un valido approccio per studiare la dinamica dei timociti all'interno della struttura nativa dell'organo, ma anche in modo univoco consente di estendere l' in vivo longitudinale registrazioni allo studio del reclutamento di cellule progenitrici e passaggi di egression cellula T maturi nel topo.

Protocollo

L'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) dell'Università di Miami ha approvato tutti gli esperimenti secondo linee guida IACUC.

1. isolamento e guarnizione del neonato Thymi

1. Preparare tutti i reagenti e strumenti di sterilizzazione in autoclave o altri metodi, garantendo condizioni di sterilità.
2. Per minimizzare le contaminazioni, eseguire tutte le procedure chirurgiche sotto cappa a flusso laminare.
3. Prima dell'eutanasia topi donatore, riempire un piatto sterile di 60mm con sterile prechilled 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) e posizionarlo sul ghiaccio. Servirà per il risciacquo e memorizzare il thymi asportato da topi di donatore prima del trapianto.
4. Procedere alla eutanasia topi neonati donatore per decapitazione, conformemente agli orientamenti etici.
5. Posizionare il mouse sui tovaglioli di carta assorbente sterile in una dorsale in posizione verticale e spray e poi pulire, l'addome del mouse con etanolo al 70%.
6. Esporre la cavità toracica con un'incisione a forma di V superficiale a livello dell'addome inferiore e tagliare la pelle con un paio di cm 10 dritti per dissezione Forbici seguendo una linea mediana ventrale di lasciare un'apertura di circa 0.5-1 cm a livello del petto. Piegare la pelle sopra ogni lato del torace per esporre la cavità toracica.
7. Fare due più profondo 0,5-1 cm incisioni laterali attraverso il diaframma e la cassa toracica con lo stesso tipo di forbici per accedere dal mediastino superiore nella cavità toracica anteriore. Il timo dovrebbe apparire come due lobi pallidi proprio sopra il cuore.
8. Posto una serie di forcipe curvo sotto il timo e tirare verticalmente per estrarre l'organo completo. Prevenire il foldback della gabbia toracica con un paio di pinze. Se necessario, è possibile utilizzare una pinzetta per attentamente lacerare il tessuto connettivo che circonda l'organo senza interrompere la capsula prima di estrarre l'organo.
   Nota: Questo passaggio è facilitato utilizzando un ambito di dissezione.
9. Immergere il timo isolato in freddo sterile 1X PBS (pH 7.4) precedentemente visualizzata in un piatto sterile di 60 mm e tagliare l'istmo di tessuto connettivo con un bisturi per separare i lobi timici. Rimuovere eventuali detriti dal piatto senza danneggiare la capsula. Per minimizzare il tempo thymi sono esposti, tagliare i lobi di timo destra prima dell'impianto.
   Nota: Ogni isolato timo neonato renderà in genere sei segmenti di circa 1 mm di larghezza per un massimo di tre topi di host quando si ricevono gli impianti in entrambi gli occhi.
10. Ripetere i passaggi da 1.4-1.9 per ogni mouse di donatore. Per minimizzare il tempo thymi sono esposti, è necessario isolare uno timo alla volta.

2. Timo l'impianto nell'alloggiamento anteriore dell'occhio

1. Prima del trapianto, tag e pesare ogni destinatario mouse.
2. Utilizzare una dose compresa tra 1-2% dei vapori di surrenalectomia per anestetizzare il destinatario mouse. Garantire la corretta amputate dall'assenza di riflesso pizzico di punta seguenti prima di iniziare la procedura chirurgica.
3. Procedere con il trapianto di segmenti di timo come segue:
   1. Posizionare il mouse in posizione di decubito laterale lato così che un occhio è rivolto verso l'alto direttamente esposti alla lente dell'ambito per dissezione.
   2. Asportare uno dei lobi timici isolati che si trova nel freddo 1X PBS (pH 7.4)-riempita fino a 1 mm di larghezza per impianto piatto 60mm in pezzi. Seguono uno schema a zig-zag per garantire che ogni segmento contiene midollo e la corteccia timica. Utilizzare Allerød forbici per il taglio secondo le linee guida fornite in Figura 1A.
      Nota: Rimozione del timo dovrebbe essere fatto prima dell'impianto per ottimizzare l'attecchimento del tessuto.
   3. A partire della base della cornea corrispondente all'area chirurgica, introdurre la punta di un ago di 40mm G18 per praticare una piccola incisione in strati di cornea esterna in modo che la punta di forbici per dissezione può essere introdotto.
   4. Fare un 5-10 mm incisione direttamente intorno alla base della cornea con le forbici Allerød tenendo l'apertura di cornea saldamente per evitare una chiusura del fianco. Utilizzare pinze con estremità piatta per evitare danni ai tessuti.
   5. Afferrare l'epitelio cornea tagliato ed esporre l'apertura tenendo la cornea con un paio di pinze estremità piatta mentre spingendo un segmento timico attraverso l'apertura. Bagnare l'occhio con 1x sterile di PBS (pH 7.4) o lacrime artificiali per impedire il disseccamento del tessuto fino al completamento della manipolazione.
   6. Premere delicatamente sulla superficie dell'occhio per far scorrere il segmento di tessuto introdotto una posizione laterale rispetto alla pupilla di conservare la funzione data. Assicurarsi che l'innesto si trova in una posizione di fronte all'occhio apertura per evitare interferenze posteriore con formazione immagine di nonnismo.
   7. Con l'aiuto di pinze piatte, premere saldamente, per circa 3-5 s, i due lati dell'apertura cornea contro l'altro per promuovere autosigillante. La chirurgia non richiede alcun graffatura o cucito.
4. Se i trapianti vengono eseguiti su entrambi gli occhi, girare il mouse sopra il lato laterale opposto direttamente esporre il secondo occhio alla lente del microscopio per dissezione e ripetere i passi 2.3.2-2.3.7.
5. Una volta completata l'operazione, è possibile restituire il mouse a una gabbia vuota preriscaldata con una lampada di calore.
6. Assicurarsi che ogni mouse trapiantato riacquista la completa mobilità e coscienza prima di posizionarla in una gabbia che ha condivisa con gli altri animali. Questo di solito avviene entro 1 h dopo l'intervento chirurgico.
7. Al momento del trapianto, trattano i topi con antidolorifici come necessario e forniscono i topi con acetaminofene ad una concentrazione di 1,6 mg/mL in acqua potabile.
8. Ripetere i passaggi da 2.2-2.9 per ogni destinatario mouse.
9. Monitorare l'attività degli animali post-operatorio, nonché l'aspetto degli occhi impiantati per rilevare potenziali complicazioni di salute.

3. confocale Imaging di Thymi impiantato utilizzando 3D singolo fotone di fluorescenza confocale

1. Anestetizzare il destinatario mouse usando una dose compresa tra 1-2% dei vapori di surrenalectomia. Garantire la corretta amputate dall'assenza di riflesso pizzico di punta seguenti prima di iniziare la procedura di imaging
2. Posizionare il mouse su una piattaforma di microscopio palco fisso in posizione di decubito laterale lato in modo che un occhio è rivolto verso l'alto. Un pad termico è posto sulla piattaforma microscopio per garantire una temperatura corporea costante dei topi durante le registrazioni.
   Nota: Vedere complementare figura 1 per i dettagli.
3. Inserire la testa del mouse in un headholder stereotassiche e regolare la manopola per trattenere la testa del mouse su una posizione laterale che permette accesso diretto dell'obiettivo microscopio all'occhio che tiene l'innesto di timo.
4. Mettere il muso del mouse in una maschera antigas per tenere l'animale anestetizzato tutta procedura. Questo permette la regolazione dei vapori isofluorano come necessario.
5. Per facilitare la stabilizzazione dell'occhio durante le registrazioni, evitando la retrazione delle palpebre, tirare indietro le palpebre mentre si tiene l'occhio al margine cornea con un paio di pinzette che hanno loro suggerimenti coperti da un tubo di polietilene che sono fissate ad una UST-2 solido giunto universale. Questa disposizione permette una fissazione stabile della testa e degli occhi e fornisce la flessibilità senza interruzioni del flusso di sangue nell'occhio, come descritto in precedenza²².
   Nota: Figure complementari 1B, C mostrano l'assemblaggio completo.
6. Aggiungere poche gocce di lacrime artificiali o soluzione fisiologica sterile come il liquido di immersione tra la cornea e la lente, prima di mettere l'obiettivo del microscopio sull'occhio del mouse.
   Nota: ulteriori gocce sono dispensati necessità durante tutta la procedura per mantenere il percorso di microscopio e prevenire la secchezza degli occhi.
7. In primo luogo utilizzare lente di ingrandimento basso (5 X) per individuare il timo nel campo del microscopio. Quindi passare alla maggiore immersione in acqua ad alta risoluzione (10, 20 e 40 X) immersione obiettivi con lunga distanza di lavoro. Evitare LSM photodamage e lo sbiancamento dell'impianto timica applicando potenza laser minimale e ridurre il tempo di scansione per quanto possibile. Ciò si ottiene utilizzando lo scanner risonante del microscopio.
   Nota: Il microscopio confocale che usiamo è dotato di specchi scansione risonante in grado di raccogliere immagini 25 fotogrammi/s. Altre marche hanno i propri microscopi con scanner risonante.
8. Selezionare la modalità di acquisizione utilizzando il software di microscopio e avviare la modalità scanner risonante. Quindi scegliere la modalità di imaging XYZT e configurare le impostazioni di acquisizione come segue:
   1. Accendere il laser di Argon e regolare la potenza al 30% per l'eccitazione di fluorescenza.
   2. Scegliere una linea di laser di eccitazione e impostare il controllo splitter (AOBS) di fascio acusto-ottico per lunghezze d'onda di emissione differenti. Inoltre, per rilevare backscatter e delineare la struttura del tessuto, utilizzano il rilevamento di riflessione contemporaneamente.
      Nota: Selezionando un set di colori per l'eccitazione (GFP e RFP), il AOBS è programmato per indirizzare queste linee di eccitazione sul campione e trasmettere l'emissione tra di loro. Per esempio, per GFP e RFP, usiamo bande strette di riflessione per la luce di eccitazione circa 488 nm e 561 nm, rispettivamente. Questo lascia larghe bande per la raccolta dei fotoni di fluorescenza emessa, riducendo così la necessità di tempo di acquisizione e potenza del laser. In modalità di riflessione, il AOBS viene utilizzato come un divisore di fascio 50/50 per luce riflessa in qualsiasi lunghezza d'onda lontano da quelli usati per la rilevazione della fluorescenza emissione di immagine.
   3. Raccogliere l'emissione alla lunghezza d'onda selezionata, quindi selezionare una risoluzione di 512 × 512 pixel e avviare live imaging premendo il tasto Live , regolando i livelli di guadagno come necessario (guadagno tipico è intorno a 600 V).
   4. Definire l'inizio e la fine dello z-stack focalizzando l'attenzione sulla parte superiore dell'impianto timica e selezionare iniziare, quindi spostarsi all'ultimo piano che possa essere focalizzato nel timo impiantato e seleziona fine. Utilizzare una dimensione di z-passaggio di 5 µm. Il software calcolerà automaticamente il numero di aerei confocale.
   5. Scegliere l'intervallo di tempo per l'acquisizione di ogni z-stack (in genere 1,5-2 secondi) e selezionare l'opzione di acquisire deve essere interrotta per l'imaging di continuo.
9. Premere il tasto Start per inizializzare.
10. Gli innesti della battuta ripetutamente in momenti diversi dall'animale stesso ripetendo i passaggi 3.1-3.9.
    Nota: Se l'animale contiene innesti su entrambi gli occhi, le registrazioni da occhio possono essere assunto ripetendo i passaggi 3.2-3.9 dopo il passaggio il lato verticale della testa del mouse.

Risultati

Timo da topi neonati sono stati isolati da B6. CG-Tg(CAG-DsRed*MST) 1Nagy/Jas topi come descritto in questo protocollo (punti 1.1-1.9). In questi topi transgenici, il promotore di pollo beta actina dirige l'espressione della variante della proteina fluorescente rossa DsRed. MST sotto l'influenza del rinforzatore di inizio immediato del citomegalovirus (CMV) facilitando il monitoraggio degli impianti.

Per prevenire il ri...

Discussione

Dovuto l'importanza del processo di maturazione della T-cellula per competenza immunitaria individuale⁴ e il presunto impatto delle dinamiche delle cellule precursore su cellule T mature prodotte dal timo^2,3, notevoli sforzi sono stati investiti sviluppare alternative all'approccio classico tessuto fisso dello snapshot.

Anche se fettine di tessuto e altri espianti sono chiaramente superiori a riprodurre l'archit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluorane vaporizer w/isofluorane	Kent Scientific Corp	VetFlo-1215
Dissecting scope w/light source	Zeiss	Stemi 305
Fine dissection forceps	WPI	500455
Medium dissection forceps	WPI	501252
Curved tip fine dissection forceps	WPI	15917
Vannas scissors	WPI	503371
Dissecting scissors	WPI	503243
Scalpel	WPI	500353
40 mm 18G needles	BD	304622
Disposable transfer pipette	Thermofisher	201C
Heat pad and heat lamp	Kent Scientific Corp	Infrarred
Ethanol 70%	VWR	83,813,360
60 mm sterile dish	SIGMA	CLS430166
Sterile 1x PBS pH(7,4)	Thermofisher	10010023
Sterile wipes	Kimberly-Clark	LD004
Drugs for pain management	Sigma-Aldrich	A3035-1VL
Saline solution or Viscotears	Novartis	N/A
Stereomicroscope	Leica	MZ FLIII
Head-holding adapter	Narishige	SG-4N-S
Gas mask	Narishige	GM-4_S
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Laminar flow hood	Telstar	BIO IIA