Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول يوفر طريقة لإنشاء أنسنة الفئران (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) عن طريق حقن أحياناً من الخلايا الجذعية المكونة للدم البشري في الإشعاع مكيفة الولدان الفئران مجموعة موردي المواد النووية. الماوس هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية هو عرضه للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية والعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة) ويخدم كنموذج مناسب الفيزيولوجية المرضية للتحقيقات النسخ المتماثل وزمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية.

Abstract

القواعد الأخلاقية والتحديات التقنية للبحوث في علم الأمراض البشرية وعلم المناعة والتنمية العلاجية قد وضعت نماذج حيوانية صغيرة في ارتفاع الطلب. مع تشابه شديد الجينية والسلوكية للبشر، هي الحيوانات الصغيرة مثل الماوس مرشحا جيدا لنماذج الأمراض البشرية، يمكن من خلالها لخص أعراض شبيهة بالإنسان والردود. علاوة على ذلك، يمكن تغيير الخلفية الوراثية الماوس لاستيعاب المطالب المتنوعة. إيماءة/نظام/IL2rγ الماوسفارغة (مجموعة موردي المواد النووية) واحدة من سلالات الماوس المناعة الأكثر استخداماً؛ فإنه يسمح انجرافتمينت بالخلايا الجذعية المكونة للدم البشري و/أو الأنسجة البشرية والتطور اللاحق لنظام المناعة البشرية الفنية. وهذا معلما حاسما في فهم التشخيص والفيزيولوجيا المرضية للإنسان-خاصة بأمراض مثل فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز، ومساعدة في البحث عن علاج. هنا، نحن تقرير بروتوكول مفصل لتوليد نموذج ماوس أنسنة مجموعة موردي المواد النووية (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) بزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم في ماوس مجموعة موردي المواد النووية الولدان مكيفة الإشعاع. يظهر نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية تطوير نسب متعددة لزرع الخلايا الجذعية البشرية والقابلية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الفيروسية. كما أنه يلخص الخصائص البيولوجية الرئيسية استجابة للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة).

Introduction

لإنشاء نماذج حيوانية مناسبة للأمراض التي تصيب الإنسان هو المفتاح لإيجاد علاج، نماذج الحيوانات المناسبة منذ فترة طويلة تم متابعتها وتتحسن مع مرور الوقت. وقد وضعت سلالات متعددة من نماذج مورين المناعة التي تسمح انجرافتمينت من الخلايا البشرية و/أو الأنسجة واللاحقة تنفيذ مهام أنسنة1،2. مثل هذه النماذج الماوس أنسنة حاسمة بالنسبة للتحقيقات المتعلقة بالأمراض الخاصة بالإنسان3،،من45.

متلازمة نقص المناعة المكتسب (الإيدز) الناتجة عن الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) مثال واحد. قبل إنشاء نماذج الماوس أنسنة، تقتصر القيود الأخلاقية والتقنية فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز السريرية دراسات أجريت على الحيوانات أن المقدمات غير البشرية3. ومع ذلك، ارتفاع النفقات والاحتياجات للرعاية المتخصصة لمثل هذه الحيوانات تعيق الدراسات فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز في الإعدادات الأكاديمية النموذجية. فيروس نقص المناعة البشرية أساسا يصيب البشرية CD4 + T-الخلايا ويؤثر التنمية والاستجابات المناعية الخلايا المناعية البشرية الأخرى مثل الخلايا البائية، الضامة، والخلايا الجذعية6؛ ولذلك، نماذج حيوانية صغيرة زرعها مع نظم المناعة البشرية الفنية في ارتفاع الطلب.

وجاءت انطلاقة في عام 1988، عندما وضعت الفئران CB17-مشمولان بطفرة بركدكإخضاعها وأظهرت engraftment الناجح ل نظام المناعة البشرية1. نتائج الطفرات بركدكمشمولان في مهام خلية تي وب المعيبة ونظام المناعة تكيفية أبلاتيد في الفئران، مما يمكن انجرافتمينت من الأجهزة الطرفية البشرية الدم الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، و الأنسجة المكونة للدم الجنين7،8. ومع ذلك، كثيرا ما لوحظت مستويات منخفضة من انجرافتمينت في هذا النموذج؛ الأسباب المحتملة 1) المتبقية نشاط المناعة الفطرية التضمين عبر القاتل الطبيعية (ناغورني كاراباخ)-الخلايا و 2) تطوير المرحلة المتأخرة من الماوس وب-الخلايا التائية (يجتازها)5. التطور اللاحق لمرضى السكري غير البدناء (NOD)-مشمولان الماوس نموذج تحقق أسفل درامية-تنظيم نشاط ناغورني كاراباخ-الخلية؛ وهكذا، أنها قادرة على دعم مستوى أعلى وأكثر انجرافتمينت المستدام ل مكونات الجهاز المناعي البشري9. مواصلة قمع أو إعاقة التنمية للحصانة الفطرية، نماذج الماوس واضعة الاقتطاع أو خروج المغلوب مجموع interleukin-2 مستقبلات γ-سلسلة (Il2rg) في (الموافقة)--تم إنشاء خلفيةإخضاعها . Il2rg، γ سيتوكين-مستقبلات تعرف أيضا باسم المشترك-سلسلة، عنصر لا غنى عنه لمختلف سيتوكين مستقبلات10،11،،من1213. سلالات مثل انحناء. Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Wji (مجموعة موردي المواد النووية) و NODShi.Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Sug (وتد) يقدم قوي تعطيل الماوس سيتوكين إشارات والاجتثاث الكامل لوضع ناغورني كاراباخ-الخلية، في بالإضافة إلى إعاقة شديدة لمناعة التكيفية14،،من1516.

غالباً ما يلجأ ثلاثة نماذج الماوس أنسنة آخذا إخضاعها الطفرة و Il2rg بالضربة القاضية في أبحاث فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز: نموذج يستأجره (نخاع العظام/الكبد/الغدة الصعترية)، ونموذج PBL (من الكريات البيض الدموية الطرفية)، ونموذج SRC (الخلية إعادة إسكانها يكونوا مشمولان) 3. BLT نموذج يتم إنشاؤها عن طريق العمليات الجراحية زرع كبد الجنين البشري والغدة الصعترية تحت الكبسولة الكلي الماوس مصحوبا بالحقن الوريدي للجنين الكبد هسكس3،،من1718. يوفر الطراز الماوس يستأجره engraftment عالية الفعالية، التنمية البشرية الخلايا المكونة للدم في جميع الأنساب، وإنشاء نظام المناعة القوى البشرية؛ بالإضافة إلى ذلك، الخلايا التائية المتعلمات الغدة الصعترية ذاتي بشرية ويحمل المقيدة-هلا الاستجابات المناعية4،5،،من1719. ومع ذلك، يبقى الحاجة إلى العمليات الجراحية العيب الرئيسي من طراز BLT. هو إنشاء نموذج الماوس PBL عن طريق الحقن الوريدي مع الخلايا اللمفاوية الطرفية البشرية. نموذج PBL يوفر الراحة وغلة ناجحة تي خلية انجرافتمينت، ولكن تطبيقه محدودة بسبب غير كافية ب-الخلية و engraftment خلية النقوي، مستويات engraftment منخفضة عموما، وظهور أمراض شديدة في الفساد – مقابل – المضيف (GVHD)3 ،20. يتم تأسيس نموذج الماوس SRC من خلال ضخ هسكس البشرية في حديثي الولادة أو صغار البالغين مشمولان الفئران. معارض انجرافتمينت متوسط كفاءة أعلى من 25% (اعتبرت الدم المحيطي النسبة المئوية CD45)، ويدعم تطوير متعددة-النسب هسكس حقن ووضع نظام المناعة البشرية الفطرية. ومع ذلك، هو الحد الطراز SRC أن استجابة خلايا T الفأر المقيدة-H2 بدلاً من البشرية المقيدة-هلا14،21.

يعتبر الطراز الماوس SRC نموذج سهلة وموثوق بها السريري فيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز الصغيرة الدراسات الحيوانية، يتجلى engraftment يتسق نظام المناعة البشري والتنمية الناجحة المكونة للدم. ونحن سابقا ذكرت إنشاء نموذج ماوس "مجموعة موردي المواد النووية" هو جين تاو SRC إخضاعها (هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية) ووصف تطبيقه في النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية والكمون الدراسات22،،من2324. يسلك هذا الطراز الماوس هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية مستويات عالية من صاروخ موجه نخاع العظام، والقابلية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، وخلاصة للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية والمرضية. بالإضافة إلى ذلك، يستجيب على نحو ملائم للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية اندماجي (عربة) نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية ويجمل البلازما الارتداد الفيروسي عند سحب عربة، يؤكد إنشاء فيروس نقص المناعة البشرية الكمون الخزان25،26 ،27. هذا الخزان زمن انتقال فيروس نقص المناعة البشرية كذلك بأدلة إنتاج فيروس النسخ المتماثل المختصة الفيروسات السابقين فيفو الناجمة عن الإنسان يستريح CD4 + تي الخلايا المعزولة من الفئران المصابة والمعالجة بعربة هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية.

هنا، يمكننا وصف البروتوكول مفصلاً لإنشاء نموذج الفأر هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية من المواليد الفئران مجموعة موردي المواد النووية، بما في ذلك الإجراءات المتصلة بفيروس نقص المناعة البشرية العلاج العدوى وعربة للتنمية الكمون. ونحن نتوقع هذا البروتوكول لتقديم مجموعة جديدة من النهج في الدراسات الحيوانية فيروس نقص المناعة البشرية فيما يتعلق بفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات والكمون، والعلاج.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات ورعاية الحيوان وفقا لبروتوكولات استعرضت ووافقت على "رعاية الحيوان المؤسسية" بمدينة الأمل واستخدام اللجنة (IACUC) أجراها الباحث الرئيسي لهذه الدراسة (الدكتور جون روسي، 12034 # إياكوك). تم الحصول على أنسجة الكبد الأجنة البشرية من "الموارد المتقدمة في العلوم البيولوجية" (ألاميدا، كاليفورنيا)، منظمة غير ربحية، وفقا للوائح الاتحادية والولائية. المورد الخاصة به المجلس استعراض المؤسسية (IRB) وهي متوافقة مع متطلبات حماية البشرية من هذا الموضوع. ببمكس البشرية المعزولة من عينات الدم المحيطي المهملة من المانحين صحي مجهول "من الأمل الدم المانحة وسط المدينة" (دوارتي، كاليفورنيا)، مع تحديد لا فيما يتعلق بالعمر، أو العرق، أو الجنس، أو الأصل العرقي. الاتحاد الدولي للرجبى #/REF #: 97071/075546

1-العامة الممارسة العقيم

  1. القيام بتجارب زراعة الأنسجة في خزائن الاندفاق الصفحي المعينة.
  2. تبقى زراعة الأنسجة المتوسطة والمكملات الغذائية تحت ظروف معقمة والتصفية باستخدام 0.22 ميكرومتر ترشيح وحدة مسبقة لاستخدام.
  3. الحفاظ على استعداد هسكس البشرية في أنابيب معقمة والحفاظ على الجليد حتى الحقن.
  4. ونتيجة لنقص المناعة الشديدة، التعامل مع الفئران مجموعة موردي المواد النووية أسيبتيكالي. ارتداء ثوب عملية جراحية المتاح وكاب الشعر وقناع الوجه، وأغطية الأحذية وقفازات لمنع التلوث. تطهير المياه السطحية مقاعد البدلاء، حامل التشعيع، والدائرة التعريفي للتخدير مع التعقيم على أساس ثاني أكسيد الكلور (مثلاً، كليد) قبل وبعد تجارب.
  5. تطبيق مرهم العين النفطي بعد نزيف الرجعية-المداري لمنع جفاف العين.
  6. تغيير للمضادات الحيوية التي تحتوي على نظام غذائي للوقاية من العدوى بسبب النزيف الرجعية-المداري.

2-التعامل مع فيروس نقص المناعة البشرية، إصابة القوارض، وعينات الدم/الأنسجة التي تحتوي على فيروس

تحذير: فيروس نقص المناعة البشرية هو فئة 3 مسببات الأمراض بشرية؛ يجب أن يتبع قواعد التعامل مع الضبط.

  1. التعامل مع العينات المحتوية على الفيروس فيروس نقص المناعة البشرية في BSL2 معين + 3 مختبر الفضاء. تأمين الكواشف التي تحتوي على الفيروس بشكل أمن في حاوية ثانوية أثناء النقل. تطهير على السطح الخارجي لجميع الحاويات بمسح شامل مع التبييض 10% والكحول قبل النقل.
  2. إبقاء جميع النفايات التي تحتوي على الفيروسات في مكان مخصص حاويات النفايات مع الطبقات 2-3 أكياس النفايات اوتوكلاف. قبل التخلص من النفايات وتطهير بسخاء رش النفايات مع اﻷوتوكﻻف واليود/اثوكسيلاتيد ايثوكسيلات الحل (مثلاً، ويسكوديني).
  3. ارتداء معدات الوقاية الشخصية: غطاء الشعر وغطاء الوجه والوجه دفقة المضادة الدرع، ويغطي الحذاء، ثوب عملية جراحية المتاح وقفازات مزدوج الطبقة.
  4. معالجة القوارض المصابة بحذر شديد. إجراء الحقن ومجموعات الدم بينما الفئران تحت التخدير (الخطوات 5، 1-5-2، 6.3-6.5، 7.3، و 8، 8، 1-2).

3-عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم

  1. إعداد حل كولاجيناز/ديسباسي لهضم الأنسجة.
    1. حل مسحوق كولاجيناز/ديسباسي لجعل الحل الأسهم بتركيز 100 ملغ/مل، وتخزين حل الأسهم كولاجيناز/ديسباسي في 150 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية.
    2. للعمل على حل كولاجيناز، تمييع 150 ميليلتر من مخزون كولاجيناز/ديسباسي مع 15 مل من 1640 RPMI تستكمل مع السفح 10% و 1% البنسلين/ستربتوميسين.
      ملاحظة: تركيز النهائي كولاجيناز/ديسباسي لهضم الأنسجة 1 ملغ/مل.
  2. مع شفرة حلاقة عقيمة، قص الجنين أنسجة الكبد (16-24 أسبوعا من الحمل) إلى قطع صغيرة (حوالي 2-3 ملم3 في حجم) تليها الهضم مع الحل كولاجيناز/ديسباسي (1 ملغ/مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضبط حجم الصوت لحل الهضم حيث أن جميع قطع الأنسجة مغمورة تماما. استخدام نهاية الجزء الخلفي من المكبس حقنه بلطف طحن عينات الأنسجة لتسهيل عملية الهضم.
  3. يمر الخليط الهضم عامل تصفية شبكة نايلون عقيمة 70 ميكرومتر الحصول على تعليق خلية مفردة.
  4. إثراء ل CD34 + "هسكس" باستخدام نظام أجهزة ماكينتوش كل تعليمات الشركة المصنعة.
  5. حساب النسبة المئوية قابلة للاستمرار للتخصيب CD34 + "هسكس" استخدام هيماسيتوميتير28 والمضي قدما لحقن أحياناً في الأطفال حديثي الولادة مجموعة موردي المواد النووية الفئران.
  6. تجميد في المتبقية المخصب CD34 + "هسكس" في تجميد وسائل الإعلام (مثلاً، كريستر CS2) والحفاظ على الخلايا في خزان النتروجين سائل. عند استخدامها في المستقبل، اسرد نسبة المذابة CD34 + "هسكس" قبل حقن قابلة للحياة. مع استخدام تجميد وسائل الإعلام، البقاء بعد ذوبان الجليد بين 80 إلى 90%.

4-أحياناً حقن البشرية CD34 + هسكس في الفئران حديثي الولادة مجموعة موردي المواد النووية

ملاحظة: الفئران حديثي الولادة مجموعة موردي المواد النووية 2-3 أيام من الولادة والأكثر ملاءمة لهذا الإجراء، كما قوية بما يكفي لتحمل التشعيع عند الجرعة النصف مميتة، بينما الشباب ما يكفي تماما بضعف نظم المناعة. لا التخدير مطلوب لحقن HSC.

  1. مكان القمامة كله الولدان فئران مجموعة موردي المواد النووية (عادة 5-10 الفئران، كلا الجنسين) في قفص تشعيع عقيمة على شكل دائري وتعرض لجرعة إجمالية 200-250 كجي أشعة غاما الإشعاع من مصدر إشعاع سيزيوم-137. التأكد من أن جرعة الإشعاع داخل النطاق، كما فقدان وزن كبير أو حتى الموت يمكن أن يلاحظ عند الفئران مجموعة موردي المواد النووية يتعرضون لجرعات عالية من الإشعاع. 12
    ملاحظة: الإشعاع خطرا على صحة، ينبغي أن تؤخذ الحماية الشخصية ضد الإشعاع.
  2. وبعد التشعيع، حقن كل ماوس مجموعة موردي المواد النووية الولدان مع 5 × 105 قابلة للحياة البشرية CD34 + "هسكس" استخدام المحاقن/إبرة إعداد (الشكل 1). حقن الخلايا مباشرة في الكبد.

5-انجرافتمينت التحقق من الصحة من خلال نزيف الرجعية-المداري وتحليل التدفق الخلوي

  1. في الأسابيع 10-12 وظيفة HSC الحقن، تخدير الفئران باستخدام جهاز استنشاق isoflurane/الأوكسجين. ضبط تدفق الأكسجين للحفاظ على النسبة المئوية إيسوفلوراني 4-5%. التخدير يأخذ 3-5 دقائق، اعتماداً على الماوس الفردية. إظهار الفئران بشكل صحيح تخديره بطء ونمط التنفس العميق، وليس رد فعل على التحفيز معسر إصبع القدم.
  2. جمع 50-100 ميليلتر من الدم من كل الماوس عن طريق أخذ العينات الرجعية-المداري28. تخزين عينات الدم في K2EDTA أو أنابيب جمع الدم هيبارينيزيد لمنع تخثر الدم.
    ملاحظة: مطلوبة أنابيب جمع الدم إلى طلاء التخثر حتى يمكن أن يكون الماوس ببمكس المعزولة من الدم كله لتحليل التدفق الخلوي. من المعروف أن تثبط التفاعلات الانزيمية مثل PCR وقرت-بكر؛ يدتا وهكذا، إذا كانت التفاعلات الانزيمية المتلقين للمعلومات المطلوبة، استخدام جهاز جمع دم هيبارينيزيد.
  3. الطرد المركزي عينات الدم في 2,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية بيليه خلايا الدم.
    1. نقل supernatants البلازما لأنابيب ميكروسينتريفوجي جديدة بعد الطرد المركزي ومخزن في-80 درجة مئوية إذا كان التحليل سيتوكين المطلوبة.
    2. خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ضمن بيليه خلايا الدم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق باستخدام "المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء" (جدول المواد).
      ملاحظة: إذا كانت عينات البلازما غير مطلوب، مباشرة الدم كله مع تحلل الحل دون استخدام الطرد المركزي.
  4. بيليه خلايا الدم المتبقية بعد تحلل ربك في ز 300 x لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية؛ نضح المادة طافية. تغسل الكريات الخلية مع جيش صرب البوسنة 0.01 في المائة التي تحتوي على دببس، أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية ونضح المادة طافية. كرر الخطوة الغسيل مرة أخرى.
  5. كتلة الخلايا التي تحتوي على 100 ميليلتر من 1 × حجب كوكتيل (الجدول 3 للوصفة) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  6. وبعد تجميد، مباشرة إضافة كل حل جسم إلى تعليق الخلية بتركيز 2 ميليلتر/106 خلايا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الأجسام المضادة للتحقق من صحة انجرافتمينت: الإنسان المضادة CD45 (الكريات البيضاء، رريد: AB_2732068)، المضادة الإنسان CD3 (خلايا تي، رريد: AB_396896)، المضادة الإنسان CD4 (مساعد خلايا تي، رريد: AB_397037)، المضادة الإنسان CD8 (الخلايا التائية السامة للخلايا، رريد: AB_2722501)، المضادة الإنسان CD14 (وحيدات، رريد: AB_10373536)، والمضادة الإنسان CD19 (ب-الخلايا، رريد: AB_10373382). لتدفق اقترح الفريق، انظر الجدول 4 و الجدول للمواد أرقام النشرة المصورة، رريدس وأرقام الكثير.
    ملاحظة: تلطيخ جسم في عرقلة حل يزيل الربط غير محددة من الأجسام المضادة الإنسان تجاه علامات سطح الماوس، كعلامات السطح عدة حصة التماثل بين الإنسان والفأر.
  7. عزل ببمكس البشرية من المانحين صحية وإعداد الملطخة بمفرده تدفق عناصر التعويض الخلوي باستخدام المنقي البشرية ببمكس. وبدلاً من ذلك، استخدم الجزئي المجالات الخرز الصغير المسمى الأسفار كتعويض عناصر تحكم29.
  8. تحليل عينات الدم الطرفية استخدام cytometer تدفق، وقياس النسبة المئوية للخلايا البشرية CD45 + CD3 + الخلايا البشرية، CD14 + الخلايا البشرية وخلايا CD19 + الإنسان من مجموع خلايا الدم المحيطية.
    1. للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المتلقين للمعلومات والدراسات الكمون، حساب النسبة المئوية لخلايا CD4 + T-الخلايا و CD8 + تي-الخلايا داخل خلايا CD3 +.
      ملاحظة: بشكل عام، يلاحظ نسبة CD4:CD8 بين 1.5 و 2.5 قبل الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية30.

6-تحليل "فيروس نقص المناعة البشرية" من الفئران هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية والحمل الفيروسي البلازما باستخدام PCR قرت

  1. نشر "فيروس نقص المناعة البشرية بال" الأسهم الفيروسية في ببمكس البشرية من المانحين صحي، والحصاد في اليوم العاشر بعد الإصابة، وتيتراتي باستخدام p24 طقم أليسا31.
  2. حدد هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية الفئران مع أكثر من 20% CD45 البشرية + الخلايا في الدم المحيطي للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.
  3. تخدير الفئران هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية باستخدام جهاز استنشاق isoflurane/أكسجين (الخطوة 5، 1).
  4. بعد تأكيد تخديره من الحيوان، حقن فيروس "فيروس نقص المناعة البشرية بال" بجرعة 200 نانوغرام p24 كل الماوس من خلال الطريق داخل.
    ملاحظة: أن تكون حذراً للغاية مع الإبرة ولا إعادة استخدام الإبر، وتجاهل فورا بعد الاستخدام في مكان مخصص الحاويات الحادة. تطهير منطقة الحقن بعد إدارة الفيروس.
  5. ثلاثة أسابيع بعد الإصابة، تخدير الفئران هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية وجمع الدم المحيطية عن طريق الرجعية-المداري النزيف باستخدام هيبارينيزيد الأنابيب الشعرية وأنابيب جمع.
  6. منفصلة البلازما وخلايا الدم بالطرد المركزي في 2,000 س ز لمدة 20 دقيقة.
  7. كتلة كرات الدم الحمراء. والبقع المتبقية من خلايا الدم مع الأجسام المضادة لتحليل التدفق الخلوي (القسم 5.3-5.8).
    ملاحظة: ينبغي أن يركز تحليل التدفق الخلوي مقارنة نسبة CD4:CD8 قبل وبعد الإصابة. ومن المتوقع حدوث انخفاض كبير في عدد خلايا CD4 +، كخلايا CD4 مثابة مستضد مستقبلات المشارك لدخول الفيروسية.
  8. استخدام عينات البلازما لتحليل فيروس نقص المناعة البشرية الفيروسية تحميل باستخدام PCR قرة. عزل الحمض النووي الريبي الفيروسية من عينات البلازما باستخدام مجموعة مصغرة رنا فيروسي. إجراء PCR qRT مع الإشعال الخاصة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 لتر والمسبار مجموعات (تسلسل التفاصيل في الجدول 5)، باستخدام البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.

7-الفم من عربة و "التحقق من صحة من الفيروسية قمع" (اختياري)

ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية للتحقيقات فيما يتعلق بتشخيص فيروس نقص المناعة البشرية، وعلم الفيروسات، أو الفيزيولوجيا المرضية المتصلة بالعدوى خلال مرحلة الإصابة الحادة. ويستخدم للخص كمون الفيروس بين البشر المرضى الذين يتلقون عربة عربة العلاج للمصابين بفيروس نقص المناعة البشرية هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية. يتم إعطاء الفئران المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية بنجاح هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية عربة لمدة 4 أسابيع. نظام سلة تتكون من التنفوفير ديسوبروكسيل فيوماريت (TDF؛ 300 ملغ/كبسولة)، امتريسيتابيني (لجنة الممارسات التجارية المنصفة؛ 200 مغ/كبسولة)، ورالتيجرافير (راؤول؛ 400 مغ/كبسولة). يتم ضبط جرعة عربة لعلاج المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية هو جين تاو-مجموعة موردي المواد النووية الفئران وفقا لهيئة المساحة السطحية (الجدول 1، 1 المعادلة، الجدول 2)32.

  1. حساب مقدار كل الأدوية اللازمة لكل قفص خلال أسبوع واحد من العلاج، مع الأخذ بالاعتبار حجم زجاجة المياه، عدد الفئران في كل قفص، وكمية مياه يومية متوسط من 4 مل في الماوس.
    ملاحظة: النقطة الرئيسية في هذه الخطوة لضمان أن يكتسب كل الماوس الجرعة اليومية داخل 4 مل مياه الشرب.
  2. طحن جميع الأدوية الثلاثة بجرعات مضبوطة إلى مسحوق ناعم وحل الخليط مسحوق في المياه المحلاة (مثلاً، سورالوسي ميديدروب). تغيير زجاجة الماء كل أسبوع مع الكوكتيل الطازجة الذائبة عربة تم توفيرها في المياه المحلاة.
    ملاحظة: مسحوق المخدرات قد لا يذوب فورا، واهتز بشدة لتحقيق وقف متجانسة قبل العودة الزجاجة إلى القفص عقد.
  3. جمع عينات الدم المحيطي عبر الرجعية-المداري نزيف كل أسبوعين وتحليل كل CD4:CD8 نسبة استخدام التدفق الخلوي (القسم 5.3-5.8) والحمل الفيروسي البلازما qRT-بكر (6.6 الباب) باستخدام.
    ملاحظة: عادة بعد 4 أسابيع من العلاج، الحمل الفيروسي في بلازما يقلل إلى الحد الأدنى الكشف ويتم استعادة نسبة CD4:CD8 نموذجية.

8-التحقق من "الارتداد الفيروسي" عند عربة سحب (اختياري)

ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة في التحقق من صحة النموذج الكمون، كما الارتداد الفيروسي عند سحب عربة يوفر أدلة مباشرة من الخزان الكمون. من المستحسن أيضا أن تكون بمثابة تجربة التحكم للتحقيقات العلاجية على مثبطات انتعاش فيروس نقص المناعة البشرية.

  1. خطة لسحب عربة بعد البلازما الأحمال الفيروسية من عينات الدم المحيطي الحد الأدنى الكشف وأن نسبة CD4:CD8 لاستعادة مجموعة تتراوح بين 1.5 و 2.5.
  2. جمع عينات الدم المحيطية عن طريق الرجعية-المداري نزيف كل أسبوعين بعد انسحاب عربة. ترصد عن كثب التغير في الأحمال الفيروسية البلازما (القسم 6.6) فضلا عن نسبة CD4:CD8 (القسم 5.3-5.8).

النتائج

وكثيراً ما يتم تحليل التدفق الخلوي التحقق من صحة نقاء هسكس معزولة، وتقييم مستويات engraftment، الشخصية الاستجابات المناعية للعدوى الفيروسية، واستقصاء فعالية عربة. لوحة جسم نموذجي يحتوي على 4-6 أجسام المسمى فلوريسسينتلي الفردية؛ وهكذا، سيتوميتير تدفق مع الليزر متعددة وتشكيل?...

Discussion

الفئران المناعة انجرافتيد مع خلايا/الأنسجة البشرية موجودة الخصائص الفسيولوجية شبيهة بالإنسان وقيمة هائلة لدراسات علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية، وعلم المناعة بشأن الأمراض الخاصة بالإنسان. بين عدة سلالات من الفئران المناعة، الموافقة. Cg-بركدكإخضاعهاIl2rgtm1Wji النموذجي ...

Disclosures

المؤلفون بالكشف عن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

هذا العمل كان تدعمه معاهد الصحة الوطنية [منح الأرقام R01AI29329 و R01AI42552 و R01HL07470 J.J.R.] والمعهد الوطني للسرطان من "المعاهد الوطنية للصحة" [المنحة رقم P30CA033572 لدعم المدينة "علم الجينوم التكاملية في الأمل" ، الصيدلة التحليلية، والنوى الخلوي تحليلية]. وحصل الكاشف التالية عن طريق المعهد الوطني لبحوث الإيدز المعاهد الوطنية للصحة ومرجع برنامج كاشف، شعبة من الإيدز، نييد، الصحة: فيروس "ال فيروس نقص المناعة البشرية".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

References

  1. Greiner, D. L., Hesselton, R. A., Shultz, L. D. SCID mouse models of human stem cell engraftment. Stem cells. 16 (3), 166-177 (1998).
  2. Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature. 32 (4), 364-372 (2014).
  3. Walsh, N. C., et al. Humanized Mouse Models of Clinical Disease. Annual review of pathology. 12, 187-215 (2017).
  4. Shultz, L. D., Brehm, M. A., Garcia-Martinez, J. V., Greiner, D. L. Humanized mice for immune system investigation: progress, promise and challenges. Nature reviews. Immunology. 12 (11), 786-798 (2012).
  5. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature reviews. Immunology. 7, (2007).
  6. Moir, S., Fauci, A. S. B cells in HIV infection and disease. Nature reviews. Immunology. 9 (4), 235-245 (2009).
  7. McCune, J. M., et al. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  8. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335, 256 (1988).
  9. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. Journal of immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  10. Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87 (3), 956-967 (1996).
  11. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  12. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  13. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  14. Watanabe, Y., et al. The analysis of the functions of human B and T cells in humanized NOD/shi-scid/gammac(null) (NOG) mice (hu-HSC NOG mice). International immunology. 21 (7), 843-858 (2009).
  15. McDermott, S. P., Eppert, K., Lechman, E. R., Doedens, M., Dick, J. E. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  16. Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nature. 9 (7), 959-963 (2003).
  17. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature medicine. 12, 1316 (2006).
  18. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. -. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  19. Brehm, M. A., Bortell, R., Verma, M., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized Mice in Translational Immunology. Translational Immunology. , 285-326 (2016).
  20. King, M. A., et al. Hu-PBL-NOD-scid IL2rgnull mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host MHC. Clinical & Experimental Immunology. 157, 104-118 (2009).
  21. Halkias, J., et al. Conserved and divergent aspects of human T-cell development and migration in humanized mice. Immunology and cell biology. 93 (8), 716-726 (2015).
  22. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of virology. , (2018).
  23. Zhou, J., et al. Receptor-targeted aptamer-siRNA conjugate-directed transcriptional regulation of HIV-1. Theranostics. 8 (6), 1575-1590 (2018).
  24. Zhou, J., et al. Cell-specific RNA aptamer against human CCR5 specifically targets HIV-1 susceptible cells and inhibits HIV-1 infectivity. Chemistry & biology. 22 (3), 379-390 (2015).
  25. Brechtl, J. R., Breitbart, W., Galietta, M., Krivo, S., Rosenfeld, B. The use of highly active antiretroviral therapy (HAART) in patients with advanced HIV infection: impact on medical, palliative care, and quality of life outcomes. Journal of pain and symptom management. 21 (1), 41-51 (2001).
  26. Richman, D. D., Margolis, D. M., Delaney, M., Greene, W. C., Hazuda, D., Pomerantz, R. J. The Challenge of Finding a Cure for HIV Infection. Science. 323 (5919), 1304-1307 (2009).
  27. Pace, M. J., Agosto, L., Graf, E. H., O'Doherty, U. HIV reservoirs and latency models. Virology. 411 (2), 344-354 (2011).
  28. Van Herck, H., et al. Blood sampling from the retro-orbital plexus, the saphenous vein and the tail vein in rats: comparative effects on selected behavioural and blood variables. Laboratory animals. 35 (2), 131-139 (2001).
  29. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Evaluation of a 12-color flow cytometry panel to study lymphocyte, monocyte, and dendritic cell subsets in humans. Cytometry. 77 (5), 410-419 (2010).
  30. Lu, W., Mehraj, V., Vyboh, K., Cao, W., Li, T., Routy, J. -. P. CD4:CD8 ratio as a frontier marker for clinical outcome, immune dysfunction and viral reservoir size in virologically suppressed HIV-positive patients. Journal of the International AIDS Society. 18, 20052 (2015).
  31. van't Wout, A. B., Schuitemaker, H., Kootstra, N. A. Isolation and propagation of HIV-1 on peripheral blood mononuclear cells. Nature protocols. 3, 363 (2008).
  32. Reagan-Shaw, S., Nihal, M., Ahmad, N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 22 (3), 659-661 (2008).
  33. Han, Y., Wind-Rotolo, M., Yang, H. -. C., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. Experimental approaches to the study of HIV-1 latency. Nature reviews. Microbiology. 5 (2), 95-106 (2007).
  34. Marsden, M. D., et al. HIV Latency in the Humanized BLT Mouse. Journal of virology. 86 (1), 339-347 (2012).
  35. Karpel, M. E., Boutwell, C. L., Allen, T. M. BLT humanized mice as a small animal model of HIV infection. Current opinion in virology. 13, 75-80 (2015).
  36. Durand, C. M., Blankson, J. N., Siliciano, R. F. Developing strategies for HIV-1 eradication. Trends in immunology. 33 (11), 554-562 (2012).
  37. Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. HIV-1 transcription and latency: an update. Retrovirology. 10, 67 (2013).
  38. Xu, L., Zhang, Y., Luo, G., Li, Y. The roles of stem cell memory T cells in hematological malignancies. Journal of hematology & oncology. 8, 113 (2015).
  39. Chun, T. -. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  40. Redel, L., et al. HIV-1 regulation of latency in the monocyte-macrophage lineage and in CD4+ T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 87 (4), 575-588 (2010).
  41. Laird, G. M., et al. Rapid Quantification of the Latent Reservoir for HIV-1 Using a Viral Outgrowth Assay. PLoS pathogens. 9 (5), e1003398 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 HSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved