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要約

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV のレプリケーションおよび待ち時間の調査のための適切な病態生理学的モデルとして提供しています。

要約

倫理規程、人体病理学、免疫学および治療開発の研究のための技術的な課題は、需要が高い小動物モデルを配置しています。遺伝学的および行動に似ている人間、マウスなどの小動物が適しているヒト疾患モデル、人間のような症状や反応を要約することができます。さらに、マウスの遺伝的背景は多様化するニーズに合わせて変更できます。NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) マウスの最も広く使われている免疫不全マウス系統の 1 つです。ひと造血幹細胞や生体機能の人間の免疫システムの後続の開発と生着をことができます。これは予後と HIV/エイズなどヒト特有の疾患の病態の理解と治療のための検索を支援の重要なマイルス トーンです。症例は放射線エアコン新生児 NSG マウスに造血幹細胞移植によるヒトの NSG マウス モデル (胡 NSG) を生成するための詳細なプロトコルです。胡 NSG マウス モデルは、移植されたひと幹細胞の hiv-1 ウイルス感染に対する感受性多系統の開発を示しています。また、組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に応答キーの生物学的特性を繰り返します。

概要

人間の病気のための適切な動物モデルを確立する治療法を見つけるための鍵は、適切な動物モデル長い追求して時間をかけて改善します。人間の細胞や組織の生着とヒト化機能1,2の以降の実行を可能にする免疫不全モデルマウスの複数系統が開発されています。このようなヒト化マウス モデルはヒト特有の疾患3,4、5の調査のために重要です。

ひと免疫不全ウイルス (HIV) 感染症から生じる後天性免疫不全症候群 (エイズ) は、一例です。ヒト化マウスモデルの確立の前に倫理的、技術的な制限はヒト以外の霊長類3HIV/エイズ前臨床動物実験を限られています。しかし、高い費用とその動物について専門的ケアのための要件は、典型的な学術の設定で HIV/エイズ研究を妨げます。HIV は主に人間 cd 4 + T 細胞に感染して、開発と B 細胞、マクロファージ、樹状細胞6など他の人間の免疫細胞の免疫応答に影響を与えるしたがって、ひと免疫系機能を移植した小さな動物モデルは需要が高いです。

画期的なときPrkdcscid変異を有する CB17-scidマウスを開発され、人間の免疫システム1の成功の生着を示した、1988 年に来た。ひと末梢の生着が可能となる血単核球 (PBMCs)、造血幹細胞 (造血) の不良 T および B 細胞の機能にPrkdcscid突然変異の結果、マウスの蒸散の適応免疫系と胎児の造血組織7,8。それにもかかわらず、生着の低レベルは、このモデルで観察される頻繁原因が考えられます 1) 残留の生得免疫活性をモジュレート ナチュラル キラー (NK)-細胞とマウス T および B 細胞の (水漏れしたため)5の 2)、後期開発。非肥満の糖尿病 (NOD) の後続の開発-scidマウス モデルは NK 細胞活動の劇的なダウンを安定化を実現したがってより高いレベルと人間の免疫システムのコンポーネント9持続可能な生着以上をサポートすることです。さらを抑制したり、ベアリングの切り捨てや、インターロイキン 2 受容体 γ 鎖 (Il2rg) の総ノックアウト (NOD) マウス モデル自然免疫の開発を妨げる -scidのバック グラウンドが確立されました。Il2rg、として知られている一般的なサイトカイン受容体 γ 鎖は様々 なサイトカイン受容体10、11,12,13の不可欠なコンポーネントです。うなずくなどの系統。Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) と NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) マウス サイトカイン シグナルの堅牢な中断と NK 細胞の発達のアブレーションを完了適応免疫14,15,16の重度の機能障害を追加。

突然変異と Il2rg ノックアウトscidをベアリング 3 つのヒト化マウス モデルが頻繁に HIV/エイズの研究に採用: BLT (骨髄、肝臓、胸腺) モデル、PBL (末梢血白血球) モデル、および SRC (SCID 再セル) モデル3. 外科的移植ひと胎児肝と胎児肝臓造血3,17,18の静脈内注射に伴うマウスの腎被膜下胸腺を経由、BLT のモデルが作成されます。BLT マウス モデルを提供しています高い生着効果、すべての系統のひと造血細胞の開発と強い人間免疫システムの確立さらに、T 細胞はひと自家胸腺で教育されて、HLA 拘束による免疫応答4,5,17,19を展示します。ただし、外科的処置のための要件は、BLT モデルの主な欠点を残ります。PBL マウス モデルは、ひと末梢リンパ球細胞と静脈注射によって確立されます。そのアプリケーションが不十分な B 細胞と骨髄細胞、生着低レベルの全体的なと厳しい移植-対宿主病 (GVHD)3 の発症のため限定 PBL モデルを提供しています、正常の T 細胞生着が得られます ,20。SRC マウス モデルは、新生児や若い大人の SCID マウスに人間の HSCs の注入によって確立されます。それは (末梢血 CD45 割合として評価) 25% 以上平均生着効率を展示し、注入 HSCs の複数系統の開発と生来の人間の免疫システムの精緻化をサポートします。ただし、SRC モデルの制限は、人間 HLA 拘束14,21の代わりに H2 制限 T 細胞応答はマウスのことです。

SRC マウス モデルは、臨床の HIV/エイズ小動物研究、人間の免疫システムの開発に成功し造血一貫性のある移植に代表される安易な信頼性の高いモデルと見なされます。我々 は以前 NSG (胡 NSG) 胡-SRC-SCID マウス モデルの確立を報告し、HIV の複製および遅延研究22,23,24での応用を説明しました。この胡 NSG マウス モデルは、骨髄ホーミング、HIV 感染に感受性の高いレベルと HIV 感染と病原性の反復を発揮します。さらに、胡 NSG マウス モデルの組合せ抗レトロ ウイルス療法 (カート) に適切に応答して、HIV 待ち時間貯水池25,26 の確立を確認するカート撤退時にプラズマ ウイルス リバウンドを繰り返す ,27。この HIV 待ち時間貯水池さらに休んで cd 4 + T 細胞の感染とカート処理胡 NSG マウスから分離した人間によるレプリケーション有能な HIV ウイルスex vivoの生産によって実証されます。

ここで、HIV 感染症とカートの治療遅延開発に関連する手順を含む新生児の NSG マウスから胡 NSG マウスモデルの確立のための詳しいプロトコルについて述べる。HIV HIV ウイルス、遅延、および治療に関する動物実験でのアプローチの新しいセットを提供するこのプロトコルを見込んでいます。

プロトコル

すべての動物の世話と手順は、プロトコル レビューおよび承認によって、都市の希望施設動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) が保有する (博士ジョン ・ ロッシ、IACUC #12034) 本研究の主任研究員によると行われています。ひと胎児肝組織は非営利組織、連邦および州の規則に従って高度な生命科学リソース (アラメダ、カリフォルニア州) から得られました。ベンダー独自制度審査委員会 (IRB) があり被験者保護の要件に準拠しています。人間の PBMCs は年齢、人種、性別、または民族性に関する身分証なしで都市の希望血液ドナー センター (カリフォルニア州ドゥアルテ)、匿名健康なドナーから破棄された末梢血標本から分離されます。IRB #/REF #: 97071/075546

1. 無菌診療

  1. 指定された層流キャビネットの組織培養の実験を実行します。
  2. 組織培養培地、無菌条件下でサプリメントを維持し、0.22 μ m ろ過ユニット前を使用して、使用するフィルターします。
  3. 生殖不能の管に準備された人間の HSCs を保持し、注入まで氷の上を保ちます。
  4. 重度の免疫不全の結果として NSG マウスを無菌処理します。使い捨て手術ガウン、キャップ、マスク、靴カバー、汚染を防ぐために手袋を着用します。実験の前後にベンチ表面・照射ホルダー ・塩素基づく二酸化滅菌剤 (例えばClidox) と麻酔の誘導を商工会議所をサニタイズします。
  5. レトロな軌道は、目の乾燥を防ぐために出血後石油ベースの眼軟膏を適用します。
  6. 抗生物質を含む変更レトロ軌道出血による感染を防ぐための食事療法。

2. HIV ウイルス感染齧歯類およびウイルスを含む血液・組織サンプル

注意: HIV はクラス 3 のヒトの病原体;処理規則は正確に従う必要があります。

  1. 指定された BSL2 の HIV ウイルスを含んだサンプルを処理 + 3 実験スペース。輸送中にセカンダリ コンテナーで安全にウイルスを含む試薬をロックします。10% の漂白剤とイソプロパノール輸送前に徹底した拭くことによってすべてのコンテナーの外側の表面を消毒します。
  2. バイオハザード廃棄物バッグの 2-3 層の指定廃棄物コンテナーにすべてのウイルスを含んだ廃棄物をしてください。廃棄物の処理の前に寛大ヨウ素/エトキシ化ノニルフェノール ・ ソリューション (例えばWescodyne) とオートクレーブ廃棄物を噴霧して消毒します。
  3. 個人用保護具を着用: キャップ、フェイス カバー、反スプラッシュ顔面シールド、靴カバー、使い捨て手術ガウン、二重層手袋。
  4. 細心の注意で感染させた齧歯動物を扱います。マウスは麻酔 (手順 5.1 ・ 5.2 6.3 6.5、7.3 と 8.1 8.2)、注射、採血を実施します。

3. 造血幹細胞の分離

  1. コラゲナーゼ/当期ソリューションを組織の消化を準備します。
    1. 100 Mg/ml の濃度で原液をするコラゲナーゼ/当期粉末を溶解し、-20 ° C で 150 μ 因数でコラゲナーゼ/当期原液を保存
    2. コラゲナーゼの解決を使用するため 15 ml の 10% の FCS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 のコラゲナーゼ/当期株式の 150 μ L を希釈します。
      注: コラゲナーゼ/当期ティッシュの消化力のための最終濃度が 1 mg/mL です。
  2. 剃刀、胎児肝組織 (16 〜 24 週妊娠) 小さな断片 (約 2 〜 3 mm3サイズ) にコラゲナーゼ/当期ソリューション (1 mg/mL) を室温で 30 分間の消化順にカットします。すべての組織の部分が完全に水中に沈むので消化液の量を調整します。優しく消化を容易にするために組織サンプルを挽くにシリンジのプランジャーのバック エンドを使用します。
  3. 消化混合物を単一細胞懸濁液を取得する 70 μ m 滅菌ナイロン メッシュ フィルターを通過します。
  4. CD34 陽性造血 MAC システム製造元の指示を使用しての豊かにします。
  5. 濃縮 CD34 陽性造血計算盤28を使用しての現実的な割合をカウントし、新生児の NSG マウス肝内注入に進みます。
  6. 凍結、残り濃縮 CD34 陽性造血のメディア (例えば、CryoStor CS2) を凍結、液体窒素タンク内のセルを保持します。将来の使用、時に注入前に解凍の CD34 陽性造血の現実的な割合を集計します。凍結のメディアを使って、解凍後生存率は 80 〜 90% の間です。

4. 肝内新生児 NSG マウスにおけるヒト CD34 陽性造血注射

注: 新生児 NSG マウス誕生から 2-3 日は、この手順に最も適した彼らが十分な免疫システムに障害がある完全に十分な若いうちの半致死線量照射に耐える強い。麻酔は HSC 注射用必要ありません。

  1. 滅菌扇形照射ケージで新生児の NSG マウス (通常 5-10 マウス、両方の性別) の全体のごみを置き、200-250 cgy-ルンビア ガンマ放射線の総線量セシウム 137 線源から公開します。必ずその線量範囲内 NSG マウスが高線量照射にさらされているとき、有意な体重減少や死亡を観察できます。12
    注: 放射線は健康被害、放射線に対する個人の保護をすべきであります。
  2. 次の照射、5 x 10 の5各新生児 NSG マウスを注入可能な人間 CD34 陽性造血注射/針セットアップ (図 1) を使用して。細胞を肝臓に直接注入します。

5 レトロな軌道出血とフローサイトメトリー解析の検証によって生着

  1. 10-12 週間ポスト HSC 入射時イソフルラン/酸素吸入装置を用いたマウスを麻酔します。4-5% にイソフルラン割合を維持するために酸素の流れを調整します。麻酔は、個々 のマウスによって、3-5 分かかります。ゆっくりと深い呼吸パターンとつま先をつまんで刺激に反応がない正しく麻酔下マウスを表示します。
  2. レトロな軌道サンプリング28を通して、それぞれのマウスの末梢血の 50-100 μ L を収集します。凝固を防ぐために K2EDTA またはヘパリン採血管に血液サンプルを格納します。
    注: 採血管、マウス PBMCs をフローサイトメトリー解析のため全血から分離できるので、抗凝固剤のコーティングを持っている必要があります。EDTA は PCR など; qRT PCR 酵素反応を阻害するため知られています。したがって、下流の酵素反応は、必要がある場合は、ヘパリン加血液コレクション装置を使用します。
  3. 血液細胞のペレットへの 4 ° C で 20 分間 2,000 x g で血液サンプルを遠心します。
    1. サイトカイン解析が必要な場合、プラズマの培養上清を遠心分離、-80 ° c ストア後新しいマイクロ遠心チューブ用に転送します。
    2. 赤血球細胞の換散バッファー (資材表) を使用して 10 分間室温で血液細胞ペレット内赤い血球 (赤血球) を溶解させます。
      注: 血漿が必要ない場合直接遠心分離せず溶解溶液で全血を溶解します。
  4. 4 ° C で 5 分間 300 x g で赤血球溶解後残りの血液細胞のペレットします。上清を吸引します。DPBS、4 ° C で 5 分間 300 × g で遠心分離を含む 0.01 %bsa を用いた細胞ペレットを洗浄し、上清を吸引します。洗浄工程をあと 1 回繰り返します。
  5. 100 μ L で 1 x ブロックのカクテル (レシピ表 3 ) 4 ° C で 20 分間ブロックのセル
  6. ブロック後、直接 2 μ L/106セルの濃度で細胞懸濁液に各抗体溶液を追加し、4 ° C で 30 分間インキュベートします。生着の検証のための抗体: 抗ひと CD45 (白血球、RRID: AB_2732068)、抗ひと CD3 (T 細胞、RRID: AB_396896)、抗ひと CD4 (ヘルパー T 細胞、RRID: AB_397037)、抗ひと CD8 (細胞毒素の T 細胞、RRID: AB_2722501)、抗ひと CD14(単球、RRID: AB_10373536) と反人間 CD19 (B 細胞、RRID: AB_10373382)。フロー提案パネル参照してください表 4と表の材料のカタログ数値、RRIDs およびロット番号。
    注: 抗体染色ソリューションをブロック マウス表面マーカーに向かって抗ひと抗体の非特異的結合を排除、人間間の相同を共有いくつかの表面マーカーとして、マウスします。
  7. 健康なドナーから人間の PBMCs を分離、準備の流れの単一染色使用して浄化された人間 PBMCs。 またフローサイトメトリー補正コントロール補正コントロール29として微粒子の蛍光標識を使用します。
  8. フローサイト末梢血サンプルを分析して総末梢血細胞から細胞 cd19、CD14 + 細胞、細胞 CD3 + ヒト CD45 陽性細胞の割合を定量化します。
    1. 下流の HIV 感染と待機時間の研究は、cd 4 + T 細胞と cd 8 + T 細胞 CD3 陽性細胞内の割合を計算します。
      注: 一般的に、1.5 と 2.5 間の CD4:CD8 比率は、HIV 感染30前に観察されます。

6. 胡 NSG マウスおよび qRT PCR を用いたプラズマ ウイルス量の HIV 感染の解析

  1. 健康なドナーから人間の PBMCs の HIV バル ウイルス株を伝達、感染、10 日後に収穫し、滴定しなさい p24 を用いた ELISA キット31。
  2. 20% 以上選択胡 NSG マウス ヒト CD45 + HIV 感染症の末梢血細胞します。
  3. イソフルラン/酸素吸入装置 (ステップ 5.1) を用いた胡 NSG マウスを麻酔します。
  4. 動物は麻酔を確認後 200 の用量でバル HIV ウイルスを注入マウス腹腔内ルートを通じてあたり p24 の ng。
    注: する非常に慎重に針、針を再使用していない指定されたシャープな容器に使用後に直ちに破棄。ウイルス投与後注射部を消毒します。
  5. 3 週間後感染、胡 NSG マウスを麻酔し、レトロな軌道を通って末梢血液を収集キャピラリー チューブ、採血管にヘパリンを使用して出血します。
  6. 別のプラズマと 2,000 x g で 20 分間遠心分離によって血液細胞。
  7. 赤血球ブロックを溶解し、フローサイトメトリー解析 (セクション 5.3 5.8) のための抗体を持つ残りの血液細胞を染色します。
    注: フローサイトメトリー解析前に、と感染後の CD4:CD8 比を比較するのに焦点を当てる必要があります。Cd4 細胞数の有意な減少が予想される、として CD4 抗原はウイルス エントリの共受容体として機能します。
  8. HIV ウイルスを分析する使用血漿検体は、qRT PCR を使用して読み込みます。ウイルス RNA ミニ キットを使用して血漿サンプルからウイルスの RNA を分離します。HIV 1 LTR 特異プライマーを qRT PCR を行い、プローブ セット (表 5にシーケンスの詳細)、製造元のプロトコルを使用しています。

7. カートと検証のウイルスの抑制 (オプション) の内服

注: この手順は急性感染期感染症関連病態やウイルス、HIV の予後に関する調査のオプションです。カート人間患者 HIV 待ち時間を要約する HIV 感染した胡 NSG のカート処理が使用されます。正常に HIV 感染した胡 NSG マウスは、4 週間のカートを与えられます。カートの養生法は、テノホビル テノホビルジソプロキシル フマル酸 (TDF; 300 mg/カプセル) (公正取引委員会; 200 mg/カプセル)、エムトリシタビンとラルテグラビル (RAL; 400 mg/カプセル) で構成されます。胡-NSG の HIV に感染したマウスを治療するためのカートの線量は、体の表面積 (表 1,式 1,表 2)32に応じて調整されます。

  1. 水のボトル、各ケージ内マウスの数およびマウスあたり 4 mL の平均毎日の飲水量を考慮した、治療の 1 つの週の間に各ケージに必要なそれぞれの薬の量を計算します。
    注: この手順で重要な点は、それぞれのマウスが飲料水の 4 mL 内の毎日の線量を取得ことです。
  2. 細かい粉末状に調整した用量ですべての 3 つの薬を挽くし、甘くされた水 (例えば、 Medidrop Suralose) の混合粉末を溶解します。新鮮な溶存カート カクテル甘くされた水の供給と毎週の水のボトルを変更します。
    注: 薬物粉末があります、ないすぐに解散、持株ケージにボトルを返す前に均質な懸濁液を達成するために積極的に振る。
  3. レトロ軌道出血 2 週間ごとで末梢血サンプルを収集し、フローサイトメトリー (セクション 5.3 5.8) と qRT PCR (セクション 6.6) を用いたプラズマ ウイルス負荷を用いた CD4:CD8 比の両方について分析します。
    注: 通常治療の 4 週間後プラズマ ウイルス量低下を検出限界値以下、典型的な CD4:CD8 比を復元します。

8. カート (オプション) 撤退時にウイルスのリバウンドの検証

注: この手順は、カート回収時にウイルスのリバウンド待機時間貯留層の直接証拠を提供するので遅延モデルを検証する際に重要です。また、HIV リバウンド抑制剤の治療上の調査のための制御実験として使用することをお勧めします。

  1. プラズマ末梢血液サンプルからのウイルス量が検出限界以下と CD4:CD8 比が 1.5 から 2.5 までの範囲に復元後、カート回収を計画します。
  2. レトロな軌道カート回収後 2 週間ごとの出血を末梢血サンプルを収集します。密接に CD4:CD8 比 (セクション 5.3 5.8) だけでなく、プラズマ ウイルス負荷 (セクション 6.6) の変更を監視します。

結果

フローサイトメトリー解析はよく分離 HSCs の純度を検証、生着レベル、ウイルス感染に対する免疫応答をプロファイルを評価およびカートの有効性を調査する実行されます。典型的な抗体パネルを含む 4 6 個々 の蛍光に分類された抗体;したがって、複数レーザーと豊富なフィルターを持つ流れの cytometer は正確な結果を達成するために不可欠です。

ディスカッション

免疫不全マウスと人間の細胞や組織にしみ込んで人間のような生理学的な特性を提示で、人間特有の病に関する病理、病態生理、免疫学の研究の非常に大きな値です。免疫不全マウス、NOD の複数系統。Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) モデルは蒸散マウス固有サイトカイン シグナル3,12,19 と同様に、自然免疫と?...

開示事項

著者は利益相反を開示ないです。

謝辞

この作業は、[R01AI29329、R01AI42552、R01HL07470 の数字を J.J.R. に付与] 健康の国民の協会および健康の国民の協会 [許可番号希望統合的ゲノミクスの都市をサポートする P30CA033572 国立がん研究所によって支えられました。、薬効解析と解析的フローサイトメトリー コア]。次の試薬は、NIH のエイズ研究と参照試薬プログラム、エイズ部門 NIAID、nih の研究を通じて得られた: HIV バル ウイルス。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Order breeders instead of experimental mice
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Order through animal facility, restricted item
Clidox disinfectantFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 syringe/needleHamilton80508Custom made
Blood collection tube (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blood collection tube (Heparin)BD Bioscience365965
Capillary tube (Heparinized)Fisher Sicentific22-362574
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA mini kitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG from human serumSigma AldrichI4506-100MG
IgG from mouse serumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Mouse Anti-Human CD45 (clone HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD3 (Clone SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Clone RPA-T4)BD Biosciences558116RRID: AB_397037, LOT 6224744
BUV395 Mouse Anti-Human CD8 (Clone RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Mouse Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Mouse Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

参考文献

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